本發(fā)明涉及利用離心力用于處理和移動液體的流控裝置的領域，更具體地涉及在這樣的裝置中分離珠的方法。優(yōu)選的使用領域在對樣品中存在的化合物進行分析的分析方法中。當其中發(fā)生流控或微流控處理的分析裝置(芯片實驗室(lab-on-a-chip))結合離心機(并且優(yōu)選提供用于相對于所施加的離心力方向來改變所述分析裝置取向的裝置的離心機)使用時，有利地使用所述分離方法。

背景技術：

在關于適用于流控或微流控芯片或盒(cartridge)的分析方法的研究中構想了本發(fā)明的分離方法。為了更好地理解本發(fā)明的優(yōu)點，下面詳細描述這樣的分析方法。

某些物質(zhì)或分析物的常見分析方法涉及使用將與靶物質(zhì)或分析物選擇性結合的固相，所述靶物質(zhì)或分析物通常為生物標志物。在一些測定中，固相可以在其表面攜帶和展示特異性捕獲分子(capturing molecule)，其將特異性地結合生物標志物。為了檢測和定量所述生物標志物，固相-生物標志物復合體也可與附著于一種或更多種示蹤物質(zhì)的另一組生物標志物特異性結合分子反應，形成固相-生物標志物-示蹤物復合體。在另一些測定(例如競爭性免疫測定)中，樣品中的生物標志物將與確定量的攜帶示蹤物質(zhì)的生物標志物競爭與固相的結合。有多種方法來安排和使用所涉及的特異性黏合劑和靶分析物，包括多種類型的固相材料和示蹤物質(zhì)。

在許多分析系統(tǒng)中，固相包含固定的實施方案，例如腔(微量滴定板孔或微通道或微腔)的壁，或固定的結構，例如柱狀物或多孔膜，其上附著有與生物標志物(例如，抗原)互補的捕獲分子(例如，抗體)。在其與靶生物標志物結合時，含靶生物標志物的樣品側(cè)向或橫向流過多孔膜是優(yōu)選的固相理念。這是因為在這些膜中表面體積比非常大，允許大幅過量的捕獲分子(例如抗體)且因此非常高效地結合靶生物標志物的事實。但是，這些膜難以清洗，特別是當示蹤物是納米顆?；蚱鋱F塊時。這種困難由示蹤物質(zhì)在膜內(nèi)的口袋樣結構中非特異性結合或包埋(entrapment)引起。

在另一些分析系統(tǒng)中，固相可有利地為聚合物材料制備的球形納米級或微米級顆粒，其暴露大的表面積。

示蹤物是可以通過光學、化學、電學、磁性、放射性手段或其組合來檢測和測量的任何類型的物質(zhì)。另外，示蹤物質(zhì)也可以配制成顆粒或與顆粒締合。通常通過光學手段使用和檢測的這樣的顆粒包括金屬膠體(金、銀、鐵等)，量子點，含有或攜帶染料或熒光染料(fluorochrome)的聚合物(乳膠)顆粒，攜帶信號產(chǎn)生分子(包括酶)的聚合物、二氧化硅(silica)或其他顆粒，或無機晶體，例如升頻轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticle，UCNP)。用作示蹤物質(zhì)或載體的顆粒通常在納米范圍內(nèi)，通常為2nm至200nm，但是在一些情況下也可使用高至100μm的更大顆粒。分別附著于固相和示蹤物質(zhì)的生物標志物特異性分子可以是例如抗體，其將與靶生物標志物特異性結合，后者然后稱為抗原?？贵w的常用替代物包括核酸探針、親和素/鏈霉親和素、凝集素和適配體以及將識別和特異性結合于配體(即，分析物或分析物的一部分)的限定分子結構的任何(生物)受體。事實上，自然界中所有蛋白質(zhì)中的大部分或多或少地與一些配體特異性相互作用，所述配體可以是大分子的限定結構或小分子。通常來說，結合的特異性和親和力越高，受體配體系統(tǒng)越適合于設計分析測定。為了定量固相-生物標志物-示蹤物質(zhì)復合體(在下文中也稱為可定量珠復合體)，示蹤物質(zhì)必須表現(xiàn)出某些允許鑒定和測量的特性。光學讀出系統(tǒng)通常特別方便，因為檢測器可置于測定裝置外面。光學示蹤物質(zhì)的特性包括通過透射比或反射比測量的光吸收、光散射以及光衍射和發(fā)光現(xiàn)象，如化學發(fā)光、熒光、升頻轉(zhuǎn)換磷光(upconversion phosphorescence)等，包括其組合。在測量顏色、發(fā)光(例如熒光和磷光)、衍射、等離子體效應等時，通常涉及這些現(xiàn)象。

在大部分異質(zhì)型分析測定中，首先允許靶生物標志物與固相和過量的示蹤物質(zhì)反應。然后，通過洗滌除去未與固相特異性結合的示蹤物質(zhì)。

為了使靶生物標志物分別結合于固相和示蹤物質(zhì)，其將必須直接互相作用。利用高親和力黏合劑，反應物(即，生物標志物、固相和示蹤物質(zhì))相互作用或碰撞越頻繁，結合反應越快。因此，為了獲得快速測定，應建立具有高親和力和特異性結合物質(zhì)的非常高的局部濃度的反應條件。為了建立這樣的條件，固相應暴露擠滿特異性高親和力受體分子的大表面積。同樣地，攜帶第二組特異性和高親和力受體分子的示蹤物質(zhì)應以高濃度存在。納米顆粒和微顆粒的懸液暴露大的表面積體積比，類似于多孔結構，例如多孔膜。應當應用將進一步促進所涉及反應物之間的碰撞的流控運動。這樣的運動可以通過溫和加熱和攪拌來獲得，但是更優(yōu)選通過使樣品和試劑(在非競爭性測定的情況下，包括示蹤物質(zhì))通過/流過固相來獲得。因此，在設計高效的結合測定中，流過固相材料如多孔膜、微通道、微柱結構或堆疊顆粒的液體是優(yōu)選的。

與前段中的討論相同的考慮同樣好地適用于競爭性異質(zhì)測定。在這樣的測定中，固相暴露擠滿結合和標記的生物標志物的大表面積。

由于若干原因，球形微顆粒和納米顆粒作為固相材料通常是優(yōu)選的：

·顆粒具有非常大的表面積體積比

·顆粒以批次高效官能化，因此可以混合形成均勻懸液。

·顆粒懸液可以以等分試樣分配，所述等分試樣可直接以液體形式使用，或者可以配制成干等分試樣，例如片劑或凍干球。

·顆?？梢载撦d有為顆粒添加獨特特征的材料，或者由所述材料制成。這包括獨特光學特征，例如光吸收、光散射、光發(fā)射度(發(fā)光)等，以及磁性、放射性、催化/酶特性、電化學特性和其他可測量特性。

·當懸浮時，顆?？梢栽谖⒘骺叵到y(tǒng)中運輸。

·顆?？梢耘c溶液中的樣品高效混合。

·可以通過重力、離心、過濾、磁力(磁性顆粒)或電力或其組合將懸液中的顆粒與溶液分離。

·根據(jù)顆粒相對于所述顆粒分散于其中的介質(zhì)的密度，顆粒可以沉積、保持懸浮或漂浮。

·顆?？梢灾苽涑蓡畏稚⒑屯耆蛐?，所述球形為多孔的或具無孔的光滑固體表面。

·顆?？梢远逊e或堆疊在多種容器(包括柱)中。

·顆?？梢允遣煌该鞯?有色的)或基本上透明的，允許與多種基于光的測量系統(tǒng)相容并在其中使用。

·當緊湊的單分散顆粒堆疊在過濾器上，如在柱中，其可以形成具有規(guī)則的和限定的間隔的多孔晶格結構。液體可以以受控的和可再現(xiàn)的方式流過這樣的柱。

使分析物和任選的示蹤物質(zhì)(在非競爭性測定的情況下)與附著在固相顆粒表面的固定的捕獲分子相互作用的最高效方式是將顆粒以柱的形式堆積在過濾器或狹縫上，并且允許含有分析物和/或試劑(如示蹤物質(zhì))的溶液通過顆粒的柱。這可以按順序并且在重復步驟中進行，或者可以通過應用分析物和示蹤物質(zhì)兩者的混合物并且使其在一個步驟中通過。

