本發(fā)明涉及對照標(biāo)記物用于實(shí)施在斑點(diǎn)上的分析方法的用途，尤其是在多重分析的情況下。本發(fā)明因此涉及含有所述對照標(biāo)記物的固體支持體、它們的制備方法和它們在分析方法中的用途。本發(fā)明使得可以在分析方法結(jié)束時校驗(yàn)斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性，并因此確保所得的結(jié)果，同時保證得到的結(jié)果的確是來自存在的、完好的且局域化的斑點(diǎn)的結(jié)果。

發(fā)明背景

多重分析方法允許同時檢測在同一樣品中的若干種被分析物的潛在存在。典型地使用包含斑點(diǎn)的固體支持體，例如在每個孔里包含斑點(diǎn)的微量培養(yǎng)板(microplate)，來實(shí)施多重分析方法，所述斑點(diǎn)各自意在檢測被分析物或充當(dāng)對照。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，一個與斑點(diǎn)技術(shù)有關(guān)的風(fēng)險是，在用于固體支持體(尤其是微量培養(yǎng)板)的制備方法期間或者在使用所述固體支持體實(shí)施分析方法期間沒有沉積物，若干斑點(diǎn)消失或劣化。用于沉積樣品或試劑的裝置可能的確偶然地與一個或若干個斑點(diǎn)接觸，從而改變它們的表面，例如通過形成在一個或若干個斑點(diǎn)中的條痕，或者通過拔出一個以上斑點(diǎn)的全部或部分。

例如，在Bastarache等的論文(多重免疫化驗(yàn)平臺的精確性和可重現(xiàn)性：確認(rèn)報告(Accuracy and Reproducibility of a multiplex Immunoassay platform：a validation study)，J.Immunol Methods，Mar 31，2011，367(1-2)33-39)中，存在在測試結(jié)束時在光信號上觀察到的缺陷，如斑點(diǎn)不規(guī)則、導(dǎo)致一個斑點(diǎn)被相鄰的斑點(diǎn)污染的叢毛(comas)的存在、以及在斑點(diǎn)的理論位置沒有預(yù)期的信號。

而且，當(dāng)在分析方法結(jié)束時導(dǎo)致陰性結(jié)果時，此結(jié)果必須是由于在樣品中沒有待檢測的被分析物造成的結(jié)果，而不是由于相應(yīng)的被分析物的檢測斑點(diǎn)不存在或劣化造成的結(jié)果。分析方法的確保是至關(guān)重要的，尤其是對于它們在人類的診斷中的用途，例如校驗(yàn)用于輸血目的的血液樣品沒有病毒或細(xì)菌污染。

用于斑點(diǎn)分析的固體支持體的制造由以下過程組成：在固體支持體的表面上沉積包含待檢測的被分析物的捕捉配體的溶液，從而形成斑點(diǎn)。接下來在固體支持體的制造結(jié)束時校驗(yàn)固體支持體的品質(zhì)，從而僅僅保留具有完好的且良好形成的斑點(diǎn)的固體支持體。

因此，文獻(xiàn)US2006/0063197描述了在意在形成DNA微陣列的斑點(diǎn)的沉積溶液中熒光團(tuán)的使用。熒光團(tuán)用于在用于DNA微陣列的制備方法結(jié)束時校驗(yàn)各個斑點(diǎn)的品質(zhì)。此外，在ELISA試驗(yàn)的實(shí)施期間，在添加底物之前，僅僅在斑點(diǎn)處檢測到弱的參與熒光信號。

文獻(xiàn)WO2012/142397研究了在包含DNA微陣列的微流體設(shè)備中的通量問題，并且描述了包含陣列倉的DNA微陣列組裝體，所述陣列倉具有在第一端處的用于樣品的入口、DNA微陣列和在連接到廢物倉的第二端處的用于樣品的出口，對于陣列倉的第一端橫斷的面積比在第二端的橫斷面積寬。此文獻(xiàn)也描述了用于校驗(yàn)DNA微陣列的制造品質(zhì)的方法，包括測量由在斑點(diǎn)處的內(nèi)部品質(zhì)對照熒光團(tuán)發(fā)射的熒光并且將關(guān)于陣列的每個斑點(diǎn)的信息以條碼、記憶裝置或通過射頻識別來編碼，此信息因此被與DNA微陣列相關(guān)聯(lián)地編碼。

此外，在多重分析方法的實(shí)施期間，可以在理論讀取柵格(reading grid)處檢測對應(yīng)于待檢測的被分析物的信號。通常，在多重分析方法結(jié)束時，從在充當(dāng)陽性對照的斑點(diǎn)處檢測的信號，限定此理論讀取柵格。然而，根據(jù)讀取尺度，在固體支持體制造期間斑點(diǎn)的定位中和/或在用于檢測信號的裝置中的固體支持體的定位中相對于理論讀取柵格的任何移位都導(dǎo)致斑點(diǎn)的實(shí)際位置相對于理論讀取柵格的移位，并且因此影響被分析物的檢測靈敏度。

因此，對于確保，尤其是通過使得可以在分析方法結(jié)束時校驗(yàn)斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性，和/或通過使得可以優(yōu)化被分析物的檢測(例如通過改善被分析物的檢測靈敏度)來確保在斑點(diǎn)上的分析方法結(jié)束時獲得的結(jié)果的方案，仍然存在需要。

發(fā)明詳述

本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)對照標(biāo)記物，所述對照標(biāo)記物可以與樣品中的待檢測的被分析物的特異性捕捉配體同時沉積形成在固體支持體上的斑點(diǎn)，這些對照標(biāo)記物能夠在使用所述固體支持體實(shí)施的分析方法結(jié)束時產(chǎn)生信號，很小地干擾或根本不干擾被分析物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的對照標(biāo)記物因此使得可以在分析方法結(jié)束時校驗(yàn)斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性。這些對照標(biāo)記物在此被認(rèn)定為“耐受性對照標(biāo)記物”。

表述“分析方法”和“用于檢測至少一種被分析物的方法”在此是同義的。

術(shù)語“產(chǎn)生”、“產(chǎn)物”或“制備”用于任何形式的信號，并且尤其是任何形式的電磁輻射，不管它涉及放射性的信號、光發(fā)射或是吸光度。

當(dāng)檢測的信號是熒光發(fā)光信號時，“產(chǎn)生的信號”尤其是“發(fā)射的信號”，且“產(chǎn)生信號”和“信號的產(chǎn)生”則分別意指“發(fā)射信號”和“信號的發(fā)射”。

在本申請中，“至少一種被分析物的檢測”(或“檢測至少一種被分析物”)意指一種或多種所述被分析物的存在的檢測(或檢測其存在)，和/或一種或多種所述被分析物的量的檢測(或?qū)ζ淞炕?。

在本發(fā)明的意義內(nèi)，“分析方法結(jié)束”意指在已經(jīng)在以下物質(zhì)的存在下安放斑點(diǎn)之后，待分析的樣品、配體或用于檢測被分析物的配體、如果可用的話與被分析物的檢測配體偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物的至少一種(第一)報道物、和如果可用的話與所述第一報道物偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物的至少一種(第二)報道物。

出人意料地，發(fā)明人已經(jīng)因此顯示了耐受性對照標(biāo)記物，其可以被固定在固體支持體上，不干擾分析方法本身，并且在實(shí)施了分析方法的不同步驟之后保持完全可檢測(尤其是因?yàn)樗鼈儽３种辽俨糠值乇还潭ㄔ诠腆w支持體上)。當(dāng)在分析方法結(jié)束時由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號使得可以限定滿足斑點(diǎn)的品質(zhì)判據(jù)(尤其是存在、位置和/或完整性)的斑點(diǎn)時，則可以在此斑點(diǎn)檢測對應(yīng)于被分析物的信號。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物可以用于以下分析方法中：其中通過由化學(xué)發(fā)光(優(yōu)選經(jīng)由過氧物酶與魯米諾底物和/或魯米諾的類似物(例如異魯米諾)和/或它們的衍生物之一的反應(yīng))發(fā)射的信號，檢測至少一種被分析物的存在。

根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物具有以下優(yōu)點(diǎn)：使得可以在分析方法結(jié)束時，且不僅在所述固體支持體的制備方法結(jié)束時，對固體支持體的斑點(diǎn)進(jìn)行對照。

因此，本發(fā)明使得可以向使用者保證結(jié)果。尤其是，本發(fā)明使得可以保證陰性結(jié)果的確是由于在樣品中沒有被分析物造成的結(jié)果，而不是例如由于沒有斑點(diǎn)或斑點(diǎn)的讀取中的移位造成的結(jié)果。換言之，本發(fā)明使得可以消除與斑點(diǎn)的缺陷(即，不符合品質(zhì)判據(jù)的斑點(diǎn))有關(guān)的和/或與分析方法結(jié)束時斑點(diǎn)的讀取缺陷有關(guān)的假陰性結(jié)果(也稱作“假陰性”)，所述假陰性結(jié)果在傳統(tǒng)使用的多重分析方法(其中例如基于由陽性對照斑點(diǎn)發(fā)射的信號理論地調(diào)節(jié)讀取柵格)中不可檢測。本發(fā)明也使得可以保證陽性結(jié)果的確是由于在樣品中存在被分析物造成的結(jié)果。例如，對應(yīng)于在斑點(diǎn)的理論位置(由理論讀取柵格限定，例如，基于由對照斑點(diǎn)發(fā)射的信號受到調(diào)節(jié))上的被分析物的標(biāo)記物，可能檢測到信號，而在那個位置沒有斑點(diǎn)；這樣的假陽性結(jié)果(也稱作“假陽性”)則會在傳統(tǒng)分析方法的實(shí)施期間發(fā)生；通過在固體支持體的斑點(diǎn)中使用根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，在斑點(diǎn)的理論位置將檢測不到對應(yīng)于所述耐受性對照標(biāo)記物的信號，并且分析方法將導(dǎo)致沒有造成結(jié)果，即使是在那個位置檢測到了對應(yīng)于被分析物的標(biāo)記物的信號。

本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)在于，實(shí)際上，耐受性對照標(biāo)記物使得可以在分析方法結(jié)束時限定讀取柵格。而在根據(jù)固體支持體的物理參數(shù)限定的理論讀取柵格和在使用所述固體支持體的分析方法結(jié)束時限定的讀取柵格之間可能有差異。這些差異可能是例如預(yù)期的理論斑點(diǎn)柵格與在分析方法結(jié)束時實(shí)際獲得的柵格(一個或若干個斑點(diǎn))之間的移位造成的結(jié)果；因此這些移位通過在本申請中描述的裝置修正。因此，更可靠的是，在分析方法結(jié)束時，優(yōu)選利用與用于檢測由被分析物的至少一種檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的檢測裝置相同的檢測裝置，并且優(yōu)選伴隨地，限定固體支持體的讀取柵格。因此，由于用于檢測被分析物的讀取柵格的限定來自在分析方法結(jié)束時檢測到的斑點(diǎn)的位置，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物也使得可以通過改善被分析物檢測的靈敏度，確保在斑點(diǎn)上的分析方法的結(jié)果。

最后，其中斑點(diǎn)包含根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物的固體支持體的制備容易進(jìn)行，并且不增加任何附加的步驟，耐受性對照標(biāo)記物例如能夠與感興趣的化合物如捕捉配體簡單地混合在要沉積形成斑點(diǎn)的溶液中。

本發(fā)明尤其涉及一種用于確保在樣品中的至少一種被分析物的檢測的固體支持體，其中意在檢測被分析物的至少一個斑點(diǎn)包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和被分析物的至少一種捕捉配體，涉及一種用于制備這樣的固體支持體的方法，并且涉及一種使用所述固體支持體的用于至少一個樣品中的至少一種被分析物的安全檢測方法。

“至少一”在本申請的含義內(nèi)指的是一或若干，若干尤其意味著二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或多于十五。類似地，在本申請中，“至少”意味著x或多于x，并且尤其是x+1、x+2、x+3、x+4等，“x”是大于或等于2的整數(shù)，例如2或3。

一種特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的分析方法是多重分析方法。

本發(fā)明也涉及用于選擇耐受性對照標(biāo)記物的方法，以及至少一種耐受性對照標(biāo)記物在意在檢測被分析物的至少一個斑點(diǎn)中用于確保用于檢測在樣品中的至少一種被分析物的方法的用途。

本發(fā)明也提供合適的裝置，用于改善的在樣品中的至少一種被分析物的檢測。

樣品

待分析的樣品優(yōu)選是生物樣品。

生物樣品可以是生物流體，如血液、血液衍生物(如血漿或血清)、尿液、腦脊髓液、唾液、或它們的組合，或組織樣品，如由活組織檢查獲得的組織、細(xì)胞、細(xì)胞組、植物提取物，或它們的組合。

血液衍生物指的是任何從血液樣品獲得的產(chǎn)物，尤其是流體。

待分析的樣品也可以是培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)物上清液。

在被分析之前，樣品可以經(jīng)歷一個或若干個前處理步驟，如稀釋、離心、熱處理、細(xì)胞溶解、增溶和改性(例如通過一種或若干種離液劑、一種或若干種還原劑和/或通過加熱)、萃取、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、添加未被標(biāo)記的檢測配體、或它們的組合。對于執(zhí)行中和試驗(yàn)來說，添加未被標(biāo)記的檢測配體尤其有用。

樣品也可以是至少兩種樣品的混合物，所述樣品可以是相同性質(zhì)或不同性質(zhì)的。

不同性質(zhì)的樣品的混合物的實(shí)例是血漿和尿液的混合物、血液和血漿的混合物、血清和血漿的混合物、或血液、血清和血漿的混合物。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的樣品是血液和/或血液衍生物(尤其是血漿和/或血清)的樣品或樣品混合物。

被分析物

在樣品中待檢測的被分析物可以是人們希望在樣品中檢測和/或量化的任何類型的天然的或合成的化合物。

被分析物可以是例如蛋白、肽、糖蛋白、碳水化合物、細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒或核酸。

細(xì)胞可以是動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、原生動物、后生動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。

核酸指代通過磷酸二酯鍵連接的核苷的聚合物，如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或它們的類似物，如硫代膦酸酯或硫代酯，以單鏈或雙鏈的形式。

被分析物或多種被分析物的至少一種因此例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗原、抗體、抗體片段、半抗原、激素、激素受體、酶或核酸。

一種或多種被分析物優(yōu)選選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗原、抗體、抗體片段、半抗原、激素、激素受體和酶。

在本申請的含義內(nèi)，“抗原”指的是天然的、重組的或合成的分子，其被免疫系統(tǒng)的抗體或細(xì)胞所識別并且當(dāng)它在對宿主的免疫系統(tǒng)合適的條件下存在時能夠引起免疫應(yīng)答。

抗原可以是分子，尤其是多肽，包括或由以下構(gòu)成：至少一個可以是線性或構(gòu)象的表位。術(shù)語“線性表位”指的是能夠結(jié)合至針對所述抗原的抗體分子的多肽，尤其是包含或由以下構(gòu)成的肽：3至15個氨基酸、更通常5至15個氨基酸，優(yōu)選至少6、8、10或12個氨基酸。術(shù)語“構(gòu)象表位”指的是被抗體所識別并且由空間中的若干氨基酸的并列所決定的三維結(jié)構(gòu)，所述若干氨基酸在此抗體所針對的蛋白質(zhì)的肽序列(或多肽)中可以是不連續(xù)的，但是所述若干氨基酸由于多肽鏈的折疊而使它們自己在空間中相互靠近，并且因此可以形成可以被抗體識別的圖案。