在反應步驟或結合步驟之后，將溶液與固相分離并且洗滌固相以除去剩下的過量示蹤物質(zhì)、標記的未結合分析物(在競爭性測定中)等，以獲得一致和準確的分析。

從使用微流控芯片的分析方法知道了使用珠柱以獲得珠與多種示蹤物質(zhì)和/或分析物之間的高效相互作用。

US 2009/0104077A1公開了在微流控芯片中進行ELISA測定(酶聯(lián)免疫吸附測定)的方法。所公開的微流控芯片具有流體回路，其包含填充有作為固相的珠的柱結構。ELISA型反應通過首先形成珠-生物標志物-酶標記抗體復合體來在柱結構中的珠上進行。然后通過施加離心力使洗滌液流過柱來除去過量的酶標記抗體。所述方法的重要特征是使相同洗滌流體再循環(huán)通過所述柱多次以獲得改善的洗滌步驟的能力。在清潔或洗滌步驟之后，將生色物質(zhì)施加到酶標記的復合體中，并且產(chǎn)生的顏色可以例如在柱結構中測量。柱結構的至少一端結束于受限通道，防止固相珠從柱中流出。

WO 2011/081530 A1公開了用于分析測試樣品(例如，生物樣品，如全血)的處理盒(processing cartridge)(即，流控或微流控芯片)。所述盒適用于離心分析儀器。所述盒可包含描述為捕集器(trap)的特定流體回路元件。這樣的元件用于形成固相顆粒(珠)的柱，其中在流體流過所述柱的同時顆?？梢员Ａ?。通過相對于盒適當?shù)馗淖兪┘拥碾x心力的方向，含有與固相顆粒反應的多種反應物(例如生物標志物和示蹤物質(zhì))的流體重復地通過柱。捕集器的設計避免了使用過濾器或狹窄流體路徑來獲得顆粒或珠的柱。通過重復洗滌顆粒來獲得除去過量試劑。因此，通過引用并入了捕集器及其使用的描述，以及具有流體回路的微流控芯片的理念，其中包含分析物和多種任選試劑和溶劑的樣品通過所述回路的移動可以通過使用離心力來實現(xiàn)。

在另一些測定系統(tǒng)中，使用鐵磁性顆粒作為固相以有助于洗滌或分離步驟。然后臨時用磁鐵將顆粒拉到反應容器的一個壁并且在其與液體分離時扣留它們。當反應容器遠離磁鐵時，顆粒自由地重懸在溶液中。但是，磁性顆粒由于含有鐵磁性材料而是光學致密的，因此將顯著熄滅光學讀出。由于這個原因，鐵磁性顆粒不適合在測定中與結合于顆粒的示蹤物標記組合使用。

在樣品分析的技術領域中，例如生物標志物的分析中，在測定中固定固相和可移動的固相兩者的使用均是已知的。本發(fā)明尤其涉及在具有流體回路的微流控芯片(即，處理盒)中使用這樣的測定，可使用離心力使包含分析物和多種任選試劑和溶劑的樣品通過所述回路。這樣的微流控芯片公開在例如Schultz等.Clin.Chem.1985，31，1457、美國專利no.488763以及上述專利申請US 2009/0104077 A1和WO 2011/081530 A1中。

在異質(zhì)型分析測定中，過量未結合示蹤物質(zhì)與結合于固相的示蹤物質(zhì)的高效和可再現(xiàn)分離(洗滌)對于可靠的分析結果是必要的。在高靈敏度分析中，高效的洗滌特別重要。

與具有光滑表面的固相如在孔壁、微柱或球形顆粒上可得到的那些相比，具有多孔結構的固相如多孔膜更難以高效地洗滌。但是，包含緊密堆積成柱的球形顆粒(例如，珠)的固相在高效和可再現(xiàn)洗滌方面具有與多孔膜中遇到的那些相同的一些困難。堆積的柱中珠的緊密相互作用提供了臨時多孔結構(即，由于珠之間形成的空隙)，其中未結合的示蹤物質(zhì)(即，未結合至固相的示蹤物質(zhì))容易以非特異性方式捕獲在所述臨時多孔結構中。在現(xiàn)有技術中，通過使洗滌液通過柱來洗滌這樣的柱。但是，即使將這樣的洗滌重復多次(參考US 2009/0104077A1的公開內(nèi)容)，至少一些未結合的示蹤物質(zhì)將保持捕獲在多孔結構中并隨后對測定的再現(xiàn)性和靈敏度具有不利影響。

本發(fā)明涉及分離不同密度的珠的方法。當用于異質(zhì)分析測定中時，所述方法可例如提供以順序或平行方式分析來自同一樣品的多種分析物的可能性。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了分離珠的方法，其允許在流控或微流控芯片中分析來自同一樣品的多種分析物。所述方法通過所附權利要求書和下文中限定：

本發(fā)明提供了在包含內(nèi)部流體回路的流控芯片中分離珠的方法，其中多種反應物通過所述流體回路的移動可以通過使用離心力來實現(xiàn)，其中至少一種反應物是珠，所述方法包括以下步驟：

a)在所述流體回路的節(jié)段中至少提供密度為m1的第一組珠和密度為m2的第二組珠，所述節(jié)段包含至少第一出口；

b)在所述節(jié)段中提供第一液體介質(zhì)，所述液體介質(zhì)的密度為d3，使得m1＜d3＜m2；以及

c)施加第一離心力，使得所述第一組珠和所述第二組珠在所述節(jié)段內(nèi)沿相反方向移動。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，第二組珠，任選地在施加相對于所述節(jié)段具有不同于所述第一離心力的方向的第二離心力之后，朝向設置在所述節(jié)段中的顆粒保持元件(particle retaining element)移動，在所述顆粒保持元件上形成第二組珠的層。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

d)在所述節(jié)段中提供第二液體介質(zhì)，所述第二液體介質(zhì)的密度為d4＜m1、m2；以及

e)施加離心力，使得所述第一組珠朝向所述第二組珠移動，提供堆疊在相鄰層中的第一組珠和第二組珠。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，在步驟a)中提供第三組珠，其密度為m3＜d3、d4。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

f)在所述節(jié)段中提供第三液體介質(zhì)，所述第三液體介質(zhì)的密度為d5＜m1、m2、m3；以及

g)施加離心力，使得所述第三組珠朝向所述第一組珠移動，提供堆疊在相鄰層中的第一組珠和第三組珠。

在所述第一組珠已經(jīng)朝向所述第二組珠移動之后提供所述第三組珠。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

○施加離心力，使得在所述節(jié)段中提供的液體介質(zhì)流過所述顆粒保持元件以獲得堆疊在相鄰層中的所述第一組珠和所述第二組珠，或所述第一組珠和所述第三組珠。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一組珠朝向所述節(jié)段的所述第一出口移動。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

○通過改變離心力的方向?qū)⑺龅谝唤M珠轉(zhuǎn)移出所述節(jié)段，而所述第二組珠保持在所述節(jié)段中，優(yōu)選使得通過所述第一出口傾析所述第一組珠。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述節(jié)段包含第二出口，所述方法包括以下步驟：

○改變所述的離心力的方向，使得所述第一組珠通過所述第一出口轉(zhuǎn)移，而所述第二組珠通過所述第二出口轉(zhuǎn)移。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

○向所述節(jié)段提供第二液體介質(zhì)，所述液體介質(zhì)的密度為d4＞m2；以及

○施加離心力，使得所述第二組珠在與所述離心力的方向相反的方向上移動。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟：

○通過改變所述離心力的方向?qū)⑺龅诙M珠轉(zhuǎn)移出所述節(jié)段，優(yōu)選地使得通過所述第一出口傾析所述第二組珠。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述節(jié)段包含分離節(jié)段和堆疊節(jié)段。

在根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，所述堆疊節(jié)段在第一端與所述分離節(jié)段相連，并且在第二端包含顆粒保持元件。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，步驟c)在所述分離節(jié)段中進行。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第二離心力相對于所述節(jié)段的方向不同于所述第一離心力的方向。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述流控芯片是微流控芯片。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述流控芯片設置在離心機中，所述離心機能夠提供相對于所述節(jié)段具有可變方向的離心力。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第二組珠中的珠是二氧化硅珠，優(yōu)選惰性二氧化硅珠。惰性二氧化硅珠不與流體回路中存在的其他反應物或珠偶合或形成復合體。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述顆粒保持元件是過濾器。也可以使用其他類型的顆粒保持元件，例如流體回路中的彎曲(任選地填充有合適的過濾材料)。

在根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，反應物包含含有一種或更多種分析物的樣品。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中兩(或更多)組珠完全或部分混合，在第一步驟中，密度分別為m1和m2的珠組在密度為d3液體中通過離心力(或重力)分離，其中m1＜d3＜m2，然后可通過合適的顆粒保持裝置排出密度為d3的液體和/或通過將液體的密度從d3改變成d4使所述兩(或更多)組珠在彼此頂部堆疊在不同層中，其中m1＜m2＜d4。

第一、第二和第三液體介質(zhì)可以按原樣提供，或者可以通過將高密度或低密度液體添加到或?qū)⒏呙芏裙腆w溶解在已經(jīng)存在于該節(jié)段中的液體介質(zhì)中來獲得所需的密度。換句話說，當提供一定密度的液體介質(zhì)時，不一定需要向該節(jié)段添加液體介質(zhì)，而是可以通過改變已經(jīng)存在于該節(jié)段中的液體介質(zhì)的密度來提供。

在所有方面，本發(fā)明方法中使用的流控芯片可有利地為微流控芯片。但是，在一些情況下，預期體積在ml范圍的流控芯片可以是優(yōu)選的。

附圖簡述

圖1a-1k是示出了在適合與本發(fā)明一起使用的分析方法中使用的步驟的示意圖。

圖1l-1p是示出了用于在微流控回路中移動珠的發(fā)明構思的示意圖。所述構思可有利地與根據(jù)本發(fā)明的方法組合。

圖2a-2b是示出了本發(fā)明的第一實施方案的示意圖。

圖3a-3h是示出了本發(fā)明的第二實施方案的示意圖。

發(fā)明詳述

術語定義

在本申請中，術語“流控芯片”旨在涵蓋包含內(nèi)部流體回路的任何類型的芯片或盒，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應物通過所述內(nèi)部流體回路的移動可以通過使用離心力來實現(xiàn)。多種反應物可以與液體介質(zhì)一起和/或在液體介質(zhì)內(nèi)在流體回路中移動。

本發(fā)明上下文中使用的術語“分析物”應理解為包括可在根據(jù)本發(fā)明的方法中定量或定性地測定的任何化合物。特別地，術語“分析物”旨在包括可用作生物體(優(yōu)選人體)的特定疾病狀態(tài)或一些其他生理狀態(tài)的指示物(即，生物標志物)的任何化合物。生物標志物可例如是貧血的生物標志物，例如紅細胞生成素(EPO)鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTrR)、葉酸(葉酸鹽)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、維生素B12；骨疾病的生物標志物，例如堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素、甲狀旁腺激素(PTH)、骨特異性堿性磷酸酶(BSAP)、1，25二羥基維生素D、C末端I型膠原蛋白端肽(CTx)、25羥基維生素D、N末端I型膠原蛋白端肽(NTx)；心臟病的生物標志物，例如載脂蛋白E(Apo E)、腦鈉肽(BNP)、LDH、CK、CKMB、Pro-B型利尿鈉肽(Pro-BNP)、C反應蛋白(CRP)、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、CRPh(超靈敏)；糖尿病的生物標志物，例如C肽、HbA1c、IA-2抗體、胰島素、果糖胺、胰島素生長因子(IGF-1)、胰高血糖素、微量白蛋白、葡萄糖、前胰島素、抗體；與內(nèi)分泌學有關的生物標志物，例如甲胎蛋白(Alpha-Foetoprotein)、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長釋放因子(GRF)、皮質(zhì)酮、催乳素、皮質(zhì)醇、睪酮、卵泡刺激素(FSH)；與胃腸病有關的生物標志物，例如胃泌素、脂肪酶；與感染性疾病有關的生物標志物，例如抗Borrelia、抗Rubella、抗HBs、抗HBc、抗Anti-HBe、抗HCV、抗HIV I/II以及感染原的其他抗體，以及作為感染原的一部分的特定抗原，例如HIV-p24、HBsAg等；與炎癥/免疫力有關的生物標志物，例如免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgE、IgD及其子類)、簇集素(載脂蛋白J)、C反應蛋白(CRP)、CRPh(超靈敏)、前降鈣素(PCT)、肝素結合蛋白(HPB)、鈣防衛(wèi)蛋白、人中性粒細胞脂質(zhì)運載蛋白/中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(HNL/NGAL)、內(nèi)皮肽-1、纖維蛋白原、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、IFNγ誘導的單核因子(MIG/CXCL9)、IFN-α、新蝶呤、IFNγ(IL-2、IL-4、IL-10)-4-plex、IL-10、IL-10(IL-2、IL-4、IFNγ)-4-plex、IL-1β、Rantes/CCL5、IL-2(IL-4、IL-10、IFNγ)-4-plex、IL-4(IL-2、IL-10、IFNγ)-4-plex、腫瘤生長因子(TGF-β1)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNFα)、IL-8；與脂類代謝有關的生物標志物，例如載脂蛋白AI(Apo AI)、膽固醇、載脂蛋白AII(Apo AII)、HDL-膽固醇、載脂蛋白B-100(Apo B)、LDL-膽固醇、載脂蛋白B48(Apo B48)、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)、載脂蛋白CII(Apo CII)、對氧磷酶(PON1)、載脂蛋白CIII(Apo CIII)、磷脂酰肌醇聚糖F(PIGF)、載脂蛋白E(Apo E)、甘油三酯；與腎臟學有關的生物標志物，例如α-GST、β-2-微球蛋白(血清)、微量白蛋白、β-2-微球蛋白(尿)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、肌酸酐；與腫瘤學有關的生物標志物，例如糖類抗原19-9(CA19-9)、前列腺特異性抗原(PSA)、致癌胚胎抗原(CEA)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGFb)；以及與甲狀腺病癥有關的生物標志物，例如抗甲狀腺過氧化物酶Ab(TPO)、促甲狀腺激素(TSH)、抗甲狀腺球蛋白Ab、總甲狀腺素(T4)、游離甲狀腺素(FT4)、總?cè)饧紫僭彼?T3)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、TSH受體Ab和甲狀腺球蛋白。

術語“示蹤物質(zhì)”旨在涵蓋能夠與目標分析物(例如，生物標志物)或珠(術語珠在下文中定義)結合，并且表現(xiàn)出使得其通過分析化學/生物學領域中常見的任何合適的技術可定量或可鑒定(即，其可以通過光學、磁性、電學或輻射檢測)的特性的任何物質(zhì)。特別感興趣的特性是能夠光學檢測的那些，例如示蹤物質(zhì)可吸收和/或散射光，例如發(fā)色團，或者表現(xiàn)出發(fā)光特性，例如熒光或磷光，或者示蹤物不是直接光學可檢測的，但是能夠與另外的物質(zhì)反應以提供光學可檢測的反應產(chǎn)物。適合與目標分析物(例如，生物標志物)或珠結合的示蹤物質(zhì)的結合部分包括例如蛋白質(zhì)、核酸、糖類和螯合化合物。特異性結合部分包括抗體、抗原、核酸探針或其他生物特異性受體配體系統(tǒng)。