在本申請的含義內(nèi)，抗原是例如蛋白質(zhì)(尤其是天然的蛋白質(zhì)或重組的蛋白質(zhì))、肽(例如，合成肽)、糖蛋白、碳水化合物或脂質(zhì)；所述肽可以與載體分子有關(guān)聯(lián)或沒有關(guān)聯(lián)。

“載體分子”尤其指的是蛋白質(zhì)或碳水化合物載體分子，尤其是載體蛋白質(zhì)。載體分子可以是多肽(尤其是蛋白質(zhì)或肽)，其可以是或可以不是天然的(例如，重組的蛋白質(zhì)或合成的肽)，官能化的聚合物(如葡聚糖、多糖或聚賴氨酸)、混合的共聚物(尤其是不同氨基酸的共聚物，例如賴氨酸-酪氨酸共聚物)。載體分子可以是抗體(尤其是單克隆抗體或多克隆抗體)，例如免疫球蛋白(也稱作Ig)。

一種實(shí)例載體分子或蛋白質(zhì)是BSA(牛血清白蛋白)。

在本申請中，“半抗原”在此指的是能夠被免疫系統(tǒng)所識別的具有低分子量的分子，但是其僅當(dāng)它偶聯(lián)到載體分子時才是免疫原性的。

被分析物優(yōu)選是使得可以診斷受試者中可以是或可以不是病理性的病況或者診斷發(fā)展可以是或可以不是病理性的病況的風(fēng)險的化合物。非病理性的病況的實(shí)例是妊娠。

受試者可以是人類、非人類動物或植物。非人類動物優(yōu)選是哺乳動物，如貓、狗、猴、兔、小鼠或大鼠。

術(shù)語“人類”被廣泛使用，并且尤其指代任何年齡的男人或女人，如嬰兒、兒童、青少年、成人或老人。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種被分析物從抗原或抗體中選擇。

當(dāng)被分析物或多種被分析物中的一種是抗原時，它優(yōu)選是使得可以診斷傳染的抗原，例如由病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物或后生動物引起的傳染。

當(dāng)被分析物或多種被分析物中的一種是抗體時，它優(yōu)選是使得可以診斷傳染的抗體，例如由病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物或后生動物引起的傳染。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種被分析物是核酸。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種被分析物不是核酸。

當(dāng)被分析物或多種被分析物中的一種是核酸時，它優(yōu)選是使得可以診斷傳染(例如由病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物或后生動物引起的傳染)的核酸。

典型地，這可以包括以下各項(xiàng)的一種或若干種抗原和/或一種或若干種抗體和/或一種或若干種特異性核酸：

-病毒，如HIV(人類免疫缺損病毒)，尤其是HIV-1或HIV-2，HBV(乙型肝炎病毒)，HCV(丙型肝炎病毒)，HPV(人乳頭瘤病毒)，HTLV(人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒)，尤其HTLV-I或HTLV-II，

-寄生蟲，如可以在人類或非人類動物內(nèi)引起以下各項(xiàng)的寄生蟲：弓形體病(尤其是弓形蟲(Toxoplasma gondii))，瘧疾(尤其是瘧原蟲屬(Plasmodium genus)的寄生蟲，例如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)，三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)或諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi))或查加斯(Chagas)病(尤其是克魯斯錐蟲(Trypanosoma cruzi))，或

-細(xì)菌，如能夠在人類或非人類動物內(nèi)引起以下各項(xiàng)的細(xì)菌：梅毒(蒼白密螺旋體(Treponema pallidum))或萊姆(Lyme)病(尤其是來自包柔氏螺旋體屬(Borrelia genus)的細(xì)菌)。

“寄生蟲”在此指的是充當(dāng)相對于身體的寄生蟲并且引起寄生蟲病的后生動物或原生動物。在本發(fā)明的含義內(nèi)的寄生蟲因此不是病毒、細(xì)菌或真菌。

被分析物或多種被分析物中的至少一種也可以是用于疾病的標(biāo)記物，如心血管病的標(biāo)記物或糖尿病標(biāo)記物，疾病如肝炎的進(jìn)展的標(biāo)記物，由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起的傳染的進(jìn)展的標(biāo)記物，對治療例如對抗病毒治療、抗生素治療或癌癥治療的耐性的標(biāo)記物。

可以在多重分析方法期間，在相同的樣品或相同的樣品混合物中同時檢測若干種(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或多于十五種)本申請中所述的被分析物。這可以使得可以在相同的樣品或相同的樣品混合物中診斷受試者中一種或若干種傳染或疾病、傳染或疾病的進(jìn)展、病況(病理性的或不是病理性的)、發(fā)展病況(病理性的或不是病理性的)的風(fēng)險或?qū)χ委煹哪托缘臉?biāo)記物。

在多重分析方法期間檢測的被分析物可以是相同性質(zhì)的(例如僅為抗體、僅為抗原或僅為核酸)或不同性質(zhì)的(例如，至少一種抗原和至少一種抗體)。

捕捉配體

捕捉配體是感興趣的化合物的特異性分子。

捕捉配體優(yōu)選特異性針對在樣品中待檢測的被分析物。它通常包括抗體、抗原、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。

在一個有利的實(shí)施方案中，捕捉配體不是核酸。一種或多種捕捉配體例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗體、抗原、肽、碳水化合物和脂質(zhì)。

捕捉配體在斑點(diǎn)處被固定到固體支持體的表面。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種捕捉配體是抗體、抗原或核酸。

在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種捕捉配體是抗體或抗原。

當(dāng)捕捉配體或多種捕捉配體中的一種是抗體時，它例如包括單克隆抗體或多克隆抗體。

檢測配體

檢測配體是感興趣的化合物的特異性分子。它尤其使得可以檢測固定到捕捉配體的感興趣的化合物。

被分析物的檢測配體特異性針對在樣品中的待檢測的被分析物。它尤其使得可以檢測固定到捕捉配體的被分析物。

檢測配體可以是抗體、抗原、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。它優(yōu)選是抗體或抗原。

在另一個實(shí)施方案中，一種或多種檢測配體是核酸。

在另一個實(shí)施方案中，檢測配體不是核酸。一種或多種檢測配體例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗體、抗原、肽、碳水化合物和脂質(zhì)。

當(dāng)檢測配體或多種檢測配體中的一種是抗體時，它例如包括單克隆抗體或多克隆抗體。

檢測配體或多種檢測配體中的一種優(yōu)選是被標(biāo)記的檢測配體，即，向其附接了檢測標(biāo)記物(其可以例如是生物素或過氧物酶)的檢測配體。檢測標(biāo)記物共價或非共價地，優(yōu)選共價地附接(即，偶聯(lián))到檢測配體。檢測配體或多種檢測配體中的一種可以與直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)。

當(dāng)檢測配體是未被標(biāo)記的時，可以通過使用所述檢測配體的特異性的被標(biāo)記的抗體，完成它的檢測。

檢測配體與所用的捕捉配體或所用的多種捕捉配體中的一種可以是同樣的，區(qū)別在于檢測標(biāo)記物的任何存在，并且/或者在與被捕捉配體或多種捕捉配體中的一種結(jié)合的區(qū)域相同的區(qū)域連結(jié)到它特異性針對的被分析物，尤其是當(dāng)它特異性針對的被分析物處于具有至少兩個同樣的結(jié)合區(qū)域的配合物的形式時。因此，當(dāng)人們希望檢測的被分析物中的一種是抗體時，作為所述被分析物的捕捉配體和檢測配體，可以使用所述抗體的相同的特異性抗原或包括至少一個允許被二價抗體識別的共享區(qū)域(至少一個共享的表位)的兩種不同的抗原。

捕捉配體和檢測配體也可以特異性針對被分析物處的分開的區(qū)域。

在一個特別的實(shí)施方案中，特異性針對同一被分析物(例如，抗原)的檢測配體和捕捉配體(例如，抗體)不結(jié)合到所述被分析物的相同位置。例如，檢測配體可以結(jié)合到它特異性針對的所述被分析物的區(qū)域，該區(qū)域與捕捉配體的結(jié)合區(qū)域分開，例如，從而避免捕捉配體和檢測配體關(guān)于它們特異性針對的化合物由于空間位阻導(dǎo)致的競爭。

檢測配體的檢測標(biāo)記物

與檢測配體偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物可以是直接標(biāo)記物或間接標(biāo)記物。

直接標(biāo)記物是其信號可以被直接檢測(即不需要在前添加報道物)的標(biāo)記物。

直接標(biāo)記物例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：放射性同位素、熒光團(tuán)、來自周期表的重元素如鑭系元素、發(fā)光化合物、過渡金屬如釕、顯色劑、以及有色的、熒光的或發(fā)光的納米粒子。

“發(fā)光”化合物可以是電致發(fā)光化合物、熱致發(fā)光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)光化合物是化學(xué)發(fā)光化合物。

可以用作直接標(biāo)記物的一種實(shí)例發(fā)光化合物(更具體地，熱致發(fā)光化合物)由二氧化硅納米粒子組成，所述二氧化硅納米粒子包含(例如摻雜有)二氧雜環(huán)丁烷化合物的分子，尤其是1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物，或二氧雜環(huán)丁烷化合物的衍生物，例如，1，2-二氧雜環(huán)丁烷的衍生物。

間接標(biāo)記物是這樣的標(biāo)記物：對于其來說，信號的檢測需要在前添加報道物(也稱作第一報道物)，并且，如果所述報道物它自己與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，需要添加與所述第一報道物偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的第二報道物。

報道物是間接標(biāo)記物的底物或是特異性結(jié)合到間接標(biāo)記物的分子，所述分子它自己是直接或間接標(biāo)記物或它自己偶聯(lián)到直接或間接標(biāo)記物。

間接標(biāo)記物例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：酶、配體-受體對的配體、配體-受體對的受體、半抗原、抗原和抗體。

配體-受體對的配體或受體是例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或地高辛配基(digoxigenin)。

優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的間接標(biāo)記物是酶，優(yōu)選通過與底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶。

間接標(biāo)記物的信號的檢測需要在前添加所述間接標(biāo)記物的報道物。

酶的報道物是例如所述酶的底物。

生物素的報道物是，例如，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，優(yōu)選與直接標(biāo)記物或間接標(biāo)記物如酶或催化劑偶聯(lián)。

生物素的報道物優(yōu)選與直接或間接檢測標(biāo)記物如酶或催化劑偶聯(lián)。

實(shí)例酶是過氧物酶，例如辣根過氧物酶(HRP或POD)、堿性磷酸酶或螢光素酶。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的生物素報道物是與過氧物酶、優(yōu)選辣根過氧物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白。則生物素的信號的檢測需要添加與過氧物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白，隨后添加過氧物酶的底物。

在此優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測配體或多種檢測配體中的一種與選自過氧物酶或生物素的直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)。

當(dāng)被分析物是核酸時，檢測標(biāo)記物或多種檢測標(biāo)記物中的一種可以通過熒光檢測到：例如通過使用利用熒光團(tuán)的直接或間接標(biāo)記，生物發(fā)光，優(yōu)選通過化學(xué)發(fā)光，例如通過使用利用發(fā)光化合物的直接標(biāo)記或利用通過與底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶(尤其是過氧物酶)的間接標(biāo)記。

當(dāng)被分析物是蛋白質(zhì)型的化合物時，檢測標(biāo)記物或多種檢測標(biāo)記物中的一種優(yōu)選通過發(fā)光檢測到：例如通過使用利用蛋白質(zhì)型的化合物(尤其是化學(xué)發(fā)光化合物)的直接或間接標(biāo)記，或利用通過與底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶作為報道物的間接標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，所用的檢測標(biāo)記物或多種檢測標(biāo)記物中的一種具有作為底物的：魯米諾、異魯米諾、吖啶、腔腸熒光素(coelenterazine)、二氧雜環(huán)丁烷或過氧草酸化合物，或它們的衍生物的一種，且尤其是在出版物Dodeigne C.等人(2000)，Talanta 51，415-439，“作為診斷工具的化學(xué)發(fā)光.回顧(Chemiluminescence as diagnostic tool.A review)”中描述的化合物。

在一個特別的實(shí)施方案中，所用的檢測標(biāo)記物或多種檢測標(biāo)記物中的一種具有作為底物的魯米諾、魯米諾的類似物(例如異魯米諾)、或它們的衍生物中的一種。

“魯米諾”指的是3-氨基苯二甲酰肼，也稱作5-氨基-2，3-二氫-酞嗪-1，4-二酮。魯米諾的原式是C₈H₇N₃O₂。作為實(shí)例，可以使用在實(shí)施例中描述的ELISTAR ETA C Ultra ELISA(Cyanagen，Italy)底物。

“異魯米諾”指的是4-氨基苯二甲酰肼。

魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物優(yōu)選分別是通過所有可能的一種或多種修改(例如，化學(xué)的和/或酶的)從魯米諾或魯米諾的類似物獲得的分子。魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物例如是過氧物酶的底物，所述過氧物酶與魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物的反應(yīng)使得可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光化合物。

異魯米諾的衍生物可以是例如氨基乙基異魯米諾(或AEI)、氨基乙基乙基異魯米諾(或AEEI)、氨基丁基異魯米諾(或ABI)、氨基丁基乙基異魯米諾(或ABEI)、氨基戊基乙基異魯米諾(或APEI)、氨基己基異魯米諾(或AHI)、氨基己基乙基異魯米諾(或AHEI)、氨基辛基甲基異魯米諾(或AOMI)或氨基辛基乙基異魯米諾(或AOEI)，如在出版物Dodeigne C.et al(2000)，Talanta 51，415-439，“作為診斷工具的化學(xué)發(fā)光.回顧(Chemiluminescence as diagnostic tool.A review)”中所述。

在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，可以以組合物(或制劑)的形式貢獻(xiàn)“魯米諾、魯米諾的類似物(例如異魯米諾)、吖啶、腔腸熒光素、二氧雜環(huán)丁烷或過氧草酸化合物，或它們的衍生物的一種”，所述組合物包含所述魯米諾、吖啶、腔腸熒光素、二氧雜環(huán)丁烷或過氧草酸化合物，或它們的衍生物的一種。

耐受性對照標(biāo)記物

本發(fā)明基于使用一種或若干種耐受性對照標(biāo)記物(例如，多種耐受性對照標(biāo)記物的混合物)，所述耐受性對照標(biāo)記物使得可以對在固體支持體的表面上存在的一個或多個斑點(diǎn)的品質(zhì)進(jìn)行對照，所述品質(zhì)尤其是在固體支持體的表面上存在的一個或多個斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性，此對照(或這些對照中的一個)能夠在進(jìn)行的分析方法結(jié)束時完成。

耐受性對照標(biāo)記物是能夠被檢測(例如通過產(chǎn)生信號)的化合物。產(chǎn)生的信號可以是例如放射性信號或光信號。它也可以包括通過光吸收被檢測到的對照標(biāo)記物(例如，著色的對照標(biāo)記物)。

光信號對應(yīng)于光的發(fā)射，尤其是在給定的波長范圍內(nèi)的。

耐受性對照標(biāo)記物可以例如是通過熒光、磷光或發(fā)光(尤其是電致發(fā)光、熱致發(fā)光或化學(xué)發(fā)光)發(fā)射光的標(biāo)記物。