適合于本發(fā)明方法使用的示蹤物質(zhì)的實例包括含納米顆粒(優(yōu)選基于金屬的納米顆粒)和酶的那些。示蹤物質(zhì)納米顆粒的直徑通常為3至100nm。優(yōu)選的納米顆粒包括基于金屬的顆粒，例如金(ρ＝19.3g/cm³)、銀(ρ＝10.5g/cm³)或鐵(ρ＝7.9g/cm³)膠體，以及無機晶體，例如升頻轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP，ρ通常為4至5g/cm³)。

使用基于金屬的納米顆粒作為示蹤物質(zhì)是公知的，對于金納米顆粒的綜述，參見例如S.Zeng等；″A review on functionalized gold nanoparticles for biosensing applications″.Plasmonics 6(3)：491-506。

對于適合于本發(fā)明方法使用的UCNP的綜述，參見例如Cheng等.Nanoscale，2013，5，23和Ang等.Nanomedicine，2011，6，1273。

使用熒光團作為示蹤物質(zhì)綜合地參考例如Life Technologies^TM的The Molecular Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies。

其他本身非光學可檢測的物質(zhì)也可用作示蹤物質(zhì)。例如，當本發(fā)明方法用于進行ELISA型測定時，所得珠-分析物-示蹤物質(zhì)復合體的最終分析不依賴于示蹤物質(zhì)的直接光學檢測，而是依賴于示蹤物質(zhì)上的酶與合適的底物之間反應的反應產(chǎn)物(提供顏色或熒光或電化學信號)。

合成合適的示蹤物質(zhì)的方法的實例全面公開在現(xiàn)有技術中，獲得適合于本發(fā)明方法的示蹤物質(zhì)也是合成化學或生物化學領域技術人員周知的。

術語“珠”旨在涵蓋任何類型的固相顆?；蛑?，優(yōu)選球形微米顆?；騺單⒚最w粒，直徑為0.1至50μm、0.5至50μm，優(yōu)選直徑為2μm至20μm。這些顆?？梢允嵌嗫椎幕蛘呔哂泄饣腆w表面。其可以是緊實的或具有包圍珠內(nèi)的一個或更多個中央核心材料的一個或更多個殼，中央核心材料可以是固體材料、液體或氣體。珠可以是不透明的或透明的。優(yōu)選地，珠是基本上透明的并且由體積質(zhì)量密度(ρ)稍微高于水密度(ρ＝1.0g/cm³)的聚合物制成。通常來說，珠由聚苯乙烯(ρ＝1.05g/cm³)、聚甲基丙烯酸甲酯(ρ＝1.18g/cm³)或其他合適的材料制成。在本分離方法中，珠(或者至少一組珠)可有利地由玻璃(即二氧化硅珠)制成，其可具有2.4-2.8g/cm³的顯著更高的密度。另外，珠可包含能夠與目標分析物或示蹤物質(zhì)結合的多個共價偶聯(lián)的分子結構或?qū)嶓w。這樣的分子結構或?qū)嶓w可以是例如抗體或其片段、核酸、適配體、螯合結構、展示分析物的結合基序的合成分子結構等。在本公開內(nèi)容中，在競爭性測定的情況下珠也可包含確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元(即，由結合于示蹤物質(zhì)的分析物組成的單元)。在這一點上，術語“確定量”旨在表示珠被標準化以提供已知的分析結果或信號。通過在與來自樣品的競爭性分析物相互作用之后分析珠(其最初具有確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元)并且將分析結果與所述已知分析結果相比較，可以測定/測量所述分析物。

本公開內(nèi)容中的術語“可定量珠復合體”旨在意指通過珠與分析物或者在一些測定中珠與示蹤物質(zhì)之間的相互作用形成的復合體。后者在競爭性測定類型中形成，其中珠與分析物競爭與示蹤物質(zhì)結合。通常來說，復合體包含珠、分析物和示蹤物質(zhì)。不論測定類型，可定量珠復合體的定性和/或定量分析將提供對來自樣品的待測定分析物的間接的定性和/或定量分析。根據(jù)進行的測定的類型，可定量珠復合體的具體結構將不同。例如，在非競爭性測定中，復合體將理想地包含珠，其中珠僅結合于至少一個分析物-示蹤物質(zhì)單元，而在競爭性測定中，復合體可包含與分析物-示蹤物質(zhì)單元和來源于樣品的不具有示蹤物質(zhì)的分析物二者結合的珠。僅根據(jù)測定類型，可定量珠復合體的另外的變體也是可能的。在大部分測定中，可定量珠復合體也可稱為可定量珠-分析物復合體(即，所述復合體包含結合分析物的珠)。

本公開內(nèi)容中的術語“夾心復合體”旨在意指包含珠、分析物和示蹤物質(zhì)的復合體。“夾心復合體”通常是可定量珠復合體，但是該術語在與競爭性測定相結合時也可表示包含上述確定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元的珠。

術語d、d1、d2等旨在表示給定液體介質(zhì)以g/cm³為單位的體積質(zhì)量密度。

術語m、m1、m2等旨在表示給定固體材料以g/cm³為單位的體積質(zhì)量密度。

術語“液體介質(zhì)”旨在涵蓋適合用于進行特定測定的任何液體。技術人員容易理解特定液體介質(zhì)在特定測定中的合適性。另外，任何液體的所需體積質(zhì)量密度可通過溶解在所述液體中或與所述液體混合的添加劑來改變。這適用于任何類型的所涉及材料，例如多種物質(zhì)、鹽、液體或氣體，只要它們會適當?shù)鼗旌虾腿芙饧纯伞Ｃ芏鹊母淖兣c所涉及物質(zhì)的濃度和相對密度有關。具有不同于溶劑的密度的所有可溶性化合物將影響溶液/液體的密度。通常來說，海水具有比純凈淡水(1.00g/cm³)更高的密度(表面1.025g/cm³)。多種物質(zhì)用于改變水溶液的密度，特別是在密度梯度離心的領域。這些包括例如蔗糖、蔗糖聚合物、多種包被的膠體和氯化銫的物質(zhì)，以及多種含碘物質(zhì)，例如碘克沙醇、碘海醇、甲泛葡胺等易于以高濃度溶于水的物質(zhì)。

在本申請的情況中的術語“反應物”旨在作為分析方法中存在的組分的一般術語，例如分析物、示蹤物質(zhì)或珠上的結合分子實體。

術語“干燥制劑”是指可并入到用于運行測定的裝置中的包含珠和納米顆粒的制備物的試劑。這些干燥制劑可通過真空干燥或通過冷凍干燥制備。冷凍干燥制劑制備成尺寸為小于1μL至200μL的均勻球形等份。這些可以成批生產(chǎn)然后逐個分配到分析裝置中。

適合與本發(fā)明組合使用的分析方法的一般原理

本發(fā)明涉及用于在流控或微流控芯片或盒中分離不同密度的珠或固相顆粒的簡單方法。所述分離方法可有利地與分析測定(例如下文中所述的分析測定)組合。在所公開的分析方法中，第一溶液中的反應物與附著于固相顆粒表面的反應物之間的非常高效的相互作用與通過使用第二溶液使其懸浮來對固相顆粒非常高效的洗滌相組合。

固相顆粒是微型珠(micro-sized bead)或球形顆粒。

溶液中的和附著于固相顆粒表面的反應物將根據(jù)所進行的測定的類型而變化。

在夾心型非競爭性免疫測定中，溶液中的反應物將是分析物(例如存在于生物樣品中的一些類型的生物標志物)和示蹤物質(zhì)(例如對特定生物標志物具有選擇性的標記抗體)。所述反應物可以在與固相顆粒相互作用之前混合，即同時施用或作為預先形成的分析物-示蹤物質(zhì)單元施用，或者依次施用(即，在施用示蹤物質(zhì)之前將分析物附著在固相顆粒上)。固相顆粒表面上的反應物將是能夠結合分析物和/或分析物-示蹤物質(zhì)單元的分子結構(例如抗體)。

在競爭性免疫測定中，溶液中的反應物可以是樣品中存在的分析物與通過樣品分析物從珠替換的一定量的分析物-示蹤物質(zhì)單元的混合物。固相顆粒(即珠)表面上的反應物將包含能夠結合樣品中存在的分析物的分子實體或結構(例如抗體)，并且其中分子結構最初與分析物-示蹤物質(zhì)單元鍵合。

為了獲得高效的相互作用，固相顆粒緊密地堆積成結構例如柱。這優(yōu)選通過使固相顆粒保持在測定裝置(例如流控或微流控芯片)中的流體回路的節(jié)段或腔中來實現(xiàn)。該節(jié)段或腔可以有利地是大致柱狀，但是其他形狀或形式也是合適的。固相顆粒優(yōu)選通過設置在流體回路的節(jié)段或腔中的顆粒保持元件(例如過濾元件)保留在腔中。WO2011/081530A1中公開的捕集器是用于提供包含顆粒保持元件而不需要使用過濾元件的腔的替代解決方案。

過濾元件被設計或選擇為具有不允許固相顆粒從其通過的孔徑或狹縫尺寸。通過施加離心力將液體溶液從固相顆粒柱或顆粒懸液中除去，離心力從柱的與過濾元件相對的一側(cè)作用并朝向所述元件。以這種方式，迫使液體溶液通過固相顆粒柱和過濾器結構?？梢酝ㄟ^改變離心力相對于柱的角度或通過改變顆粒保持元件的流動阻力來控制通過堆疊的珠的流動。

可以使用控制通過過濾器的液體出口的閥來控制通過過濾器的液體流。當液柱基本上平行于包含固相顆粒的柱狀腔浸入時，這可作為替代地通過控制施加到出口液體的反壓力來實現(xiàn)。然后可以通過相對于離心力改變測定裝置(例如流控或微流控芯片)的取向從顆粒中除去液體。

為了獲得固相顆粒的高效洗滌，通過添加第二液體溶液使顆粒懸浮。第二液體溶液具有高于固相顆粒的體積密度的密度。當暴露于離心力時，固相顆粒將在該液體中從其柱狀結構開始解體(unpacking)，并通過漂浮朝向最接近離心軸的高密度液體的表面移動。通過這種方式，在溶液中的反應物與固相相互作用期間，固相顆粒將在其朝向表面的路徑上分散在溶液中，并且還從任何未結合的示蹤劑試劑(例如未結合的示蹤物質(zhì)或未結合的分析物-示蹤物質(zhì)單元)和捕獲在堆積的固相顆粒的柱狀結構中其他可溶性或可分散的組分中分離。當通過過濾從柱狀腔排出第二液體溶液時，通過漂浮獲得的固相顆粒在第二液體溶液中的分散將由此允許這些顆粒的高效洗滌。

當這些后者材料包含具有比第二液體更高的密度的顆粒時，可以進一步促進“低密度”固相顆粒和其他可分散材料之間的分離。這些顆?？梢允歉呙芏燃{米顆粒，例如具有比第二液體更高的密度的金屬膠體或聚合物微粒。在這種情況下，具有比第二液體高的密度的顆粒被從離心軸拉離，而低密度顆粒朝向旋轉(zhuǎn)軸移動。分離程度將取決于涉及的組分和液體的密度的差異、顆粒的尺寸、施加的離心力和離心時間。

因此，通過改變圍繞顆粒的溶液的密度來使堆積的固相顆粒懸浮。當該溶液(即第二液體溶液)的密度高于顆粒本身的密度時，所述顆粒將漂浮，即沿與施加的重力或離心力的方向相反的方向移動。當離心力作用在比圍繞它們的液體更低的密度的顆粒上時，其將逐漸移動到最接近離心中心的溶液的表面，而比液體更高密度的組分將傾向于沉積，即移動到溶液的離離心中心最遠的體積。通過在進行測定的結合步驟之后使固相顆粒懸浮獲得的主要優(yōu)點是，由于通過將固相顆粒堆積成柱獲得的多孔結構而以非特異性方式截留或捕獲的任何過量的示蹤物質(zhì)被釋放，因此更容易除去。

通過這種方式，例如，比液體具有更高密度的示蹤物質(zhì)可以高效地從比液體更低密度的組分中分離。然后，包含分散在液體中的較高密度組分的液體可以通過濾器排出，而固相顆粒將在到達過濾器時停止。固相顆粒的重復洗滌步驟可以通過重復的再懸浮和排出步驟進行。

具有高于固相顆粒的密度的示蹤物質(zhì)是有利的，但是當示蹤物質(zhì)具有與固相顆粒相等或更低的體積密度時，堆積成柱的固相顆粒的再懸浮也將提供大大改進的洗滌步驟。在后一種情況下，如上所討論的，示蹤物質(zhì)仍然從多孔結構釋放，因此當?shù)诙后w溶液通過過濾元件排出時，更容易從固相顆粒中除去。

該方案提供了用于洗掉過量的示蹤物質(zhì)的簡單方式。

在芯片實驗室裝置(即微流控芯片、處理盒等)中使用固相顆?；蛑榈牧硗獾膬?yōu)點是，在整個測定中，懸液中的珠可轉(zhuǎn)移到裝置中的不同位置/部位。這可以包括將顆粒流控轉(zhuǎn)移到流體回路的先前沒有被示蹤物質(zhì)污染的腔或節(jié)段和/或?qū)ｉT設計用于各步驟的優(yōu)化功能的腔中。這可以例如允許首先在優(yōu)化用于存儲的腔中具有珠，然后將珠轉(zhuǎn)移到優(yōu)化用于快速相互作用的腔(即，柱狀結構)中，然后將珠轉(zhuǎn)移到優(yōu)化用于洗滌的腔中，進一步到優(yōu)化用于讀出的腔中，并且最終轉(zhuǎn)移到用于廢物存儲的腔中。

如所描述的，用于分析樣品的裝置可以是特別設計用于根據(jù)特定程序?qū)悠泛驮噭﹥烧哌M行微流控處理的微流控芯片或盒。這些盒通常由通過泵、閥、離心力或其他物理裝置處理盒內(nèi)的流體的儀器運作。特別地，本發(fā)明涉及通過離心力或重力在微流控芯片內(nèi)運作的測定系統(tǒng)。

本發(fā)明公開了用于分離不同密度的珠或固相顆粒的高效方法。該構思允許多種分析物和珠在同一時間相互作用，隨后容易地分離不同的所得可定量珠復合體。下面進一步描述本發(fā)明。

當不同密度的兩個或多個組(或群)的珠在低密度溶液中部分或完全混合時，可使用本發(fā)明的分離方法。通過引入具有比“低密度”珠組更高的密度但是比“高密度”珠組更低的密度的液體，“低密度”珠組將“漂浮”，而“高密度”珠組將沉積。然后可以通過傾析分離珠/顆粒組?；蛘撸ㄟ^使“高密度”液體通過顆粒保持元件(或過濾元件)排出或用“低密度”液體稀釋“高密度”液體，然后“低密度”珠將完美堆疊在“高密度”珠的頂部(接近離心軸)。這種珠在兩個或更多個層中的不同堆疊將允許從不同的珠層讀取不同的分析物和/或示蹤物。一個或多個組中的珠可以是不結合分析物和/或示蹤劑的“惰性”珠。這些惰性珠可以用作攜帶分析物和/或示蹤劑的珠組之間或在顆粒保持元件(過濾元件)和攜帶分析物和/或示蹤劑的珠組之間的間隔物。這有利于將攜帶分析物和/或示蹤劑的珠與流體回路的任何污染區(qū)域(例如顆粒保持元件(即過濾器或過濾材料))分離并優(yōu)化讀出。

本申請還公開了發(fā)明構思，由此珠可以通過以下方式從一個腔高效地轉(zhuǎn)移到另一個腔的：使用具有比珠更高的密度的液體通過傾析，從而將漂浮在液體的上級分中的珠，即已經(jīng)在朝向產(chǎn)生離心力的旋轉(zhuǎn)軸線的方向上移動(或漂浮)的珠，轉(zhuǎn)移到另一個腔。下面進一步描述該構思。