當(dāng)耐受性對照標(biāo)記物或多種耐受性對照標(biāo)記物中的一種是通過發(fā)光發(fā)射光的標(biāo)記物時，它優(yōu)選通過化學(xué)發(fā)光發(fā)射光。

一種優(yōu)選的耐受性對照標(biāo)記物是通過熒光發(fā)射光的標(biāo)記物。

正如它的名字指出的，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物是耐受性的。

在此，“耐受性對照標(biāo)記物”指的是其信號在分析方法結(jié)束時被檢測到的標(biāo)記物。耐受性對照標(biāo)記物尤其是這樣的標(biāo)記物：在固體支持體的制備方法期間，并且也在實(shí)施所述支持體的分析方法期間，所述標(biāo)記物全部或至少部分地保持被固定在固體支持體的表面上的斑點(diǎn)處，并且所述標(biāo)記物能夠在分析方法結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號，即，包括在被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物的存在下，和/或當(dāng)一種或若干種間接檢測標(biāo)記物的情況時在一種或若干種報道物的存在下。

在表述“能夠在分析方法結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物”中，“能夠”意指，當(dāng)所述分析方法已在沒有所述斑點(diǎn)的劣化的情況下進(jìn)行時，在斑點(diǎn)中存在的耐受性對照標(biāo)記物在分析方法結(jié)束時在那個斑點(diǎn)處產(chǎn)生可檢測的信號。

在分析結(jié)束時，表述“能夠被檢測”、“其信號被檢測到”、“能夠產(chǎn)生可檢測的信號”或“產(chǎn)生可檢測的信號”意指(尤其是在耐受性對照標(biāo)記物是熒光團(tuán)的情況下)“被檢測的信號”(由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的并且在相應(yīng)的像素區(qū)域處在圖像傳感器上測量的信號)減去(即從它減去)周圍像素的平均信號大約比周圍像素信號的水平高三個標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)檢測到的信號減去周圍像素的平均信號達(dá)到比周圍像素的信號的水平高至少三個標(biāo)準(zhǔn)差時，所述檢測到的信號被認(rèn)定為“可檢測的信號”。

在本發(fā)明的含義內(nèi)，對照標(biāo)記物因此對于伴隨在分析方法期間使用的不同試劑(如一種或多種檢測配體、一種或多種報道物、一種或多種底物、樣品、一種或若干種稀釋劑)的洗滌和溫育步驟有耐性。

尤其是，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物對于被分析物的檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物的使用有耐性，如果被分析物的檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物的(第一)報道物可用的話并且如果與所述第一報道物偶聯(lián)的間接標(biāo)記物的(第二)報道物可用的話。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物對以下物質(zhì)的使用有耐性：一種或若干種酶，尤其是堿性磷酸酶和/或過氧物酶，以及所述一種或多種酶的一種或多種底物。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的對照標(biāo)記物對選自由以下各項(xiàng)組成的組的底物的使用有耐性：魯米諾、異魯米諾或它們的衍生物的一種。

在一個有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物也對于包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的底物的組合物(或制劑)的使用有耐性：魯米諾、異魯米諾或它們的衍生物的一種。所述組合物可以例如包含過氧化氫和/或?qū)τ隰斆字Z、異魯米諾或它們的衍生物的一種的功效有貢獻(xiàn)的化學(xué)分子(或輔助因子)。

“對化合物的使用有耐性”或“對化合物有耐性”在此意指對照標(biāo)記物在分析方法期間對所述化合物的使用有耐性。尤其是，對照標(biāo)記物對于在所述化合物的存在下被安放有耐性。

為了確定給定的化合物是否是本發(fā)明的含義內(nèi)的耐受性對照標(biāo)記物，可以實(shí)施包括以下步驟的方法：

a)在固體支持體的表面上沉積所述化合物，以形成至少一個斑點(diǎn)，

b)優(yōu)選地將固體支持體的表面飽和，

c)任選地將固體支持體的表面干燥，

d)任選地進(jìn)行一個以上洗滌步驟，

e)任選地在檢測配體的存在下安放斑點(diǎn)，

f)任選地進(jìn)行一個以上洗滌步驟，

g)任選地在至少一種報道物或至少一種酶(例如可以或不可以與報道物偶聯(lián)的過氧物酶)的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

h)任選地進(jìn)行一個以上洗滌步驟，

i)在至少一種底物(所述底物優(yōu)選是將用在人們希望在其中實(shí)施所述耐受性對照標(biāo)記物的分析方法中的底物)的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，所述底物優(yōu)選過氧物酶的底物，例如魯米諾，

i)在一個或多個斑點(diǎn)處測量由所述化合物產(chǎn)生的信號，和

k)如果在步驟j)測得的信號是可檢測的信號，認(rèn)為所述化合物是耐受性對照標(biāo)記物。

“可檢測的信號”尤其定義如上。

在步驟j)中測量的信號的類型取決于被測試的化合物。基于被測試的化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道什么類型的信號必須被檢測和如何檢測它。

在步驟e)中的檢測配體或多種檢測配體中的一種可以與生物素型的檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，步驟g)中的報道物或多種報道物中的一種可以是與酶(例如過氧物酶)偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白型的報道物，和/或步驟i)中的底物中的一種可以是所述酶的底物，例如魯米諾、魯米諾的類似物、和/或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物。

出人意料地，發(fā)明人因此已經(jīng)顯示了已經(jīng)簡單沉積在固體支持體的表面上的、與感興趣的化合物例如捕捉配體混合從而形成斑點(diǎn)的對照標(biāo)記物的耐性屬性。因此，在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物不共價地固定到固體支持體的表面和/或不共價地偶聯(lián)到到捕捉配體。

最后，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，耐受性對照標(biāo)記物很小干擾或優(yōu)選完全不干擾由在分析方法中使用的被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號。

“由被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號”指的是由被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物它自己產(chǎn)生的信號或?qū)?yīng)于檢測配體的檢測標(biāo)記物的信號。事實(shí)上，例如，在酶或其他間接標(biāo)記物類型的情況下，信號不由被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物它自己產(chǎn)生，而是通過報道物產(chǎn)生或由報道物(例如酶)與它的底物的反應(yīng)產(chǎn)生的化合物產(chǎn)生；在這種情況下，此信號對應(yīng)于被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物。

表述“很小干擾由被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的耐受性對照標(biāo)記物”意指，對使用者來說，分析方法的功能性不受耐受性標(biāo)記物的存在的影響，尤其是靈敏度的降低小于40％，優(yōu)選小于35％，更優(yōu)選小于30％，再更優(yōu)選小于25％。根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，此表述進(jìn)而意指特異性沒有劣化。

表述“特異性沒有劣化”意指閾值的增加小于或等于40％，優(yōu)選小于或等于35％，更優(yōu)選小于或等于30％，且再更優(yōu)選小于或等于25％。

閾值是在分析方法結(jié)束時對陰性樣品獲得的信號的平均加上12倍這些樣品的信號的標(biāo)準(zhǔn)差。

耐受性對照標(biāo)記物可以是中性的，或帶正電或帶負(fù)電的。

在本申請中，“帶正電或帶負(fù)電的分子”意指包括分別是正或負(fù)的整體電荷的分子，尤其是整體上分別包括一個、兩個、三個、四個或多于四個正或負(fù)的電荷的分子。

耐受性對照標(biāo)記物可以包含載體分子或與載體分子例如蛋白質(zhì)，如BSA偶聯(lián)。

當(dāng)耐受性對照標(biāo)記物“包含”載體分子時，它通常包含對照標(biāo)記物(例如，熒光團(tuán))和載體分子(例如，BSA)或由它們組成，所述對照標(biāo)記物與所述載體分子偶聯(lián)。此偶聯(lián)使得可以使在沒有偶聯(lián)的情況下不會有耐性的對照標(biāo)記物有耐性。

在對照標(biāo)記物或耐受性對照標(biāo)記物與載體分子之間的偶聯(lián)由耐受性對照標(biāo)記物和載體分子之間的共價或非共價鍵(優(yōu)選共價鍵)造成。

能夠共價地或非共價地與對照標(biāo)記物或耐受性對照標(biāo)記物偶聯(lián)的載體分子例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：BSA、免疫球蛋白(也稱作Ig)、葡聚糖、聚賴氨酸和混合的共聚物，尤其是不同的氨基酸的共聚物(例如，賴氨酸-酪氨酸共聚物)。

能夠共價地或非共價地與對照標(biāo)記物或耐受性對照標(biāo)記物偶聯(lián)的載體分子的其他實(shí)例是寡核苷酸或多核苷酸，尤其是DNA或RNA。

根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物可以是例如在如下定義的用于耐受性對照標(biāo)記物的選擇方法結(jié)束時選擇的標(biāo)記物。

耐受性對照熒光團(tuán)

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物是熒光團(tuán)。在這種情況下，它稱作耐受性對照熒光團(tuán)。

熒光團(tuán)，也稱作熒色物或熒光分子，是能夠在用光能激發(fā)之后發(fā)射熒光的物質(zhì)，尤其是化學(xué)或蛋白物質(zhì)(或多肽物質(zhì))。

熒光團(tuán)通常包含若干個共軛的芳族核心和/或具有一個或若干個π鍵的平面且環(huán)形的分子。

熒光團(tuán)可以是熒光蛋白質(zhì)，例如B-藻紅蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，尤其是耐受性對照熒光團(tuán)，優(yōu)選其特征在于它的激發(fā)光譜與被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜或?qū)?yīng)于的被分析物的檢測配體(其用在分析方法中)的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜不交疊，并且特征在于它的發(fā)射光譜與被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜或?qū)?yīng)于被分析物的檢測配體(其用在分析方法中)的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜不交疊，或部分交疊。

“對應(yīng)于檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜或激發(fā)光譜”是例如以下物質(zhì)的發(fā)射光譜或激發(fā)光譜：與檢測配體偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的間接標(biāo)記物或報道物，與(尤其是檢測配體的間接檢測標(biāo)記物的)報道物偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的報道物，或是由酶型報道物與它的底物的反應(yīng)產(chǎn)生的化合物。

在根據(jù)本發(fā)明的耐受性熒光團(tuán)的情況下，激發(fā)光譜可以對應(yīng)于吸收光譜。

優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，尤其是優(yōu)選的耐受性對照熒光團(tuán)，是特征如下的熒光團(tuán)：它的激發(fā)光譜與魯米諾、它的類似物中的一種(尤其是異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種的發(fā)射光譜不交疊，并且它的發(fā)射光譜與魯米諾、它的類似物中的一種(尤其是異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種的發(fā)射光譜不交疊或僅部分交疊。

“魯米諾、它的類似物中的一種(尤其是異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種的發(fā)射光譜”指的是從魯米諾、它的類似物中的一種(尤其是異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種與過氧物酶的反應(yīng)形成的化學(xué)發(fā)光化合物的發(fā)射光譜。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，尤其是耐受性對照熒光團(tuán)，其特征在于，它的激發(fā)光譜與魯米諾、異魯米諾或它們的衍生物的一種的發(fā)射光譜不交疊。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物尤其是耐受性對照熒光團(tuán)的發(fā)射光譜與一種或若干種檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜或?qū)?yīng)于一種或若干種檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜部分交疊時，使用濾光器使得可以消除由所述檢測標(biāo)記物發(fā)射的波長從而僅保留由熒光團(tuán)發(fā)射的特異性信號，和/或使用濾光器使得可以消除由所述熒光團(tuán)發(fā)射的波長從而僅保留由所述檢測標(biāo)記物發(fā)射的特異性信號，是有利的。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在以下兩項(xiàng)之間：

-根據(jù)本發(fā)明的一種或多種耐受性對照標(biāo)記物，尤其是一種或多種耐受性對照熒光團(tuán)，和

-檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物和/或產(chǎn)生對應(yīng)于在分析方法中使用的檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物的信號的一種或多種化合物，

尤其是在根據(jù)本發(fā)明的一種或多種耐受性對照標(biāo)記物(尤其是一種或多種耐受性對照熒光團(tuán))和通過魯米諾、它的類似物中的一種(例如異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種與過氧物酶的反應(yīng)獲得的發(fā)光化合物之間，沒有通過共振的能量轉(zhuǎn)換。

在一個有利的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種耐受性對照標(biāo)記物(尤其是一種或多種耐受性對照熒光團(tuán))具有如下的激發(fā)波長范圍和發(fā)射波長范圍：嚴(yán)格大于魯米諾、它的類似物中的一種(例如異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種的發(fā)射波長范圍，或嚴(yán)格小于魯米諾、它的類似物中的一種(例如異魯米諾)、和/或它們的衍生物的一種的發(fā)射波長范圍。

作為實(shí)例，當(dāng)使用魯米諾作為底物時，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，尤其是優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照熒光團(tuán)，不發(fā)射425nm左右、尤其是375nm至550nm、優(yōu)選375nm至580nm、更優(yōu)選350nm至580nm的光。換言之，當(dāng)使用魯米諾作為底物時，優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照熒光團(tuán)發(fā)射在以下范圍之外的波長的光：375nm至550nm、375nm至580nm或350nm至580nm。它可以僅發(fā)射波長小于(或小于或等于)375nm、370nm、360nm或350nm的光，或波長大于(或大于或等于)550nm、560nm、570nm、580nm、590nm或600nm的光。

表述“值X至值Y”意指包括邊界X和Y。

在一個特別的實(shí)施方案中，出人意料地，在由根據(jù)本發(fā)明的接收對照標(biāo)記物發(fā)射的信號的檢測中，且尤其是通過根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照熒光團(tuán)的檢測中，含有魯米諾、魯米諾的類似物和/或它們的衍生物的一種的反應(yīng)介質(zhì)的堿性pH，在反應(yīng)介質(zhì)中過氧化物、一種或若干種有利于電子轉(zhuǎn)移的試劑和?；呋瘎┑拇嬖冢疾粫饐栴}的起源的光譜的移位。

根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物，尤其是根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照熒光團(tuán)，其吸收窗不包含對應(yīng)于由檢測配體的檢測標(biāo)記物發(fā)射的信號的波長范圍，并且尤其不包含魯米諾的發(fā)射波長范圍。例如，一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照熒光團(tuán)不吸收375至530nm、375至550nm或350至580nm(含)的波長。因此，可以例如使用僅吸收小于(或小于或等于)375、370、360或350nm的波長的熒光團(tuán)，或僅吸收大于(或大于或等于)530、540、550、560、570、580、590或600nm的波長的熒光團(tuán)。

根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，耐受性對照標(biāo)記物可以是中性的熒光團(tuán)、帶正電的熒光團(tuán)或帶負(fù)電的熒光團(tuán)或熒光蛋白質(zhì)，所述熒光團(tuán)任選地偶聯(lián)到載體分子，例如蛋白質(zhì)如BSA。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，耐受性對照熒光團(tuán)包含至少一個帶正電的官能團(tuán)，且尤其是至少一個胺官能。

根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，耐受性對照標(biāo)記物包含至少一個熒光團(tuán)和至少一個載體分子(例如，BSA)或由它們組成，所述至少一個熒光團(tuán)偶聯(lián)到所述至少一個載體分子，并且所述至少一個熒光團(tuán)例如能夠是中性的、帶正電的或或帶負(fù)電的熒光團(tuán)、或熒光蛋白質(zhì)。