本發(fā)明和發(fā)明構思二者可有利地與上述分析方法組合，但是不以任何方式限于這樣的使用。

適合與本發(fā)明的分離方法一起使用的優(yōu)選分析方法的詳述

在圖1a-k中示出了分析方法的示意圖。該方法旨在用于針對一種或更多種目標分析物分析樣品。所述方法適用于可以溶解在液體中的任何類型的樣品，以及還用于檢測/定量所述樣品中的任何類型的化合物或物質(zhì)，對于所述樣品可以提供用于進行此類分析的測定。

在下文中，假定樣品是生物樣品，并且目標化合物或物質(zhì)優(yōu)選是生物標志物，并且可以是蛋白質(zhì)(抗原、酶、抗體)、核酸、藥物、激素、營養(yǎng)物、代謝物、微生物、細胞或可在包括一種或更多種選擇性結合劑的測定中測量的任何此類分子或分子集合。該方法基于使生物標志物與固相顆粒(即微型珠、球形顆粒等)反應的公知原理，其中固相顆粒包含能夠與生物標志物結合的分子結構或?qū)嶓w。如果生物標志物是抗原的話，合適的分子實體是例如抗體。除了固相顆粒和生物標志物之外，必須存在示蹤物質(zhì)。示蹤物質(zhì)的特征為能夠結合生物標志物的分子實體。

固相顆?；蛑槿缟纤x。

示蹤物質(zhì)如上所定義。

典型的異質(zhì)免疫測定的第一步驟由使包含待定量或鑒定的生物標志物的生物樣品與第一液體介質(zhì)中的珠和/或示蹤物質(zhì)相互作用、接觸、孵育、沖洗或混合，參見圖1a-e。在這種情況下建立了夾心型構型，其中靶生物標志物作為固相顆粒與示蹤物質(zhì)之間的連接體。這些相互作用可以以兩種順序依次進行，或者將所有涉及的反應物一起施加。優(yōu)選地，確定了在這些“夾心復合體”中生物標志物與示蹤物質(zhì)之間的固定化學計量比為1∶1。在非競爭性測定中，珠和示蹤物質(zhì)兩者都能夠結合生物標志物。示蹤物質(zhì)和固相顆粒可以攜帶多種生物標志物特異性受體，因此可與多種生物標志物分子結合。然而，通常來說，將測定設計為相對于生物標志物包含大量過量的示蹤物質(zhì)。在統(tǒng)計學上，每個生物標志物分子將因此僅與一個示蹤物質(zhì)結合。然而，每個微球珠暴露非常大的表面，并且可以結合許多靶生物標志物和隨后的示蹤物質(zhì)。

在用于原理說明的所示的該具體簡化實施方案中，在W形腔、流體回路或試管裝置1中進行測定。腔1包含第一出口2和第二出口3、入口4以及第一過濾元件5和第二過濾元件6。第一過濾元件5設置在入口4與第一出口2之間。設置在入口與第一過濾元件之間的節(jié)段形成柱結構7。所述節(jié)段或腔可以考慮包括出口16。箭頭G表示相對于腔或試管施加的離心力(或重力，盡管使用重力僅可提供顯著更慢的測定)的方向。腔1可以是流控或微流控芯片中的流體回路的一部分，例如在本公開內(nèi)容的背景技術部分中描述的現(xiàn)有技術中公開的微流控芯片。在這種情況下，腔可以被認為設置在垂直于微流控芯片外部的旋轉(zhuǎn)軸線的平面中。因此，通過圍繞所述軸線旋轉(zhuǎn)微流控芯片獲得所需的離心力G，并且可以通過旋轉(zhuǎn)微流控芯片本身來改變相對于微流控芯片中的腔的離心力的方向。

通過圖1a-e示出的特定測定是非競爭性測定。在這樣的測定中，可以任意選擇其中測定的多個組分相互作用、接觸或混合的順序，因為珠8和示蹤物質(zhì)9(參見圖1d)都以大量過量提供，并且它們在不存在中間生物標志物的情況下彼此不反應。此外，混合、相互作用或接觸(即結合步驟)可有利地包括使上述第一液體介質(zhì)通過由珠8形成的塞或柱，以確保珠、示蹤物質(zhì)9和生物標志物之間的反應盡可能完全。通過使珠堆積在柱狀腔7或體積中來獲得塞或柱。柱狀腔7可以優(yōu)選地是芯片實驗室裝置中的流體回路(即，微流控芯片或處理盒中的流體回路)的一部分。

在圖1a和1b中，懸浮在液體介質(zhì)中的珠通過入口4引入。液體介質(zhì)的密度低于珠的密度。珠的密度表示為m1g/m³。由于離心力G，珠將堆積成由柱狀腔7和第一過濾元件5限定的柱狀結構，參見圖1c。由于布置在所述腔的一端的第一過濾元件5，所述珠保留在柱狀腔中。過濾元件可以包含過濾器、格柵(grid)、篩、窄狹縫等，并且能夠防止珠從其通過。

在下一步驟中，參見圖1d，懸浮在包含生物標志物的液體介質(zhì)中的示蹤物質(zhì)9通過入口4引入。在該具體實施方案中，包含生物標志物的樣品在與珠相互作用之前已經(jīng)與示蹤物質(zhì)相互作用，樣品因此可形成其中懸浮示蹤物質(zhì)的液體介質(zhì)的一部分。從懸浮珠的液體介質(zhì)和懸浮示蹤物質(zhì)的液體介質(zhì)獲得的組合液體介質(zhì)具有低于珠的密度。組合液體介質(zhì)表示為第一液體介質(zhì)，并且所述液體介質(zhì)的密度表示為d1g/cm³。

使包含示蹤物質(zhì)和生物標志物以及通過示蹤物質(zhì)與生物標志物的相互作用形成的復合體的第一液體介質(zhì)通過堆積珠。當使第一液體介質(zhì)通過堆積珠時，形成包含珠、生物標志物和示蹤物質(zhì)的“夾心復合體”。過濾元件5使得示蹤物質(zhì)9和由示蹤物質(zhì)與生物標志物的相互作用形成的復合體可以通過，參見圖1d。第一液體介質(zhì)通過柱，并通過改變施加的離心力G的方向從W形腔1或試管中引出，參見圖1f-h。在一些作為替代的實施例中，可以例如使用位于第一過濾元件下方的閥將第一液體介質(zhì)從腔引出。

珠8、示蹤物質(zhì)9和生物標志物之間的相互作用的順序取決于在特定情況下哪種溶液是最合適的或合適的。因此，包含生物標志物的樣品可以是其中懸浮有示蹤物質(zhì)9的液體介質(zhì)的一部分，或其中懸浮有珠8的液體介質(zhì)的一部分。

在第一液體介質(zhì)單次通過堆積珠的柱之后，珠、示蹤物質(zhì)和生物標志物之間的相互作用可能不完全。有利地，通過再引入入口4使可包含未反應的示蹤物質(zhì)、生物標志物和通過示蹤物質(zhì)與生物標志物的相互作用形成的復合體(即分析物-示蹤物質(zhì)單元)的第一液體介質(zhì)重復通過堆積珠。這種再引入可以例如通過具有連接第一出口2與入口4的環(huán)結構(例如，形成為環(huán)的流體回路)來實現(xiàn)。當W形腔是芯片實驗室裝置中的流體回路的一部分時，后者的解決方案尤其有利。在再引入之后，可重復根據(jù)圖1e-h的步驟。

取決于測定設計和樣品中生物標志物的濃度，每個珠可以攜帶從無到數(shù)千的生物標志物-示蹤物質(zhì)復合體。由于在一個優(yōu)選實施方案中每個珠的體積顯著大于生物標志物-示蹤物質(zhì)復合體的體積，所以每個珠的許多生物標志物-示蹤物質(zhì)復合體的結合基本上不會影響珠的體積質(zhì)量密度。在一個典型的實例中，球形5μm(直徑)珠的體積接近于40nm示蹤物質(zhì)的體積的2百萬倍。

珠、示蹤物質(zhì)和生物標志物之間的相互作用提供了包含“夾心復合體”(即可定量的珠復合體)和未反應的示蹤物質(zhì)的堆積珠柱?！皧A心復合體”的密度表示為m2g/cm³。在相互作用期間，由于堆積珠形成的多孔結構，一些未反應的示蹤物質(zhì)9以非特異性方式被截留或捕獲。為了獲得靈敏且可再現(xiàn)的分析結果，盡可能多的未反應的示蹤物質(zhì)必須與珠和“夾心復合體”分離。在現(xiàn)有技術中，未反應的示蹤物質(zhì)的分離通過使洗滌液通過堆積珠柱而重復洗滌來進行。然而，如上所討論的，這樣的洗滌不會除去所有截留的未反應示蹤物質(zhì)，或需要過多和耗時的重復洗滌次數(shù)。

為了改善或甚至允許未反應的示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復合體”的分離，將第二液體介質(zhì)添加到堆積珠中，參見圖1i。第二液體介質(zhì)的密度為d2g/cm³，其中d2＞m1和m2。應當注意，當用于替代分析系統(tǒng)中時，其中通過傾析(即，不是通過使第一液體介質(zhì)通過過濾元件)除去第一液體介質(zhì)，第一液體介質(zhì)的小部分和第二液體介質(zhì)的組合的密度可以表示為d2′。然而，由于第二液體介質(zhì)與第一液體介質(zhì)的體積之間的高比值，d2′的數(shù)值將近似等于d2，即d2′＞m1和m2。

本分析方法的基本特征是第二液體介質(zhì)具有比珠和“夾心復合體”更高的密度。然后添加第二液體介質(zhì)將確保堆積珠柱崩解，使得珠之間的緊密相互作用被破壞。當珠之間的緊密相互作用被破壞時，截留/捕獲的未反應的示蹤物質(zhì)被釋放到第二液體介質(zhì)中。由于其相對于第二液體介質(zhì)的密度較低的密度，珠和“夾心復合體”將逆著施加的離心力G的方向移動遠離第一過濾元件5，參見圖1j。為了除去先前在堆積珠之間截留/捕獲的未反應的示蹤物質(zhì)，通過改變施加的離心力G的方向，將第二液體介質(zhì)通過第一出口2從W形腔或試管中引出，參見圖1k。在一些作為替代的實施方案中，可例如通過使用位于第一過濾元件5下方的閥從腔引出第二液體介質(zhì)。

使用不同密度的第一和第二液體介質(zhì)獲得的最重要的效果是，珠將“沉積”在d1＜m1的第一液體介質(zhì)中，同時它們將“漂浮”在d2＞m1的第二液體介質(zhì)中。術語“沉積”和“漂浮”用于描述珠在液體介質(zhì)中相對于所施加的離心力G的位置，即當珠“漂浮”時，它們沿與所施加的離心力G的方向相反的方向移動，術語“沉積”相反。

如果在除去第二液體介質(zhì)之后未反應的示蹤物質(zhì)的剩余量太高，可以使用第二液體介質(zhì)的新鮮等分試樣將根據(jù)圖1i-k添加和去除第二液體介質(zhì)的步驟(即洗滌步驟)重復所需次數(shù)。

如在根該具體分析方法中所示，示蹤物質(zhì)可以有利地具有n g/cm³的體積質(zhì)量密度，其中n＞m1、m2和d2。這樣的密度將確保當將第二液體介質(zhì)供應到珠時，過量的示蹤物質(zhì)將”沉積”，并且進一步促進示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復合體”的分離。在一個作為替代的實施方案中這可以是特別有利的，其中通過如上所述的傾析使珠移出柱狀腔。

然而，示蹤物質(zhì)不需要具有特定的密度。僅堆積珠柱崩解使得珠之間的緊密相互作用被破壞的事實將確保當除去第二液體介質(zhì)時實現(xiàn)過量示蹤物質(zhì)的改善的去除。除了體積質(zhì)量密度之外，示蹤物質(zhì)的另一些性質(zhì)可決定其在第二液體介質(zhì)中的行為。例如，如果示蹤物質(zhì)締合或包含納米顆粒，則其將傾向于在延長的時間內(nèi)保持懸浮在液體介質(zhì)中，即使它們的體積質(zhì)量密度低于第二液體介質(zhì)的密度。將影響示蹤物質(zhì)行為的其他性質(zhì)或特征包括它們在所涉及的液體介質(zhì)中的溶解性或任何可使它們與漂浮珠分離的施加力(即磁性、電)的存在。

如上所述，珠、示蹤物質(zhì)和“夾心復合體”在第二液體介質(zhì)中的混合物經(jīng)受具有第一方向的離心力。珠(包括“夾心復合體”(即可定量的珠復合體))具有小于第二液體(d2)的體積質(zhì)量密度(m1和m2)，并且將“漂浮”(即朝最接近離心系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)軸線的第二液體介質(zhì)液面移動)，而過量的未結合的示蹤物質(zhì)，如上所討論的，根據(jù)其性質(zhì)如密度n、尺寸、溶解度等，將”沉積”，即移動遠離產(chǎn)生離心力的旋轉(zhuǎn)軸線，或保持懸浮至少足以將第二液體介質(zhì)和因此懸浮的示蹤物質(zhì)與珠和“夾心復合體”分離的時間。

在除去未反應的示蹤物質(zhì)之后，通過分析多個“夾心復合體”，可以原位(即在柱狀腔7中)定量或鑒定生物標志物。

在一些作為替代的分析方法中，珠和“夾心復合體”被運輸?shù)讲煌奈稽c或腔用于分析。當本文中公開的分析方法用于芯片實驗室裝置，其包含具有內(nèi)部流體回路的流控或微流控芯片，可使用離心力使包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應物移動通過所述內(nèi)部流體回路時，包含“夾心復合體”的珠可以例如被運輸?shù)綄ｉT設計用于分析此類珠的流體回路或腔。

在該具體分析方法中，包含“夾心復合體”的珠被從節(jié)段或腔7轉(zhuǎn)移到第二柱狀腔10。轉(zhuǎn)移通過將第二液體介質(zhì)或與第二液體介質(zhì)具有相同的或更高的密度的不同的液體介質(zhì)的另一等分試樣添加到珠中來實現(xiàn)，參見圖1l-m。等分試樣優(yōu)選大于圖1i-k的洗滌步驟中使用的量，使得珠可以更靠近腔7的入口4(或出口16，參見圖11)移動。將包含所有珠(包含“夾心復合體”)的最接近離心軸(或入口4或出口16)的第二液體介質(zhì)的級分通過傾析轉(zhuǎn)移到第二柱狀腔10，參見圖1o。傾析通過相對于第一柱狀腔稍微改變離心力G的方向的來實現(xiàn)。第二柱狀腔10被最佳地設計用于測定中的下一個優(yōu)選動作，即第二腔可以被設計用于更廣泛的洗滌和/或用于定量“夾心復合體”。

在該具體分析方法中，其中堆積有珠的腔7被示出和描述為柱狀。然而，在另一些分析方法中，腔可以具有任何形狀或形式，只要其提供允許反應物之間的緊密相互作用的珠的堆積結構，隨后將堆積結構分散在液體介質(zhì)中即可。

本發(fā)明的詳述；在流體回路中分離不同密度的珠的方法

在圖1a-k所描述的分析方法中，所述方法顯示為一次分析一種分析物。然而，通過使用根據(jù)本發(fā)明的分離方法，該分析方法不限于一次僅分析一種分析物。

通過使用不同密度的多種類型的珠，每種類型對不同的分析物以及與包含多種類型的分析物的樣品相互作用的各自的互補示蹤物質(zhì)具有選擇性，可以在同一時間獲得對應于多種類型的分析物的多種類型的“夾心復合體”。多種類型的“夾心復合體”可以同時或依次分析。在如上所述的結合或相互作用步驟之后，堆積珠的柱將包含多種類型的珠和代表待分析的多種分析物的相應的“夾心復合體”。在一些情況下，可以在不彼此分離的情況下分析多種類型的“夾心復合體”。然而，為了獲得期望水平的靈敏度和再現(xiàn)性，可能需要分離多種類型的“夾心復合體”。