載體分子尤其是如上文中在“被分析物”段落中定義的。

耐受性對照熒光團(tuán)例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、苯并吡喃鎓、藻紅蛋白和它們的衍生物。所述熒光團(tuán)任選地偶聯(lián)到載體分子，例如蛋白質(zhì)如BSA。

耐受性對照熒光團(tuán)例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、苯并吡喃鎓衍生物、它們的衍生物、和藻紅蛋白。耐受性對照熒光團(tuán)例如從在申請WO00/64986 A1中描述的和/或由公司Atto-Tec市售的化合物中選出。

一種優(yōu)選的耐受性對照熒光團(tuán)例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine、噁嗪、噁嗪衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

另一種優(yōu)選的耐受性對照熒光團(tuán)選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine衍生物、噁嗪、噁嗪衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

一種再更優(yōu)選的耐受性對照熒光團(tuán)例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

另一種再更優(yōu)選的耐受性對照熒光團(tuán)例如選自由以下各項(xiàng)組成的組：carbopyronine衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻紅蛋白。

一個實(shí)例包括由公司Atto-Tec市售的Atto 633carbopyronine和它的衍生物尤其是胺衍生物，以及苯并吡喃鎓的衍生物(像是由公司Dyomics市售的那些)，尤其是當(dāng)它們與載體分子(例如BSA)偶聯(lián)時的Dye 634或Dye 630，或與載體(例如BSA)偶聯(lián)或未偶聯(lián)的Dye 634或Dye 630的胺衍生物。

一種優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的carbopyronine是包含以下基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的分子：

能夠用作耐受性對照熒光團(tuán)的carbopyronine，像是來自Atto 633的胺衍生物，例如具有以下特性：最大吸收波長＝629nm，在最大吸收波長處的摩爾吸收系數(shù)＝1.3x 10⁵M^-1cm^-1，最大發(fā)射波長＝657nm，和量子效率＝64％。

能夠用作耐受性對照熒光團(tuán)的苯并吡喃鎓衍生物例如具有以下特性：

-最大吸收波長(乙醇中)：635nm，

-最大發(fā)射波長(乙醇中)：658nm，和

-在最大吸收波長處的摩爾吸收系數(shù)：200,000M^-1cm^-1。

這例如包括具有下式的稱為Dye 634的熒光團(tuán)(以其與載體分子(例如BSA)偶聯(lián)的形式)：

Dye 634也可以以其胺形式(Dye 634-胺)用作耐受性對照熒光團(tuán)。它可以與載體分子(且尤其是BSA)偶聯(lián)或未偶聯(lián)使用。

還另一種能夠用作耐受性對照熒光團(tuán)的苯并吡喃鎓衍生物例如具有以下特性：

-最大吸收波長(乙醇中)：636nm，

-最大發(fā)射波長(乙醇中)：657nm，和

-在最大吸收波長處的摩爾吸收系數(shù)：200,000M^-1cm^-1。

這例如包括Dye 630(以其與載體分子(例如BSA)偶聯(lián)的形式)。

Dye 630具有下式：

Dye 630也可以以其胺形式(Dye 630-胺)使用，其與載體分子例如BSA偶聯(lián)或未偶聯(lián)。

作為耐受性對照標(biāo)記物的酶

根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物的另一個實(shí)例是酶，例如通過與所述酶的底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶。

優(yōu)選地，發(fā)光化合物是化學(xué)發(fā)光化合物。

能夠用作根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物的酶例如是堿性磷酸酶或螢光素酶。

堿性磷酸酶底物是例如Lumi-Phos 530或Lumi-Phos底物，更多由Lumigen市售。

螢光素酶底物是例如螢光素或腔腸熒光素(coelenterazine)底物。

當(dāng)耐受性對照標(biāo)記物是產(chǎn)生發(fā)光化合物的酶時，對應(yīng)于耐受性對照標(biāo)記物的被檢測的信號是由通過所述酶與所述酶的底物的反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光化合物發(fā)射的信號。

信號的檢測

直接或間接地檢測由檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號或由一種或多種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號。

取決于所用的標(biāo)記物，可以例如通過熒光或發(fā)光尤其是通過化學(xué)發(fā)光檢測信號。

酶型的標(biāo)記物需要加入使得可以產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物的底物，例如，加入允許產(chǎn)生光的底物。

通過電致發(fā)光發(fā)射光的耐受性對照標(biāo)記物需要加入釕配合物和加入三丙基胺(TPA)，以及施加允許產(chǎn)生光的電流。

如上文指出的，生物素型的間接標(biāo)記物需要添加報道物，優(yōu)選與直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)的報道物。

如果報道物偶聯(lián)到酶型的間接標(biāo)記物(例如過氧物酶)，必須在后面的步驟中加入那種酶的底物，例如魯米諾或魯米諾的類似物(如異魯米諾)或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物。

可以有利地使用根據(jù)如下文定義的本發(fā)明的裝置檢測信號。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過熒光檢測由一種或多種耐受性對照標(biāo)記物發(fā)射的信號，并且通過發(fā)光例如通過化學(xué)發(fā)光檢測由檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物發(fā)射的信號。

通常，使用包含至少兩個溶液的試劑盒完成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

第一溶液包含用于過氧物酶的底物，例如魯米諾、異魯米諾和/或魯米諾或異魯米諾的衍生物，和電子中介體；第二溶液包含氧化劑。作為實(shí)例，可以使用以下試劑盒：″Immun-star western C″(Bio-Rad，United States)，″ELISTAR ETA C Ultra ELISA″(Cyanagen，Italy)，″Supersignal West Pico″(Thermo Scientific，United States)，″Chemiluminescent Sensitive Plus HRP″(Surmodics，United States)。

用于在樣品中的至少一種被分析物的改善的檢測的固體支持體

用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的分析方法的一種或多種支持體是固體支持體。

根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，使用根據(jù)本發(fā)明的用于制備固體支持體的方法獲得固體支持體。

固體支持體可以由任何適合于進(jìn)行分析方法的材料制成。固體支持體是例如具有聚合物的或聚合物的混合物的基底的支持體。

適合的固體支持體是例如由聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丁二烯或它們的組合制成的支持體。

適合的固體支持體的另一個實(shí)例是膜，例如由硝基纖維素、PVDF(聚亞乙烯氟化物)、尼龍或它們的組合制成的膜。

適合的固體支持體的還另一個實(shí)例是無機(jī)支持體，例如玻璃載片和/或金屬支持體。

一種優(yōu)選的固體支持體是由聚苯乙烯或聚丙烯制成的。

固體支持體包含至少一個區(qū)劃(也稱作分析區(qū)域)，優(yōu)選至少兩個區(qū)劃。

根據(jù)本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案，固體支持體包含單一的區(qū)劃。所述單一的區(qū)劃可以是包括一個或若干個壁的區(qū)劃。備選地，所述單一的區(qū)劃可以不具有壁并且那么與固體支持體它自己是可比的。那么區(qū)劃的底部可以由固體支持體的上面構(gòu)成。這樣的包含可以包括或可以不包括一個或若干個壁的單一區(qū)劃的固體支持體的一個實(shí)例是載片或膜。

根據(jù)一個特別的本發(fā)明的實(shí)施方案，固體支持體，其可以是例如微量培養(yǎng)板或膜，包含至少兩個區(qū)劃。

當(dāng)固體支持體包含至少兩個區(qū)劃時，它們是相互隔離的，使得它們不相互溝通，即，使得在分析期間用于分析的各種組合物或溶液不能從一個區(qū)劃流通到另一個。因此，添加到一個區(qū)劃中的溶液將不進(jìn)入其他的區(qū)劃。例如，一個或多個區(qū)劃包含或由以下組成：底部和一個或若干個壁，所述一個或多個壁將一個或多個區(qū)劃相互隔離開，使得它們不相互溝通。

典型地，每個待分析的試樣使用固體支持體的至少一個(例如一個或兩個)區(qū)劃。

在其中固體支持體(例如載片或膜)包含單一區(qū)劃的本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，典型地，每個待分析的試樣使用至少一個(例如一個或兩個)固體支持體。

固體支持體是例如微量培養(yǎng)板。在這種情況下，一種實(shí)例區(qū)劃是孔。

微量培養(yǎng)板典型地是具有96個孔或386個孔的微量培養(yǎng)板。

本發(fā)明因此設(shè)計(jì)用于檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物的固體支持體，其特征在于所述固體支持體包含至少一個區(qū)劃，所述區(qū)劃包含至少一個斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種捕捉配體。

耐受性對照標(biāo)記物尤其是如上文，尤其是在段落“耐受性對照標(biāo)記物”、“耐受性對照熒光團(tuán)”和“作為耐受性對照標(biāo)記物的酶”中定義的，或者是使用在下文中在段落“耐受性對照標(biāo)記物的選擇方法”中定義的選擇方法獲得的。

尤其是，一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物是在用于檢測至少一種被分析物的方法的實(shí)施期間保持至少部分地被固定于固體支持體的表面上的所述斑點(diǎn)處從而在檢測方法結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物的標(biāo)記物。

意在分析樣品的固體支持體的區(qū)劃包含至少一個斑點(diǎn)，例如兩個斑點(diǎn)、三個斑點(diǎn)、四個斑點(diǎn)或五個斑點(diǎn)，或至少六個斑點(diǎn)，優(yōu)選六個斑點(diǎn)、七個斑點(diǎn)、八個斑點(diǎn)，更優(yōu)選至少九個斑點(diǎn)，例如九個斑點(diǎn)、十個斑點(diǎn)、十一個斑點(diǎn)、十二個斑點(diǎn)、十三個斑點(diǎn)、十四個斑點(diǎn)、十五個斑點(diǎn)、十六個斑點(diǎn)或多于十六個斑點(diǎn)。

在此，“斑點(diǎn)”指的是固體支持體的區(qū)劃的表面上的區(qū)域，其包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和/或至少一種感興趣的化合物，優(yōu)選至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種感興趣的化合物，例如捕捉配體。一種或多種耐受性對照標(biāo)記物和一種或多種感興趣的化合物因此通過非共價物理化學(xué)相互作用(尤其是弱鍵類型，例如，離子的、范德華、氫和/或疏水的)或通過共價鍵同時固定到在區(qū)劃的表面上的所述區(qū)域。

斑點(diǎn)除了一種或多種感興趣的化合物之外可以含有至少一種聚合物，尤其是至少一種包括親水基團(tuán)的聚合物，例如至少一種水凝膠。

在一個特別的實(shí)施方案中，區(qū)劃的全部斑點(diǎn)，優(yōu)選固體支持體的全部斑點(diǎn)，包含可以在全部斑點(diǎn)中以相同濃度或以不同濃度使用的單一的耐受性對照標(biāo)記物或耐受性對照標(biāo)記物的單一的混合物。

備選地，可以在固體支持體的同一區(qū)劃的多個斑點(diǎn)中使用不同的(至少兩種)耐受性對照標(biāo)記物和/或耐受性對照標(biāo)記物的不同的(至少兩種)混合物。

本發(fā)明特別涉及用于檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物的固體支持體，其特征在于所述固體支持體包含至少一個區(qū)劃，所述區(qū)劃包含至少一個斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)包含單一的耐受性對照標(biāo)記物和至少一種捕捉配體。

優(yōu)選地，全部意在檢測被分析物的斑點(diǎn)，尤其是全部包含捕捉配體的斑點(diǎn)，僅包含一種耐受性對照標(biāo)記物，所述耐受性對照標(biāo)記物優(yōu)選在同一區(qū)劃的全部意在檢測被分析物的斑點(diǎn)中是相同的，且更優(yōu)選地，其在固體支持體的全部區(qū)劃的全部意在檢測被分析物的斑點(diǎn)中是相同的。

斑點(diǎn)對應(yīng)于孔限定的區(qū)域，例如包含0.0078mm²至5.309mm²之間、優(yōu)選0.196mm²至3.142mm²、更優(yōu)選包含0.503mm²至2.011mm²。

斑點(diǎn)具有平圓形的、圓柱形的或半球形的、或大約平圓形的、圓柱形的或半球形的(例如卵形的)形狀，尤其是當(dāng)固體支持體是微量培養(yǎng)板或載片時。

備選地，斑點(diǎn)可以具有正方或矩形的形狀(尤其是條帶)，例如當(dāng)固體支持體是膜時，或任何其他形狀。

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，如在專利US 7,470,547 B2、US 6,576,295 B2、US 5,916,524 A和US 5,743,960 A中所述的那些，獲得斑點(diǎn)。

例如，通過將至少一滴含有確定量的至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種感興趣的化合物的溶液沉積在固體支持體的區(qū)劃的表面上的特殊位置中，獲得斑點(diǎn)。

當(dāng)斑點(diǎn)包含至少一種聚合物(例如至少一種水凝膠)時，可以通過將至少一滴含有確定量的至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種感興趣的化合物的溶液沉積在其上已經(jīng)預(yù)先沉積了所述聚合物的區(qū)劃的表面上的特殊位置中，獲得所述斑點(diǎn)。

區(qū)劃的表面也稱作“固相”。

感興趣的化合物通常是捕捉配體，尤其是被分析物的捕捉配體。區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)可以充當(dāng)對照斑點(diǎn)，并且因此包含不意在檢測樣品的被分析物的捕捉配體，或包含其他感興趣的化合物，或不包含任何感興趣的化合物。

本發(fā)明特別涉及用于檢測在樣品中的至少一種被分析物的固體支持體，其特征在于所述固體支持體包含至少兩個區(qū)劃，所述區(qū)劃包含至少一個斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種捕捉配體。

在一個特別的實(shí)施方案中，固體支持體的一些或全部區(qū)劃具有相同的斑點(diǎn)組成。

在另一個特別的實(shí)施方案中，固體支持體或固體支持體的區(qū)劃的一些或全部包含若干(例如兩)組(或類型)有區(qū)別的斑點(diǎn)或區(qū)劃或由它們組成，每個單獨(dú)的組具有不同的斑點(diǎn)組成(由于在每個組的斑點(diǎn)的數(shù)量和/或斑點(diǎn)中一種或多種耐受性對照標(biāo)記物和/或一種或多種捕捉配體和/或一種或多種感興趣的化合物導(dǎo)致)。

包含耐受性對照標(biāo)記物的分析支持體的制備

本發(fā)明也涉及用于制備用于檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物的固體支持體的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在固體支持體的至少一個區(qū)劃(優(yōu)選至少兩個區(qū)劃)的表面上沉積包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種捕捉配體的混合物，以獲得斑點(diǎn)，

b)將步驟a)重復(fù)n-1次，n是大于或等于1的整數(shù)，以獲得n個意在檢測在一個或多個所述區(qū)劃的所述表面上的被分析物的斑點(diǎn)，

c)任選地，將一個或多個所述區(qū)劃的所述表面飽和，以及

d)任選地，將一個或多個所述區(qū)劃的所述表面干燥。

固體支持體，一種或多種耐受性對照標(biāo)記物和一種或多種捕捉配體尤其是如上文定義的。

在步驟a)中，將包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和至少一種捕捉配體的混合物沉積在固體支持體的至少一個區(qū)劃、優(yōu)選至固體支持體的至少兩個區(qū)劃的表面上，以獲得斑點(diǎn)。

在步驟a)中，一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物是在用于檢測至少一種被分析物的方法的實(shí)施期間保持至少部分地被固定于固體支持體的表面上的所述斑點(diǎn)處從而在檢測方法結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物。

耐受性對照標(biāo)記物尤其是如在本申請中定義的。

一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物優(yōu)選為熒光團(tuán)，例如熒光團(tuán)的混合物。一種或多種熒光團(tuán)可以是熒光化學(xué)分子或熒光蛋白質(zhì)。

一種或多種所述捕捉配體優(yōu)選選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗體、抗原、核酸以及它們的組合。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種所述捕捉配體不是核酸。

例如，一種或多種所述捕捉配體選自由以下各項(xiàng)組成的組：抗體和抗原。

混合物優(yōu)選為溶液。

耐受性對照標(biāo)記物以不干擾一種或多種捕捉配體向區(qū)劃的表面的固定并且允許在分析方法結(jié)束時檢測由所述耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的量，存在于混合物中。

作為實(shí)例，混合物包含0.1至100μg/ml的捕捉配體和0.01至100μg/ml的對照標(biāo)記物，優(yōu)選在緩沖溶液中，例如TBS(Tris Buffered Saline，三羥甲基氨基甲烷鹽水緩沖液)溶液。

可以例如使用包括以下步驟的方法，確定在混合物中耐受性對照標(biāo)記物的濃度：

-在固體支持體的表面上沉積至少兩種溶液，每種溶液包含所述耐受性對照標(biāo)記物和捕捉配體，耐受性對照標(biāo)記物的濃度從一種溶液向另一種增加，并且耐受性對照標(biāo)記物的最低濃度大于或等于預(yù)定的最小濃度，

-任選地，將固體支持體的表面飽和，即，在使得可以避免向固體支持體的非特異性結(jié)合的試劑的存在下，安放固體支持體的表面，

-任選地，將固體支持體的表面干燥，

-在斑點(diǎn)的存在下安放樣品，安放包括具有特異性捕捉配體的被分析物的樣品，

-在斑點(diǎn)的存在下安放所述被分析物的特異性檢測配體，所述檢測配體與直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，

-當(dāng)所述檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，添加所述間接檢測標(biāo)記物的報道物(也稱作第一報道物)，并且當(dāng)所述(第一)報道物與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，添加與檢測配體的間接檢測方法的所述(第一)報道物偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的第二報道物，

-檢測由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，

-檢測由檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，

-選擇使得可以檢測由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號和由檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號兩者的耐受性對照標(biāo)記物的濃度。

耐受性對照標(biāo)記物的濃度優(yōu)選使得可以檢測由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號和由檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號兩者，而相對于不包含耐受性對照標(biāo)記物的斑點(diǎn)的沒有顯著的靈敏度損失，即，對于使用者來說，分析方法的功能性不受耐久性標(biāo)記物的存在的影響，尤其是靈敏度的降低小于40％，優(yōu)選小于35％，更優(yōu)選小于30％，再更優(yōu)選小于25％。

根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，耐受性對照標(biāo)記物的濃度使得可以檢測由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號和由檢測配體的檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號兩者，而特異性沒有劣化。

表述“特異性沒有劣化”意指閾值的增加小于或等于40％，優(yōu)選小于或等于35％，更優(yōu)選小于或等于30％，且再更優(yōu)選小于或等于25％。

閾值是在分析方法結(jié)束時對陰性樣品獲得的信號的平均加上12倍這些樣品的信號的標(biāo)準(zhǔn)差。

當(dāng)檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，因此添加所述間接檢測標(biāo)記物的報道物。當(dāng)所述報道物(稱為第一報道物)它自己與間接檢測標(biāo)記物(例如酶)偶聯(lián)時，添加與所述第一報道物偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的第二報道物，例如底物。

可以例如使用以下方法確定耐受性對照標(biāo)記物的預(yù)定的最小濃度：

-在固體支持體的表面上沉積至少兩種溶液，每種溶液包含耐受性對照標(biāo)記物且不包含捕捉配體，耐受性對照標(biāo)記物的濃度從一種溶液向另一種增加，以形成至少兩個斑點(diǎn)，

-任選地，將固體支持體的表面飽和，即，在使得可以避免向固體支持體的非特異性結(jié)合的試劑的存在下，安放固體支持體的表面，

-任選地，將固體支持體的表面干燥，

-任選地，進(jìn)行以下步驟中的至少一個：

(i)進(jìn)行一個以上洗滌步驟，

(ii)在檢測配體的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

(iii)在報道物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

(iv)在底物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

-檢測由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，和

-選擇允許信號的檢測的耐受性對照標(biāo)記物的最小的濃度。

可以人工地將混合物(或溶液)沉積在固體支持體或固體支持體的區(qū)劃的表面上，但優(yōu)選通過適合的裝置自動地完成。

因此，如前文指出的，耐受性對照標(biāo)記物與存在于混合物(或溶液)中的一種或多種捕捉配體同時固定在分析支持體的固相上。

在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，意在檢測至少一種被分析物的固體支持體的區(qū)劃的各個斑點(diǎn)包含至少一種不同的捕捉配體，優(yōu)選意在通過斑點(diǎn)檢測被分析物。然而，區(qū)劃的若干個斑點(diǎn)可以包含至少一種相同的捕捉配體。

在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，同一斑點(diǎn)可以包含若干不同的捕捉配體(例如，若干抗體和/或抗原)，它們通常特異性針對相同的待檢測的病理、傳染或疾病(尤其特異性針對相同的病毒、相同的細(xì)菌、相同的真菌或相同的寄生蟲)、傳染或疾病的進(jìn)展、受試者的病況(病理性的或不是病理性的)、發(fā)展病況(病理性的或不是病理性的)的風(fēng)險或?qū)χ委煹哪托缘臉?biāo)記物。

區(qū)劃的若干斑點(diǎn)或全部斑點(diǎn)可以包含意在檢測相同被分析物的捕捉配體；這例如包括相同被分析物的不同的特異性捕捉配體或甚至在斑點(diǎn)中以不同濃度存在的相同的捕捉配體。

在一個特別的實(shí)施方案中，耐受性對照標(biāo)記物或耐受性對照標(biāo)記物的混合物在所有斑點(diǎn)中是相同的，并且在各個斑點(diǎn)可以或可以不以相同的濃度添加它。

備選地，可以在區(qū)劃的不同斑點(diǎn)中使用不同的耐受性對照標(biāo)記物(至少兩種)和/或耐受性對照標(biāo)記物的不同的混合物。

區(qū)劃也可以包含沒有耐受性對照標(biāo)記物的一個或若干個斑點(diǎn)。然而，優(yōu)選所述區(qū)劃的全部斑點(diǎn)包含耐受性對照標(biāo)記物。

區(qū)劃也可以包含沒有捕捉配體但優(yōu)選包含其他感興趣的化合物的一個或若干個斑點(diǎn)。

當(dāng)區(qū)劃包含沒有捕捉配體的一個或若干個斑點(diǎn)時，所述一個或多個斑點(diǎn)優(yōu)選包含耐受性對照標(biāo)記物。

在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，支持體的全部區(qū)劃具有相同的斑點(diǎn)組成。

在本發(fā)明的另一個特別的實(shí)施方案中，固體支持體的一些或全部區(qū)劃包含若干個(例如兩)組有區(qū)別的區(qū)劃或由它們組成，有區(qū)別的組的每一個具有不同的斑點(diǎn)組成。

在固體支持體的一些或全部區(qū)劃中，優(yōu)選在固體支持體的全部區(qū)劃中，進(jìn)行步驟a)和b)。

將在固體支持體的至少一個區(qū)劃的表面上沉積的混合物例如在被4℃至40℃包含的溫度下溫育若干秒到若干小時。

該方法包含可能的步驟c)，用于將固體支持體的一個或多個所述區(qū)劃的表面飽和，即，在可以使得避免向固體支持體的非特異性結(jié)合的試劑的存在下安放固體支持體的表面的測試。飽和步驟尤其意在避免在分析方法的實(shí)施期間化合物的非特異性固定。

使得可以避免向固體支持體的非特異性結(jié)合的試劑例如是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的飽和溶液。

在可能的步驟d)中，將一個或多個區(qū)劃的表面干燥。

干燥例如在56℃或37℃或在環(huán)境溫度下完成。

在一個特別的實(shí)施方案中，一個或若干個洗滌步驟跟隨在步驟a)、步驟b)和/或步驟c)之后。

本發(fā)明也涉及用于制備如上所定義的固體支持體的方法，包括接下去的步驟e)，其包括檢查斑點(diǎn)的品質(zhì)。

如果斑點(diǎn)的品質(zhì)的檢查是陽性的，所述斑點(diǎn)可以用作分析方法的一部分。

如果斑點(diǎn)的品質(zhì)的檢查是陰性的，所述斑點(diǎn)不可以用作分析方法的一部分，可能含有所述斑點(diǎn)的區(qū)劃也是如此。

本發(fā)明還涉及試劑盒，其特征在于它包含以下各項(xiàng)或由以下各項(xiàng)組成：根據(jù)本發(fā)明的或者使用根據(jù)本發(fā)明的制備方法獲得的至少一種固體支持體，和，如果可用，用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的分析方法的至少一種組合物或溶液，和/或用戶說明書(instructions)。

用于改善的檢測的裝置(用于雙重檢測的裝置)

本發(fā)明另外的目的在于提供一種用于檢測在樣品中的至少一種被分析物的裝置，所述裝置包含：

-用于檢測在固體支持體處產(chǎn)生的第一信號和第二信號的工具，和

-用于從所述第一信號的位置限定讀取柵格并且用于在所述讀取柵格處讀取所述第二信號的工具。

根據(jù)一個特別的實(shí)施方案，此讀取對應(yīng)于在感興趣的區(qū)域處的第二信號的量化。

第一信號的檢測可以在第二信號的檢測之前、之后或同時完成。

固體支持體是尤其如上文定義的。

第一信號可以是熒光或發(fā)光信號，例如通過化學(xué)發(fā)光。

第二信號可以是熒光或發(fā)光信號，例如通過化學(xué)發(fā)光。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一信號是熒光信號且第二信號是發(fā)光信號，優(yōu)選通過化學(xué)發(fā)光(或反之亦然)。

用于檢測在固體支持體處產(chǎn)生的第一信號和第二信號的工具稱為光具座(optical bench)。

光具座可以例如包含以下部件或由以下部件組成：

-照明系統(tǒng)，

-遠(yuǎn)心物鏡，

-濾光輪，所述遠(yuǎn)心物鏡優(yōu)選在它的輸出透鏡上與所述濾光輪連接，和

-照相機(jī)。

照明系統(tǒng)優(yōu)選是可操縱的照明系統(tǒng)。

照明系統(tǒng)使得可以用或多或少的強(qiáng)度照亮固體支持體，例如，以顯示熒光或所用的固體支持體的幾何形狀。

遠(yuǎn)心物鏡優(yōu)選是大的。尤其是，遠(yuǎn)心物鏡覆蓋整個固體支持體。

遠(yuǎn)心物鏡使得可以將整個待測量的表面成像，而不使圖像變形，以消除標(biāo)準(zhǔn)物鏡固有的視差，并保證在整個觀看的表面上的信號均一性。

遠(yuǎn)心物鏡優(yōu)選在它的輸出透鏡上與濾光輪連接。

濾光輪使得可以在遠(yuǎn)心物鏡和照相機(jī)(也稱作圖像獲取照相機(jī))之間存在不同的濾光器。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，因此可以選擇到達(dá)照相機(jī)的傳感器的波長，以能夠，在一種情況下，通過濾光器的存在，將照明的激發(fā)信號與由至少一種耐受性對照標(biāo)記物(尤其是至少一種熒光團(tuán))產(chǎn)生的那些分開，并且在另一種情況下，通過不將信號濾光但保證維持組裝體的光學(xué)性質(zhì)的中性窗的存在，收集最大量的由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號。

照相機(jī)使得可以獲得具有變動的曝光時間的圖像。

這樣限定的光具座使得可以取得相同支持體的一系列圖像，具有不同的照明、濾光和/或圖像獲得參數(shù)，如：

-在可見范疇的圖像(也稱作定位圖像)，例如，通過使用來自照明系統(tǒng)的照明但不使用專門的濾光器而得到，

-熒光圖像(也稱作檢測圖像)，通過使用來自照明系統(tǒng)的照明和用于尋求的熒光的專門濾光器而得到，

-不用照明和專門濾光器得到的圖像(也稱作分析圖像)，例如，顯示化學(xué)發(fā)光信號。

用于從所述第一信號的位置限定讀取柵格并且用于在所述讀取柵格處讀取第二信號的工具可以包含成像系統(tǒng)或由成像系統(tǒng)組成。

在一種有利的實(shí)施方案中，光具座因此與成像系統(tǒng)聯(lián)合，使得可以進(jìn)行包括若干步驟的分析方法，其尤其保證進(jìn)行的分析的精確性和魯棒性，所述步驟包括：

1.選擇固體支持體和固體支持體的一個或多個區(qū)劃并將其定位，尤其是根據(jù)定位圖像；此過程的目的是減少固體支持體的任何機(jī)械定位錯誤并且使得可以使用不具有高定位精度的機(jī)械；

2.從在步驟1中確定的一個或多個區(qū)劃的位置，在每個區(qū)劃中，將表示每個斑點(diǎn)的理論位置的理論柵格定位；此定位可以從參考柵格例如在分析系統(tǒng)中描述的柵格來完成，所述參考柵格指示了每個斑點(diǎn)相對于區(qū)劃的參考點(diǎn)的坐標(biāo)；區(qū)劃的參考點(diǎn)例如是區(qū)劃的中心：

3.使用利用照明和熒光濾光器完成的檢測圖像，對在固體支持體的一個或多個區(qū)劃中存在的所有熒光情況進(jìn)行搜索，并且任選地，使用通過它們的大小和形狀進(jìn)行的情況選擇來排除某些情況，從而消除完全在預(yù)期的規(guī)則之外的那些情況；

4.在以下兩項(xiàng)之間比較：

○先前檢測的并認(rèn)為有效的情況的位置，

○如在步驟2中限定的預(yù)期的斑點(diǎn)的理論位置；

5.對于每個預(yù)期的斑點(diǎn)，與最近的檢測到的情況關(guān)聯(lián)，并且和理論斑點(diǎn)的表面相交，從而形成“理論斑點(diǎn)”/“熒光情況”對，使得可以檢測遺漏的斑點(diǎn)。對于每個理論斑點(diǎn)，一定存在有區(qū)別的和獨(dú)特的熒光情況；

6.使用直徑、形狀、距理論位置距離判據(jù)表征每個檢測到的斑點(diǎn)，使得可以保證檢測到的斑點(diǎn)的完整性；

7.對于每個檢測到的斑點(diǎn)，限定相應(yīng)的感興趣的區(qū)域，稱為讀取柵格，尤其是通過檢測到的斑點(diǎn)的表面和坐標(biāo)限定；和