本發(fā)明提供了用于實現(xiàn)多種類型的珠/固相材料(包括如整個說明書中所描述的“夾心復合體”)的分離的方法。本發(fā)明不依賴于根據(jù)上述分析方法，也不是其基本部分。本發(fā)明尤其有利于在芯片實驗室設備中使用，例如包含內(nèi)部流體回路的流控或微流控芯片，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應物通過所述內(nèi)部流體回路的移動可以通過使用離心力來實現(xiàn)。

本發(fā)明的一個實施方案在圖2a和2b中示出。適于分離具有不同密度的珠的腔15(或內(nèi)部流體回路的節(jié)段)在圖2a和2b中示出。腔15包括入口12、第一出口13和第二出口14。在該特定情況下，向腔提供密度為m1的第一組珠8a和密度為m2的第二組珠8b。然后密度為d3(m1＜d3＜m2)的液體介質(zhì)11添加到腔中的珠中。離心力G使得第一組珠8a在第一出口13的方向上移動(或漂浮)，而第二組珠8b朝向第二出口14移動(或沉積)。通過改變離心力的方向，即腔相對于離心力的取向，第一組珠8a和液體介質(zhì)11的一部分通過第一出口13轉(zhuǎn)移，而第二組珠8b和液體介質(zhì)11的一部分通過第二出口14轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明也適用于其他腔設計，例如圖1a中已經(jīng)示出的腔設計。在如圖1a所示的腔中，密度為d3的液體介質(zhì)(如結合圖2a和2b所述)可以首先用于分離兩組珠(類似于圖2a中的動作)。在兩組珠分離之后，通過改變所施加的離心力G的方向，可以從柱狀腔7傾析出第一組珠(類似于圖1o中的珠的傾析)。因此可以將第一與第二組珠分離。通過向柱狀腔7中添加密度為d4(d4＞m2)的另外的液體介質(zhì)，可以隨后以與用于第一組珠的相同的方式從所述腔中傾析出第二組珠。

本發(fā)明(即分離不同密度的珠的方法)不限于僅具有不同密度的兩組珠，而是可用于分離任何數(shù)量組的珠，只要其具有不同的密度，允許通過應用適當密度的液體介質(zhì)分離即可。例如，在如圖1a所示的腔的情況下，可以按順序如下分離密度分別為m1、m2、m3和m4的四組珠：首先添加密度為d3(m4＜d3＜m3、m2、m1)的液體介質(zhì)，傾析密度為m4的珠(類似于圖1o中的珠)，過濾掉密度為d3的剩余液體介質(zhì)，并添加密度為d4(m3＜d4＜m2、m1)的另外的液體介質(zhì)(或者，不過濾掉密度為d3的剩余液體介質(zhì)，但是通過添加密度提高添加劑如另外的高密度液體將其密度提高到d4)，傾析密度為m3的珠等。

另一選擇是將珠分離成兩個組合組的珠，其中第一組合組包含密度m1和m2的珠，而另一組合組包含密度m3和m4的珠。這可以通過首先添加密度為d4(m4、m3＜d4＜m2、m1)的液體介質(zhì)并傾析密度為m4和m3的珠來獲得。然后，將每個組合組的珠可以例如轉(zhuǎn)移到如圖2a中所示的腔中用于進一步分離。當在分析方法(例如上述分析方法)中使用本發(fā)明時，珠的組還可包含待分析的“夾心復合體”。

本發(fā)明的分離珠的另一個實施方案示于圖3a-3h。在該實施方案中，具有密度mi、m2和m3的三組珠分離成彼此頂部設置的三個不同的層。該方法在流控芯片中的流體回路的一部分中示出。所述節(jié)段包含出口17(或入口)以及分離節(jié)段20和堆疊節(jié)段21，堆疊節(jié)段具有第一端22和第二端23，其中第一端連接到分離節(jié)段，并且過濾元件19設置在第二端。所述節(jié)段的方向相對于施加的離心力G示出在圖3a-3h中。如圖3b所示，在第一步驟中，在分離節(jié)段20中的密度為d3的第一液體介質(zhì)24中提供三組珠(第一組珠8a(m1)、第二組珠8b(m2)和第三組珠8c(m3))，其中m1、m3＜d3＜m2。由于所施加的離心力和第一液體介質(zhì)的密度，第一組珠和第三組珠將沿與第二組珠相反的方向移動，參見圖3c和3d。通過改變離心力的方向，第二組珠朝向過濾元件19移動并形成珠層。第一組珠和第三珠珠沿與所施加的離心力相反的方向(即，在朝向提供離心力的旋轉(zhuǎn)軸的方向上)移動或漂浮。然后將高密度液體介質(zhì)25添加到該節(jié)段以提供密度為d4的第二液體介質(zhì)26，其中m3＜d4＜m1、m2，參見圖3f。液體介質(zhì)(即，第二液體介質(zhì))的提高的密度使得密度為m1的第一組珠朝向第二組珠的層移動，使得形成第一組珠的層，與第二組珠的層相鄰堆疊，參見圖3g。最后一步，參見圖3h，相對于所述節(jié)段的方向改變所施加的離心力的方向，使得第二液體介質(zhì)通過過濾元件。第三組珠將隨著第二液體介質(zhì)朝向過過濾器元件，使得形成第三組珠的層，其與第一組珠的層相鄰堆疊。因此，根據(jù)本發(fā)明的分離方法的該實施方案可以通過將多種類型的珠堆疊在不同的相鄰層中來提供多種類型的珠的分離。珠可以例如是通過同一樣品中的數(shù)種分析物的測定獲得的多種類型(或組)的可定量珠復合體。多種類型(或組)的可定量珠復合體的堆疊可以例如允許珠的同時或順序分析。在一些情況下，至少一組珠由“惰性”珠組成，其不會結合分析物和/或示蹤劑，即不能形成可定量的珠復合體。這些惰性珠可以用作不同層的可定量珠復合物之間的間隔物，或用作過過濾器元件和可定量珠復合物層之間的間隔物。這種間隔物的使用可以提高可定量珠復合物的后續(xù)分析的靈敏度，因為它們將與可能提供干擾信號的任何物質(zhì)分離。

用于在流體回路中轉(zhuǎn)移珠的發(fā)明構思的詳述

關于珠的運輸，本公開內(nèi)容提出了發(fā)明構思，其不依賴于根據(jù)本發(fā)明的方法，也不是其基本部分。該構思的一個實施方案在圖1l-p中公開。該構思解決了尤其與芯片實驗室裝置(例如微流控芯片)相關的問題，其中使用離心力運輸珠通過流體回路。在現(xiàn)有技術中，珠的運輸總是在與離心力相同的方向上進行，因此限制了可用于流體回路的設計的選擇。該發(fā)明構思允許通過將密度為d2的液體介質(zhì)添加到密度等于或小于m1的珠中而沿與所施加的離心力相反的方向運輸珠，其中d2＞m1。

雖然通過參照圖1l-1p的柱狀腔7示出了發(fā)明構思，但是該構思同樣適用于具有很多種形狀和形式的腔。圖2a和2b中示出了合適的腔的另一實例。如在上述第一發(fā)明構思的描述中所公開的，使第一組珠8a在第一出口13的方向上移動(或漂浮)，該方向與所施加的離心力G的方向相反。

可如下限定發(fā)明構思

在包含內(nèi)部流體回路的流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法，其中包含珠和含有至少一種分析物之樣品的多種反應物通過所述內(nèi)部流體回路的移動可以通過使用離心力來實現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：

-在所述流體回路的腔中提供密度等于或小于m1的珠，所述腔至少包含第一出口；

-向所述腔提供第一液體介質(zhì)，所述液體介質(zhì)的密度為d2，使得d2＞m1；以及

-施加離心力，使得所述珠在離心力的相反方向上移動。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個實施方案中，珠朝向第一出口移動。

在流控芯片中轉(zhuǎn)移珠的方法的一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：

-通過改變離心力的方向?qū)⒅檗D(zhuǎn)移到腔外，優(yōu)選地使得珠通過第一出口傾析。