8.在步驟7中限定的讀取柵格上讀取第二信號，尤其是量化在此感興趣的區(qū)域即讀取柵格處的分析圖像上的第二信號。

具有對斑點(diǎn)的品質(zhì)檢查的分析方法

根據(jù)本發(fā)明的分析方法允許檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物。

本發(fā)明尤其涉及用于檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在固體支持體的區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放待分析的樣品，所述斑點(diǎn)或所述多個斑點(diǎn)的至少一個包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物以及被分析物的至少一種捕捉配體，

b)在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測配體，被分析物的所述檢測配體與直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，

c)當(dāng)被分析物的至少一種檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

d)當(dāng)在步驟c)中使用的所述報道物與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放與在步驟c)中使用的所述報道物偶聯(lián)的所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

e)檢測由在所述區(qū)劃中的至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，

f)由在步驟e)檢測到信號的位置限定讀取柵格，

g)任選地，檢測由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，以及

h)任選地，在步驟f)中限定的所述讀取柵格上讀取在步驟g)中檢測的信號。

如上限定的，該或所述耐受性對照標(biāo)記物能夠在分析方法結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號，即，當(dāng)分析方法已在沒有所述斑點(diǎn)的劣化的情況下進(jìn)行時在斑點(diǎn)處產(chǎn)生可檢測的信號。尤其是，該或所述耐受性對照標(biāo)記物能夠在上述方法的步驟e)期間產(chǎn)生可檢測的信號。

本發(fā)明尤其涉及用于檢測在至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在固體支持體的區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放待分析的樣品，所述斑點(diǎn)或所述多個斑點(diǎn)的至少一個包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物以及被分析物的至少一種捕捉配體，

b)在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測配體，被分析物的所述檢測配體與直接或間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，

c)當(dāng)被分析物的至少一種檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

d)當(dāng)在步驟c)中使用的所述報道物與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放與在步驟c)中使用的所述報道物偶聯(lián)的所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

e)檢測由在所述區(qū)劃中的至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，

f)由在步驟e)檢測到信號的位置限定讀取柵格，

g)任選地，檢測由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，以及

h)任選地，在步驟f)中限定的所述讀取柵格上讀取在步驟g)中檢測的信號，

一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物是在用于檢測至少一種被分析物的方法的實(shí)施期間保持至少部分地被固定于固體支持體的表面上的斑點(diǎn)處從而在步驟e)期間產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物。

還在步驟e)至h)之前，完成步驟a)至d)。

步驟g)可以在步驟e)之前、之后或同時進(jìn)行。在一個特別的實(shí)施方案中，步驟g)在步驟e)之前或之后進(jìn)行。

步驟f)還在步驟e)之后進(jìn)行。

步驟f)還在步驟e)之后且在步驟h)之前進(jìn)行，并且可以在步驟g)之前、之后或同時進(jìn)行。

步驟h)還在步驟e)至g)之后進(jìn)行。

對于固體支持體的每個區(qū)劃，完成步驟a)至f)，和如果可用，步驟g)和/或步驟h)，所述區(qū)劃包含至少一個斑點(diǎn)，所述斑點(diǎn)包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和被分析物的至少一種捕捉配體，在所述區(qū)劃中分析樣品。

如果在步驟f)中限定的讀取柵格不指示用于讀取在步驟g)中被檢測的信號的任何區(qū)域，可以不完成步驟g)和/或h)。

如果進(jìn)行步驟h)，也進(jìn)行步驟g)。

該方法可以有利地包括一個或若干個洗滌步驟，例如在步驟a)至d)的各個或一些之間。

對意在分析樣品的各區(qū)劃的洗滌包括至少一個循環(huán)，優(yōu)選3至6個循環(huán)，用于將一定體積(例如400μL)的洗滌溶液(例如，Tris NaCl 0.01M緩沖溶液，pH 7.4，摻雜有0.1％的Tween 20)分配和抽吸。

根據(jù)本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案，在步驟e)和g)之間沒有操作，尤其是沒有移液、分配、攪動、抽吸或洗滌步驟，不管步驟e)、f)和g)以何種順序。

表述“在區(qū)劃的斑點(diǎn)的存在下安放化合物X”意味著將化合物X添加到包含所述斑點(diǎn)的區(qū)劃，所述區(qū)劃意在分析樣品。

當(dāng)在相同的步驟期間在區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放至少兩種化合物時和/或當(dāng)至少兩個步驟a)至d)同時進(jìn)行時，可以在一個或多個所述斑點(diǎn)的存在下分別安放所述化合物，即，以分開的組合物的形式分配所述化合物；備選地，可以在區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下以一種或若干種混合物的形式安放所述化合物或化合物中的一些。

尤其使用如上文定義的固體支持體或通過如上文定義的制備方法獲得的固體支持體來進(jìn)行檢測方法。

一種或多種耐受性對照標(biāo)記物、一個或多個斑點(diǎn)、被分析物的一種或多種捕捉配體尤其是如上文定義的。

尤其是，一種或多種耐受性對照標(biāo)記物是在所述用于檢測至少一種被分析物的方法的實(shí)施期間保持至少部分地被固定于固體支持體的表面上的所述斑點(diǎn)處從而在步驟e)期間，即當(dāng)分析方法已在沒有斑點(diǎn)的劣化的情況下進(jìn)行時，產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物。

本發(fā)明特別涉及如上定義的方法，其特征在于所述多種耐受性對照標(biāo)記物或所述多種耐受性對照標(biāo)記物中的一種是一種(或若干種)熒光團(tuán)，例如，一種或若干種熒光化學(xué)分子或一種或若干種熒光蛋白質(zhì)，例如熒光團(tuán)的混合物。

本發(fā)明特別涉及如上定義的方法，其特征在于所述多種耐受性對照標(biāo)記物或所述多種耐受性對照標(biāo)記物中的一種是耐受性對照標(biāo)記物，尤其是熒光團(tuán)，其激發(fā)光譜與由被分析物的一種或多種所述檢測配體的檢測標(biāo)記物發(fā)射的信號或?qū)?yīng)于被分析物的一種或多種所述檢測配體的檢測標(biāo)記物的信號的發(fā)射光譜不交疊，并且其發(fā)射光譜與被分析物的所述一種或多種檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜或?qū)?yīng)于被分析物的所述一種或多種檢測配體的檢測標(biāo)記物的發(fā)射光譜不交疊，或部分交疊。

本發(fā)明例如涉及如上定義的方法，其特征在于所述多種耐受性對照標(biāo)記物或所述多種耐受性對照標(biāo)記物中的一種是耐受性對照標(biāo)記物，尤其是熒光團(tuán)，其激發(fā)光譜與通過魯米諾和/或類似物和/或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物與過氧物酶的反應(yīng)獲得的發(fā)光化合物發(fā)射的信號的發(fā)射光譜不交疊，并且其發(fā)射光譜與通過魯米諾和/或類似物和/或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物與過氧物酶的反應(yīng)獲得的發(fā)光化合物的發(fā)射光譜不交疊，或部分交疊。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上定義的檢測方法包括以下步驟：

a)在固體支持體的區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放待分析的樣品，所述斑點(diǎn)或所述多個斑點(diǎn)的至少一個包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物以及被分析物的至少一種捕捉配體，

b)在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的至少一種檢測配體，被分析物的所述檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，

c)在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

d)當(dāng)在步驟c)中使用的所述報道物與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放與在步驟c)中使用的所述報道物偶聯(lián)的所述間接檢測標(biāo)記物的報道物，

e)檢測由在所述區(qū)劃中的至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的至少一種信號，

f)由在步驟e)檢測到信號的位置限定至少一個讀取柵格，

g)任選地，檢測由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，以及

h)任選地，在步驟f)中限定的所述讀取柵格上讀取在步驟g)中檢測的信號。

本發(fā)明特別涉及如上定義的方法，其特征在于：

-由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號是由通過過氧物酶與魯米諾、魯米諾的類似物和/或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物的反應(yīng)獲得的化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)射的光，并且

-由耐受性對照標(biāo)記物或多種所述耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號是在375至550nm、375至580nm或350至580nm(含)的波長之外發(fā)射的光。

優(yōu)先地，一種或多種耐受性對照標(biāo)記物具有激發(fā)光譜，和優(yōu)選地發(fā)射光譜，在375至550nm、375至580nm或350至580nm(含)的波長之外。

分析方法例如是免疫測定，且尤其是免疫-酶測定，如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))試驗(yàn)。分析方法也可以用于檢測核酸。

在步驟a)中，在固體支持體的區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放待分析的樣品。

當(dāng)分析若干種樣品且固體支持體包含若干個區(qū)劃時，步驟a)包括在固體支持體的至少一個區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放樣品，所述固體支持體包含至少和待檢測的樣品的數(shù)量那么多的區(qū)劃，所述區(qū)劃包含至少一個包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和被分析物的至少一種捕捉配體的斑點(diǎn)，或使用若干個固體支持體。

當(dāng)分析若干種樣品且固體支持體包單一區(qū)劃時，步驟a)包括向固體支持體的區(qū)劃中加入樣品(或者，當(dāng)所述區(qū)劃與固體支持體本身可比時，在所述固體支持體上添加樣品)，并且人們使用和待分析的樣品的數(shù)量那么多的固體支持體，所述固體支持體包含區(qū)劃，所述區(qū)劃包含至少一個包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物和被分析物的至少一種捕捉配體的斑點(diǎn)。

當(dāng)分析若干種樣品時，對每種樣品使用不同的區(qū)劃?？梢允褂靡粋€或若干個固體支持體的若干個區(qū)劃來分析相同的樣品，尤其是如果所述區(qū)劃具有不同的斑點(diǎn)組成。

可以步驟a)和b)同時、步驟a)在步驟b)之前、或步驟b)在步驟a)之前完成。當(dāng)步驟b)在步驟a)之前完成時，方法在這兩個步驟a)和b)之間不包括洗滌步驟。

步驟c)和d)，當(dāng)它們存在時，優(yōu)選在步驟a)和b)之后完成，并且在步驟a)和b)與步驟c)和d)之間優(yōu)選至少有一個洗滌步驟。

步驟c)和d)，當(dāng)它們存在時，可以同時完成，或步驟c)在步驟d)之前完成。當(dāng)步驟d)在步驟c)之前完成時，方法在這兩個步驟d)和c)之間不包括洗滌步驟。

步驟d)，當(dāng)它存在時，優(yōu)選在步驟c)之后完成，并且在步驟c)和d)之間有至少一個洗滌步驟。

在步驟b)中，在所述區(qū)劃的一個或多個斑點(diǎn)的存在下安放被分析物的的至少一種檢測配體。

步驟b)尤其在各個意在分析樣品的區(qū)劃中完成。

被分析物的一種或多種檢測配體尤其是如上文定義的。

優(yōu)選地，步驟b)包括添加每種待檢測的被分析物的至少一種檢測配體。當(dāng)使用被分析物的不同的檢測配體時，可以將它們同時或相繼添加，全部或部分配體能夠以分開的組合物的形式或一種或多種混合物的形式被提供。被分析物的檢測配體中的一些可以與步驟a)同時添加，優(yōu)選在洗滌步驟之后，在添加其余的被分析物的檢測配體之前。

當(dāng)在步驟b)期間相繼添加被分析物的檢測配體時，在至少一種被分析物檢測配體的各自添加之后可以跟隨意在分析樣品的區(qū)劃的洗滌步驟。

步驟c)和d)的性能取決于檢測配體的檢測標(biāo)記物，并且如果可用，取決于檢測配體的檢測標(biāo)記物的報道物的檢測標(biāo)記物。

因此，當(dāng)被分析物的至少一種檢測配體與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)時，進(jìn)行步驟c)。

優(yōu)選地，被分析物的一種或多種檢測配體與相同的檢測標(biāo)記物偶聯(lián)。如果被分析物的至少兩種檢測配體偶聯(lián)到不同的間接檢測標(biāo)記物，對每種間接檢測標(biāo)記物進(jìn)行步驟c)，以檢測各種標(biāo)記物的信號。

當(dāng)在步驟c)中使用至少一種報道物(也稱作第一報道物)偶聯(lián)到間接檢測標(biāo)記物時，進(jìn)行步驟d)。在步驟d)中使用的報道物稱為第二報道物。

當(dāng)進(jìn)行步驟d)時，因此也進(jìn)行步驟c)。

在步驟e)中，在所述區(qū)劃中檢測由至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號。

如果使用至少兩種耐受性對照標(biāo)記物，步驟e)優(yōu)選包括檢測由所述耐受性對照標(biāo)記物的每種產(chǎn)生的信號。

由至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的檢測尤其使得可以將在固體支持體中的每個區(qū)劃中包含至少一種耐受性對照標(biāo)記物的斑點(diǎn)局域化。

由至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號優(yōu)選為通過熒光發(fā)射的信號。

在步驟f)中，從在步驟e)中檢測的信號的位置限定讀取柵格。

讀取柵格精確指明在區(qū)劃的必須在哪個或那些區(qū)域讀取(或“分析”或“考慮”或“解釋”)第二信號。尤其是，在讀取柵格中限定的所述多個區(qū)域或所述多個區(qū)域之一以外的地方在步驟g)中檢測的第二信號在步驟h)期間的第二信號的讀取(或“分析”或“解釋”)中不被考慮。

特別有利的是根據(jù)每個斑點(diǎn)的輪廓精確限定所述區(qū)域。

因此，用于限定讀取柵格的步驟f)尤其包括從在步驟e)中檢測的對應(yīng)于至少一種耐受性對照標(biāo)記物的信號校驗(yàn)斑點(diǎn)的品質(zhì)。

“斑點(diǎn)的品質(zhì)”指的是一個或多個斑點(diǎn)的存在、位置和/或完整性。

斑點(diǎn)的完整性包括斑點(diǎn)的大小和形狀。

如果斑點(diǎn)在與預(yù)期位置一致的位置存在于區(qū)劃中，如果它具有界限清楚的輪廓，如果它的形狀與可接受性判據(jù)一致(例如，如果它具有平圓形，大約平圓形例如卵形，或具有大于80％的圓形度)，和如果它不與區(qū)劃的其他斑點(diǎn)相交，則斑點(diǎn)的品質(zhì)檢測尤其是陽性的。

“大于80％的圓形度”意指檢測到的斑點(diǎn)具有足夠的圓形度，以保證它尚未被在分析方法中完成的所有處理所損壞。

例如，如果在步驟e)中檢測到信號，此信號具有界限清楚的輪廓、平圓形、大約平圓形例如卵形或具有大于80％的圓形度，并且如果它不與由區(qū)劃的其他斑點(diǎn)產(chǎn)生的信號相交，則斑點(diǎn)的品質(zhì)檢查是陽性的。

如果在斑點(diǎn)處在步驟e)中沒有檢測到信號，或如果斑點(diǎn)由于與上述原因的至少一個不同而不滿足品質(zhì)對照，則當(dāng)在步驟h)中讀取第二信號時，不考慮在所述斑點(diǎn)處任選地檢測的第二信號，可能也不考慮在對應(yīng)于所述斑點(diǎn)的區(qū)劃的每個斑點(diǎn)處檢測的第二信號。

在步驟e)和g)中，信號的檢測優(yōu)選包括信號的獲得。

根據(jù)本發(fā)明的一種或若干種耐受性對照標(biāo)記物的使用因此使得可以在斑點(diǎn)所處的精確位置進(jìn)行第二信號的讀取，使得可以改善分析的靈敏度，同時確保得到的結(jié)果，尤其是使得可以消除與斑點(diǎn)缺陷有關(guān)的假陽性或假陰性。

本發(fā)明尤其涉及如上定義的方法，其特征在于由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號是發(fā)光信號，尤其是化學(xué)發(fā)光信號，例如通過魯米諾和/或類似物和/或魯米諾的衍生物或魯米諾的類似物的衍生物與過氧物酶的反應(yīng)發(fā)射的光。

本發(fā)明更具體地涉及如上定義的方法，其特征在于由至少一種耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號是通過熒光被檢測的，且由被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號是通過發(fā)光尤其是化學(xué)發(fā)光被檢測的。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少步驟e)至h)是使用同一裝置進(jìn)行的，例如在“用于改善的檢測的裝置”段落中描述的裝置。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法的全部步驟是使用同一裝置進(jìn)行的，例如在“用于改善的檢測的裝置”段落中描述的裝置。

用于選擇耐受性對照標(biāo)記物的方法

本發(fā)明也涉及一種用于選擇耐受性對照標(biāo)記物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在固體支持體的表面上沉積待測試的標(biāo)記物，以形成至少一個斑點(diǎn)，

b)任選地，將所述固體支持體的所述表面飽和，

c)任選地，將所述固體支持體的所述表面干燥，

d)進(jìn)行以下步驟中的至少一個：

(i)進(jìn)行一個或多個洗滌步驟，

(ii)在檢測配體的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

(iii)在報道物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

(iv)在底物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

e)選擇在步驟d)結(jié)束時產(chǎn)生信號的標(biāo)記物。

待測試的標(biāo)記物是產(chǎn)生(例如，發(fā)射)能夠被檢測的信號的化合物。例如，待測試的標(biāo)記物是熒光團(tuán)或發(fā)光化合物。

固體支持體尤其是如上定義的。

步驟a)包括將待測試的標(biāo)記物沉積在固體支持體的表面上以形成至少一個斑點(diǎn)，或由其組成。

可以使用適合的裝置人工或自動地沉積標(biāo)記物。

待測試的標(biāo)記物通常以包含所述標(biāo)記物的溶液的形式被沉積。

步驟a)可以包括將相同的待測試的標(biāo)記物沉積在若干個斑點(diǎn)中，以及增加濃度。

在步驟a)中沉積的溶液可以或可以不包含捕捉配體。

方法包括可能的步驟b)，其用于將固體支持體的表面飽和。飽和步驟尤其意在防止在分析方法的實(shí)施期間化合物的非特異固定。

在步驟c)中，任選地將固體支持體的表面干燥。

通常，在步驟a)和/或步驟b)后跟隨一個或若干個洗滌步驟a’)和/或b’)。

步驟d)包括(或由以下各項(xiàng)組成)進(jìn)行以下步驟的至少一種，優(yōu)選以下步驟的至少兩種，更優(yōu)選以下步驟的至少三種：

(i)進(jìn)行一個或多個洗滌步驟，

(ii)在至少一種檢測配體的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，

(iii)在至少一種報道物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)，和/或

(iv)在至少一種底物的存在下安放一個或多個斑點(diǎn)。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)包括(或由以下各項(xiàng)組成)步驟(iii)和/或步驟(iv)，優(yōu)選步驟(iii)和步驟(iv)。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)包括(或由以下各項(xiàng)組成)步驟(i)、步驟(iii)和/或步驟(iv)，優(yōu)選步驟(i)、步驟(iii)和步驟(iv)。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)至少包括步驟(i)、步驟(ii)、步驟(iii)和步驟(iv)。

步驟(i)至(iv)可以以任何適宜的順序完成。

然而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)包括按以下順序的以下步驟：步驟(ii)、步驟(i)、步驟(iii)、步驟(i)、步驟(iv)和步驟(i)。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟d)包括按以下順序的以下步驟：步驟(ii)、步驟(i)、步驟(iii)、步驟(i)和步驟(iv)。

在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)這些步驟存在時，步驟(ii)在步驟(iii)之前和/或在步驟(iv)之前進(jìn)行，且步驟(iii)在步驟(iv)之前進(jìn)行。步驟(i)可以在步驟(ii)與(iii)、(ii)與(iv)(尤其是當(dāng)不存在步驟(iii)時)和/或(iii)與(iv)之間進(jìn)行。

優(yōu)選地，步驟(iii)的多種報道物或多種報道物中的一種是與步驟(ii)的至少一種檢測配體偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物的報道物，和/或步驟(iv)的多種底物或多種底物中的一種是與報道物偶聯(lián)的檢測標(biāo)記物的報道物。

例如，步驟(ii)的一種或多種檢測配體或一種或多種檢測配體中的一種與生物素型的檢測標(biāo)記物偶聯(lián)，步驟(iii)的多種報道物或多種報道物中的一種是與酶(例如過氧物酶)偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白型的報道物，和/或步驟(iv)中的多種底物或多種底物中的一種是所述酶的底物，例如魯米諾、魯米諾的類似物、和/或魯米諾或魯米諾的類似物的衍生物。

選擇方法包括步驟e)，其用于選擇在步驟d)結(jié)束時產(chǎn)生信號的標(biāo)記物。尤其是，在步驟e)中選擇的標(biāo)記物在步驟d)結(jié)束時產(chǎn)生信號。“可檢測的信號”尤其是如上定義的。

優(yōu)選地，步驟e)還包括選擇不干擾或很小干擾由檢測配體的檢測標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號的檢測。

根據(jù)本發(fā)明的選擇方法還可以包括：

-任選地，首先：

○上述步驟a)至c)，其中在步驟a)中形成的一個或多個斑點(diǎn)不包含捕捉配體，

○任選地，第一預(yù)選步驟，其包括選擇在步驟c)結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物，

○任選地，在同一支持體上的步驟d)至e)，優(yōu)選所述步驟僅用在第一預(yù)選步驟中選擇的所述標(biāo)記物進(jìn)行，其后跟隨第二預(yù)選步驟，其包括選擇在步驟c)結(jié)束時產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)記物，

-其次，以上步驟a)至e)，其中步驟a)中形成的一個或多個斑點(diǎn)包含捕捉配體，步驟d)至e)優(yōu)選用在第一預(yù)選步驟中選擇的標(biāo)記物和/或在第二預(yù)選步驟中選擇的標(biāo)記物進(jìn)行。

耐受性對照標(biāo)記物的用途

本發(fā)明也涉及至少一種耐受性對照標(biāo)記物在意在檢測被分析物的至少一個斑點(diǎn)中用于確保用于檢測在樣品或至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法的用途。

“用于確保用于檢測在樣品或至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法”在此意指保證在所述檢測方法結(jié)束時獲得的結(jié)果的可靠性，尤其是避免“假陰性”或“假陽性”的存在。

“假陰性”是反映在樣品中不存在一種或若干種待檢測的被分析物的陰性結(jié)果，而一種或多種所述被分析物存在于樣品中且應(yīng)當(dāng)被檢測到。

“假陽性”是反映在樣品中存在一種或若干種待檢測的被分析物的陽性結(jié)果，而一種或多種所述被分析物不存在于樣品中。

尤其通過以下方式獲得對用于檢測在樣品中的至少一種被分析物的方法的確保：在檢測方法結(jié)束時檢查一個或多個意在檢測被分析物的斑點(diǎn)的品質(zhì)，和/或使用至少一種耐受性對照標(biāo)記物改善被分析物的檢測的靈敏度。

本發(fā)明因此涉及至少一種耐受性對照標(biāo)記物在意在檢測被分析物的至少一個斑點(diǎn)中用于確保用于檢測在樣品或至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法的用途，其特征在于它包括：

-當(dāng)在樣品和待檢測的被分析物的至少一種檢測配體的存在下安放了所述斑點(diǎn)之后，尤其是在分析方法結(jié)束時，檢查所述斑點(diǎn)的品質(zhì)，和/或

-讀取信號，所述信號由待檢測的被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物在讀取柵格上產(chǎn)生，所述讀取柵格由一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的位置限定。

由待檢測的被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號因此在讀取柵格上完成并且在分析方法結(jié)束時被檢測到，所述讀取柵格由一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的位置限定。

本發(fā)明尤其涉及至少一種耐受性對照標(biāo)記物在意在檢測被分析物的至少一個斑點(diǎn)中用于確保用于檢測在樣品或至少一個樣品中的至少一種被分析物的方法的用途，其特征在于它包括：

-當(dāng)在以下物質(zhì)的存在下安放了所述斑點(diǎn)之后，檢查斑點(diǎn)的品質(zhì)：樣品和與間接檢測標(biāo)記物偶聯(lián)的待檢測的被分析物的至少一種檢測配體、所述間接檢測標(biāo)記物的報道物(也稱作第一報道物)、任選地，與所述第一報道物偶聯(lián)的間接檢測標(biāo)記物的第二報道物，和/或

-讀取信號，所述信號由待檢測的被分析物的檢測配體的至少一種檢測標(biāo)記物在讀取柵格上產(chǎn)生，所述讀取柵格由一種或多種所述耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的位置限定。

本發(fā)明特別涉及如上定義的用途，其特征在于斑點(diǎn)的品質(zhì)對照包括(或由以下各項(xiàng)組成)檢查斑點(diǎn)存在、位置和/或完整性。

讀取柵格指示了區(qū)劃的一個或多個區(qū)域，其中由被分析物的檢測配體的一種或多種檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號必須被讀取。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將通過以下作為說明且非限制性地提供的實(shí)施例更好地顯現(xiàn)。

圖

圖1：在實(shí)施例1中描述的規(guī)程的不同步驟中的不同熒光團(tuán)的使用和所得的熒光圖像。

圖2：在根據(jù)本發(fā)明的分析方法結(jié)束時包含9個斑點(diǎn)的12個孔的熒光信號的獲得。

圖3：熒光圖像：理論讀取柵格(白色實(shí)線圓)相對于通過基于由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的熒光得到的斑點(diǎn)的實(shí)際位置(白色點(diǎn)線圓)的比較。

圖4：化學(xué)發(fā)光圖像：利用在通過耐受性對照標(biāo)記物檢測的斑點(diǎn)的實(shí)際位置上限定讀取柵格(點(diǎn)線)導(dǎo)致的分析方法的精確度的改善，相對于理論位置柵格(實(shí)線)。

圖5：化學(xué)發(fā)光圖像：在認(rèn)可結(jié)果之前利用對檢測到的斑點(diǎn)的完整性進(jìn)行校驗(yàn)導(dǎo)致的分析方法的精確度的改善。

圖6：光具座的圖，所述光具座包含照明系統(tǒng)、遠(yuǎn)心物鏡、濾光輪和照相機(jī)，所述遠(yuǎn)心物鏡在它的輸出透鏡上與濾光輪連接。

實(shí)施例

實(shí)施例1：用于選擇耐受性對照標(biāo)記物的實(shí)例方法

材料和方法

在聚苯乙烯微量培養(yǎng)板(Greiner，Germany)的每個孔內(nèi)，逐孔地沉積在傳統(tǒng)上用于制作抗原或抗體斑點(diǎn)的緩沖液中的500nl的熒光團(tuán)溶液的液滴。在此實(shí)施例中，使用以下熒光團(tuán)：Atto 633-甲酸(即，Atto 633-COOH或Atto 633)(供應(yīng)商：ATTO-TEC；Germany)、Atto 633-胺(即，得自Atto 633的Sérivé胺)(供應(yīng)商：ATTO-TEC；Germany)、Dye 634-甲酸(即，Dye 634-COOH或Dye 634)(供應(yīng)商：Dyomics，Germany)、Dye 634-胺(即，得自Dye 634的Sérivé胺)(供應(yīng)商：Dyomics，Germany)、Dye 630-胺(即，得自Dye 630的Sérivé胺)(供應(yīng)商：Dyomics，Germany)、APC(Allophycocyanin)(提供商Febico；Taiwan)、B-藻紅蛋白(Febico；Taiwan)。這些微量培養(yǎng)板的每個孔的底部具有本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的分子吸附能力。將每個這樣獲得的孔的表面用本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的飽和溶液飽和；用飽和溶液填充孔，將飽和溶液移除并且接著將孔干燥；在這些孔的再水化步驟之后，隨后將含有魯米諾(ELISTAR ETA C Ultra ELISA(Cyanagen，Italy)的底物溶液(見實(shí)施例2)以50μL/孔的比率添加。使用用于熒光團(tuán)的具有合適的濾光器的Chemidoc^TMMP System(Bio-Rad)，在上述規(guī)程的不同步驟(即，在沉積液滴、飽和、干燥、再水化的步驟之后，以及添加含有魯米諾的底物溶液之后)，完成熒光圖像。

結(jié)果

圖1描述了在上述規(guī)程的不同步驟中的不同熒光團(tuán)的使用和所得的熒光圖像。

用4種熒光團(tuán)獲得的熒光在液滴在板上的沉積結(jié)束時完全可見。在飽和溶液消失之后(參見飽和后的斑點(diǎn))，對于Atto 633-胺、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)和B-藻紅蛋白，此熒光仍然留存。在加入含有魯米諾的底物溶液之后，對于Atto 633-胺和對于B-藻紅蛋白，它仍然留存，對于別藻藍(lán)蛋白，非常微弱。用Dye 634-胺和Dye 630-胺得到類似的結(jié)果(結(jié)果未示出)。相反，在Dye 634-甲酸的情況下，在洗滌步驟結(jié)束時看不到殘留的熒光，且在添加底物溶液之后更是如此，對Atto 633-甲酸也是一樣(結(jié)果未示出)。

因此，Atto 633-胺、Dye 634-胺、Dye 630-胺和B-藻紅蛋白是根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物。

此外，如以下在實(shí)施例2中說明的，與BSA偶聯(lián)的Dye 634也是根據(jù)本發(fā)明的耐受性對照標(biāo)記物。

實(shí)施例2：耐受性對照熒光團(tuán)的存在對感興趣的被分析物的檢測不存在影響

材料和方法

(i)微量培養(yǎng)板的準(zhǔn)備

在聚苯乙烯微量培養(yǎng)板(Greiner，Germany)的每個孔內(nèi)，使用制造斑點(diǎn)機(jī)器人，成行沉積50nL含有一種或多種捕捉配體以及使用申請中所述方法選出的熒光團(tuán)的溶液的液滴。

捕捉配體溶液可以是：

-作為抗體檢測試驗(yàn)的一部分，是抗原或者抗原的混合物，其能夠由與一種以上合成肽相聯(lián)系的重組蛋白組成；

-或者在抗原檢測試驗(yàn)的情況下，是針對尋求的標(biāo)記物的抗體或抗體的混合物。

這些捕捉配體溶液含有選出的熒光團(tuán)，例如Atto 633-胺(Atto-tec，Germany)或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的規(guī)程從與BSA偶聯(lián)的處于NHS-酯(N-羥基琥珀酰亞胺酯)形式的Dye 634(Dyomics，Germany)獲得的Dye 634-BSA配合物；以針對每種決定的適合的劑量添加這些熒光團(tuán)；對于Dye 634-BSA，指示的劑量對應(yīng)于Dye 634-BSA配合物的濃度。這些微量培養(yǎng)板的每個孔的底部具有本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的吸附能力。

將這樣獲得的斑點(diǎn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的飽和溶液飽和。隨后將板干燥。

(i)分析方法的實(shí)施

對于在分析方法的實(shí)施期間使用的各種要素的描述：

報道物

Streptavidin-POD(S-POD)報道物是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員本身知道的由Nakane和Kawaoi[J Histochem Cytochem(1974)Vol.22，No.12.pp.1084-1091]描述的方法與過氧物酶(Roche Germany)偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(Roche，Germany)。

洗滌溶液

三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液10mM，pH 7.4，含有：NaCl 218mM、0.1％的Tween 20^TM(Sigma公司的商標(biāo))，0.002％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商標(biāo))。

顯影底物

ELISTAR ETA C Ultra ELISA顯影底物(Cyanagen，Italy)由兩種溶液組成：XLSE024LLuminol增強(qiáng)劑溶液(A)和XLSE024P過氧化物溶液(B)。

進(jìn)行的不同步驟的描述：

試驗(yàn)規(guī)程包括以下步驟：

步驟1：

1.在微量培養(yǎng)板的每個孔中(包含斑點(diǎn))分配：

-40μl的樣品：樣品可以例如是血清或?qū)φ諛悠?/p>

-40ul的稀釋劑

2.將混合物在37℃伴隨攪動溫育40分鐘。

3.用至少300μl的洗滌溶液完成至少三次相繼洗滌。

4.接著，在檢測配體的存在下完成溫育步驟，隨后在如第3點(diǎn)同樣的條件下洗滌。

5.隨后，報道物的溫育步驟，隨后洗滌。

6.最后，最終顯影步驟，包括添加25μl的顯影底物溶液B和A中的每一種。

7.將混合物在37℃伴隨攪動溫育1分鐘。

8.用Chemidoc^TM讀取儀完成讀取，以測量熒光，并且用Qview^TM讀取儀完成讀取，以測量化學(xué)發(fā)光。用圖像分析儀系統(tǒng)直接處理讀取的結(jié)果，并以相對光單位(RLU)以及相對熒光強(qiáng)度(RFI)記錄。

結(jié)果

各數(shù)據(jù)對應(yīng)于三次的平均值；熒光值對應(yīng)于在扣除背景噪聲之后的熒光信號水平。

用向待檢測的感興趣的標(biāo)記物的特異件抗體溶液中添加的Atto 633-胺熒光團(tuán)所獲得的結(jié)果；

表1：對于不同熒光團(tuán)含量，Atto 633-胺熒光團(tuán)的存在對于被分析物的檢測的影響。E1、E2和E3是陽性樣品，含有待檢測的抗原，處于不同的陽性水平。

在表1中所示的結(jié)果顯示，對于0.35μg/ml以下的劑量，Atto 633-胺熒光團(tuán)的存在對于被分析物的檢測沒有影響。對被分析物的檢測極限的計(jì)算顯示，高達(dá)1.2μg/ml的劑量的熒光團(tuán)的存在沒有影響。捕捉配體的存在僅僅非常微弱地改變熒光(參見表2)，熒光在分析結(jié)束時保持非常顯著且完全可檢測。

表2：捕捉配體的存在對熒光信號的影響(Atto 633-胺熒光閉的情況)。E1和E3是陽性樣品，含有待檢測的抗原，處于不同的陽性水平。N1是陰性樣品，不含有待檢測的抗原。“Fluo”代表熒光團(tuán)。

用向待檢測的感興趣的標(biāo)記物的特異性抗體溶液中添加的Dye634-BSA熒光團(tuán)所獲得的結(jié)果：

對于6μg/ml以下的熒光團(tuán)劑量，表3中的結(jié)果顯示Atto 634-BSA對被分析物的檢測沒有影響，此劑量與在分析結(jié)束時熒光的檢測和如在本申請中所述的數(shù)據(jù)處理方法的實(shí)施相容。

表3：對于不同的熒光團(tuán)劑量，Atto Dye 634-BSA熒光團(tuán)的存在對被分析物的檢測的影響。E1、E2和E3是陽性樣品，含有待檢測的抗原，處于不同的陽性水平。“Fluo”代表熒光團(tuán)。

用向?qū)?yīng)于待檢測的抗體的抗體溶液中添加的Atto 633-胺熒光閉所獲得的結(jié)果：

表4中所示的結(jié)果顯示，對于0.1μg/ml以下的熒光團(tuán)劑量，Atto 633-胺熒光團(tuán)的存在對被分析物的檢測沒有影響。捕捉配體的存在改變熒光(參見表5)，但是信號在分析結(jié)束時保持非常顯著、完全可檢測，并且可用于實(shí)施如在本申請中所述的數(shù)據(jù)分析方法。

表4：對于不同的熒光團(tuán)劑量，Atto 633-胺熒光團(tuán)的存在對被分析物的檢測的影響。樣品S1和S2是陽性樣品，含有與在混合物中所用的2種抗原(重組蛋白質(zhì)或合成肽)選擇性反應(yīng)并分別關(guān)于它們的抗體?！癋luo”代表熒光團(tuán)。

表5：捕捉配體的存在對熒光信號的影響(Atto 633-胺熒光團(tuán)的情況)。樣品S1和S2是陽性樣品，含有與所用的2種抗原(重組蛋白質(zhì)或合成肽)選擇性反應(yīng)并分別關(guān)于它們的抗體。N2是陰性樣品，不含有識別待檢測的抗原的抗體?！癋luo”代表熒光團(tuán)。

用向?qū)?yīng)于待檢測的抗體的抗體溶劑添加的Dye 634-BSA熒光團(tuán)所獲得的結(jié)果：

表6：對于不同的熒光團(tuán)劑量，Atto Dye 634-BSA熒光團(tuán)的存在對被分析物的檢測的影響。樣品S1是含有與所用的重組蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的樣品?！癋luo”代表熒光團(tuán)。

表6中所示的結(jié)果顯示，Dye 634-BSA熒光團(tuán)的存在對被分析物的檢測沒有影響，與熒光團(tuán)劑量無關(guān)。在分析結(jié)束時獲得的熒光信號完全可檢測，并且可用于實(shí)施如在本申請中描述的數(shù)據(jù)處理方法。

實(shí)施例3：耐受性對照標(biāo)記物用于確保用于檢測在樣品中的至少一種被分析物的方法的用途

材料和方法

(i)微量培養(yǎng)板的準(zhǔn)備

在聚苯乙烯微量培養(yǎng)板(Greiner，Germany)的每個孔內(nèi)，使用制造斑點(diǎn)機(jī)器人，成行沉積50nL含有一種或多種捕捉配體以及使用申請中所述方法選出的熒光團(tuán)的溶液的液滴。

捕捉配體溶液可以是：

-作為抗體檢測試驗(yàn)的一部分，是抗原或者抗原的混合物，其能夠由與一種以上合成肽相聯(lián)系的重組蛋白組成；

-或者在抗原檢測試驗(yàn)的情況下，是針對尋求的標(biāo)記物的抗體或抗體的混合物。

這些捕捉配體溶液含有被包括在0.1至0.5μg/mL之間的適合的劑量的選出的Atto 633-胺熒光團(tuán)(Atto-tec，Germany)。這些微量培養(yǎng)板的每個孔的底部具有本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的吸附能力。

將這樣獲得的斑點(diǎn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的飽和溶液飽和。隨后將板干燥。

(i)分析方法的實(shí)施

對于在分析方法的實(shí)施期間使用的各種要素的描述：

I.報道物

Streptavidin-POD(S-POD)報道物是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的P.Nakane和A.Kawaoi[J Histochem Cytochem(1974)第22卷，第12號.第1084-1091頁]所述的方法與過氧物酶(Roche Germany)偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(Roche，Germany)。

II.稀釋劑

a)稀釋劑步驟1

三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液50mM，pH 7.5，含有：NaCl 150mM、EDTA 20mM、500μg/mL的小鼠IgG(Meridian)、15％的奶牛乳(100％脫脂)、10％的綿羊血清、0.095％的NaN3。

b)共軛物1的稀釋劑

三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液50mM，pH 7.5，含有：NaCl 150mM；EDTA 20mM、Chaps 0.1％、甘油10％、0.095％的NaN3。

c)共軛物2的稀釋劑

檸檬酸鹽緩沖溶液50mM，pH 6.7，含有：NaCl 150mM、EDTA 5.6mM、2％的Triton、10％的綿羊血清、500μg/mL的小鼠IgG、0.5％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商標(biāo))、15％的奶牛乳(100％脫脂)、甘油10％、0.095％的NaN3。

d)Streptavidin-POD報道物的稀釋劑

檸檬酸鹽緩沖溶液50mM，pH 6.7，含有：NaCl 2053mM、0.5％的Tween 20^TM(Sigma公司的商標(biāo))、0.5％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商標(biāo))、7％的奶牛乳(100％脫脂)、甘油20％。

e)洗滌溶液

三羥甲基氨基甲烷10mM緩沖溶液，pH 7.4，含有：NaCl 218mM、0.1％的Tween 20^TM(Sigma公司的商標(biāo))、0.002％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商標(biāo))。

f)顯影底物

ELISTAR ETA C Ultra ELISA顯影底物(Cyanagen，Italy)由兩種溶液組成：XLSE024L魯米諾增強(qiáng)劑溶液(A)和XLSE024P過氧化物溶液(B)。

III.反應(yīng)皿

免疫學(xué)反應(yīng)在96孔微量培養(yǎng)板(Greiner，Germany)的孔中進(jìn)行，所述微量培養(yǎng)板由聚苯乙烯制成，最大容量為392μL/孔。

IV.樣品

使用的陰性樣品(血清或血漿)來自里爾的法國血液機(jī)構(gòu)。

V.光具座

所用的光具座由以下元件組成：

-照明系統(tǒng)，其發(fā)射集中在620nm的波長上的紅色光，并且組裝成使得它均勻照亮微量培養(yǎng)板的下面，

-遠(yuǎn)心物鏡，其制成為使得可以將微量培養(yǎng)板的整個表面成像，

-濾光輪，其插入在遠(yuǎn)心物鏡的輸出透鏡和照相機(jī)之間，

-照相機(jī)，其具有用被包括在0.001秒和250秒之間的曝光時間產(chǎn)生圖像的能力，

-支持底盤，其支持全部元件(包括微量培養(yǎng)板)并使它們定位。

研究并組裝光具座，使得它取得來自從微量培養(yǎng)板的下面的圖像。進(jìn)行物鏡的調(diào)節(jié)，使得微量培養(yǎng)板孔的內(nèi)面清晰。

濾光輪能夠具有兩種不同的濾光器：

-集中在680nm的波長的濾光器，使得可以僅允許對應(yīng)于由熒光團(tuán)發(fā)射的光的信號通過，

-使得可以允許被包括在400nm和700nm之間的所有波長通過的濾光器。

進(jìn)行不同步驟的描述：

試驗(yàn)規(guī)程包括以下步驟：

步驟1：

1.在微量培養(yǎng)板的每個孔(包含斑點(diǎn))中相繼分配：

+20μl的稀釋劑步驟1

+20μl的共軛物1稀釋劑，其包含：來自第一步驟的待化驗(yàn)的被分析物的檢測配體

+40μl的樣品

2.將混合物在37℃伴隨攪拌溫育40分鐘。

3.完成三次用至少400μl的洗滌溶液的相繼洗滌。

步驟2：

4.將50μl的共軛物2的稀釋劑分配到每個反應(yīng)孔中，其含有來自第二步驟的待化驗(yàn)的被分析物的檢測配體。

5.將混合物在37℃伴隨攪拌溫育15分鐘。

6.進(jìn)行洗滌步驟(同上第3點(diǎn))。

步驟3：

7.將50μL的S-POD報道物分配到每個反應(yīng)孔中。

8.將混合物在37℃伴隨攪拌溫育15分鐘。

步驟4：

9.將25μL的顯影溶液“B″分配到每個反應(yīng)孔中。

10.將25μL的顯影溶液“A″分配到每個反應(yīng)孔中。

10.將混合物在37℃伴隨攪拌溫育1分鐘。

11.進(jìn)行熒光信號的獲得10秒。

12.進(jìn)行發(fā)光信號的獲得180秒。

結(jié)果

A)在分析方法之后耐受性對照標(biāo)記物的留存

在圖2中的分析方法結(jié)束時，在12個孔中存在的9個斑點(diǎn)的每一個的耐受性對照標(biāo)記物的熒光信號都是清楚地可識別的并且完全可測量的。

B)在分析方法結(jié)束時重新限定讀取柵格的重要性：關(guān)于以下兩種情況下由熒光獲得的感興趣的區(qū)域進(jìn)行比較：相對于理論位置限定的讀取柵格；和由由耐受性對照標(biāo)記物的熒光發(fā)射的信號限定的讀取柵格。

在圖3中，實(shí)心白色圓顯示斑點(diǎn)的理論位置，點(diǎn)線白色圓顯示檢測到的真實(shí)位置。斑點(diǎn)清楚地相對于它們的預(yù)期理論位置發(fā)生了移位。

此圖像說明該方法的重要性，其總是使得可以通過耐受性對照標(biāo)記物對準(zhǔn)檢測的真實(shí)斑點(diǎn)的位置，并且不導(dǎo)致由被分析物的檢測配體的檢測標(biāo)記物發(fā)射的信號的讀取中的錯誤。

C)在分析方法結(jié)束時重新限定讀取柵格的重要性：關(guān)于以下兩種情況下通過化學(xué)發(fā)光獲得的感興趣的區(qū)域的比較：相對于理論位置限定的讀取柵格；和由耐受性對照標(biāo)記物的熒光發(fā)射的信號限定的讀取柵格。

基于由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號獲得真實(shí)斑點(diǎn)的位置(點(diǎn)線)，并將所述位置用在通過化學(xué)發(fā)光的被分析物的配體的檢測標(biāo)記物的信號的圖像獲得中，在此示于圖4中。斑點(diǎn)的理論位置用實(shí)線指明，并且清楚地顯示相對于真實(shí)位置的移位。

在表7中，示出了位于預(yù)期的理論位置(實(shí)線)下和通過熒光真實(shí)檢測的位置(點(diǎn)線)下的像素的化學(xué)發(fā)光的中值之間的比較。

表7：從斑點(diǎn)的理論存在區(qū)域的分析所測量的信號對比從該同一斑點(diǎn)的真實(shí)位置區(qū)域的分析所測量的信號

對含有產(chǎn)生信號的斑點(diǎn)的區(qū)域的分析提供了比相同斑點(diǎn)的理論存在區(qū)域明顯更高的結(jié)果。信號的量化和獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確性因此通過以下方式得以改善：使它自己基于檢測到的源于耐受性對照標(biāo)記物的真實(shí)定位柵格。

D)在分析方法之后劣化的斑點(diǎn)的實(shí)例，且它在沒有校驗(yàn)斑點(diǎn)的完整性的情況下可能產(chǎn)生假結(jié)果。

基于由耐受性對照標(biāo)記物產(chǎn)生的信號獲得真實(shí)斑點(diǎn)的位置(點(diǎn)線)，并將所述位置用在通過化學(xué)發(fā)光的被分析物的配體的檢測標(biāo)記物的信號的圖像獲得中，在此顯示(參見圖5)。斑點(diǎn)的理論定位用實(shí)線指明。

在圖像中(參見圖5)，位于孔中央的斑點(diǎn)變形。圍繞它的破碎的白線顯示：軟件檢測到了斑點(diǎn)的真實(shí)形狀，其使得可以在認(rèn)可結(jié)果產(chǎn)生之前，分析它的完整性。在這種情況下，斑點(diǎn)的真實(shí)形狀的圓形周緣使得可以消除此斑點(diǎn)并且不產(chǎn)生假分析值。