本發(fā)明涉及生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種檢測(cè)牙周病相關(guān)蛋白的抗體芯片試劑盒。
背景技術(shù)：
：牙周病是指發(fā)生在牙支持組織(牙周組織)的疾病，包括僅累及牙齦組織的牙齦病和波及深層牙周組織(牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì))的牙周炎兩大類(lèi)。牙周疾病是常見(jiàn)的口腔疾病，是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類(lèi)牙齒和全身健康的主要口腔疾病。牙周病的早期癥狀不易引起重視，造成牙周組織長(zhǎng)期慢性感染，炎癥反復(fù)發(fā)作，不僅損害口腔咀嚼系統(tǒng)的功能，還會(huì)嚴(yán)重影響健康。牙周病是從簡(jiǎn)單的牙齦發(fā)炎到軟組組和牙齒骨組織損害的疾病，在最壞的情況下會(huì)導(dǎo)致牙齒的脫落。因此牙周炎的早期診斷和預(yù)防至關(guān)重要。目前包括牙周袋探診，牙菌斑和x光片影像學(xué)診斷在內(nèi)的臨床檢測(cè)可作為牙周病癥狀的指標(biāo)，但這些檢測(cè)不能指示疾病的發(fā)展情況。因此有必要開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)方法反映疾病的狀況，有效地預(yù)防和監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生。齦溝液(gcf)是指通過(guò)溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體。牙齦健康者有極少量齦溝液，由組織內(nèi)的滲透梯度而使組織液滲入齦溝內(nèi)。因?yàn)辇l溝液中通常有炎癥細(xì)胞，其他化學(xué)成分與組織液也不完全相同；齦溝液的流出量與該部位的炎癥程度成正比。齦溝液的液體成分主要來(lái)源于血清，其他成分則分別來(lái)自血清、鄰近的牙周組織及細(xì)菌。齦溝液包括各種電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酶等，也含有白細(xì)胞、脫落的上皮細(xì)胞等，還有細(xì)菌及其他微生物。齦溝液中含有多種酶，其中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膠原酶等與牙周病的嚴(yán)重程度和活動(dòng)期有一定關(guān)系。齦溝液量增多是牙齦炎早期的主要表現(xiàn)之一，常早于臨床表征的改變。牙齦炎癥明顯時(shí)，齦溝液明顯增多。齦溝液可以通過(guò)無(wú)創(chuàng)手段如試紙條進(jìn)行采集檢測(cè)，因此齦溝液中的蛋白可作為理想的標(biāo)志物用于疾病的檢測(cè)。牙周病相關(guān)蛋白包括炎癥細(xì)胞因子(例如il-1β，il-6，il-8，il-10，il-12，ifng，tnfa和crp)，骨代謝相關(guān)的細(xì)胞因子(例如，opg，opn，rank，rankl和)和酶(例如堿性磷酸酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)。檢測(cè)牙周病的常用方法包括通過(guò)測(cè)量牙周袋的探診深度、診察附著在牙槽骨上的牙齒的x光照片并參考探診出血。上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行選擇。這些方法嚴(yán)重依賴于牙科醫(yī)生的主觀鑒定。探診深度僅僅是對(duì)過(guò)去的附著喪失的測(cè)量，其在現(xiàn)在發(fā)生的牙周炎或其未來(lái)的發(fā)展中幫助很小。探診出血能夠表明復(fù)原過(guò)程而不是破壞過(guò)程。最近，雖然也開(kāi)發(fā)了許多評(píng)估牙周病活動(dòng)性的方法。然而，上述方法中沒(méi)有一種提供了足夠靈敏和特異的試驗(yàn)以診斷牙周炎及其破壞模式。非特異性方法的一個(gè)結(jié)果是幾個(gè)實(shí)際沒(méi)有患牙周炎的患者將被治療。臨床觀察例如探診深度不夠可靠，因?yàn)樯畹难乐艽皇潜厝话诎l(fā)生的炎癥，x光線照相術(shù)評(píng)估必須結(jié)合詳細(xì)的臨床觀察以給出正確的診斷，僅僅是在牙周袋中存在病原菌不能準(zhǔn)確地反映疾病活動(dòng)性。而且迄今為止開(kāi)發(fā)的基于檢測(cè)宿主或細(xì)菌來(lái)源蛋白質(zhì)的酶學(xué)方法的診斷還不夠特異的，因?yàn)槊庖邔W(xué)檢測(cè)法比較簡(jiǎn)單，迅速，重復(fù)性好，但假陽(yáng)性率高，每次只能檢測(cè)一個(gè)相關(guān)蛋白。有鑒于此，有必要開(kāi)發(fā)一種新型的牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)蛋白的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)牙周病相關(guān)蛋白的抗體芯片試劑盒，該試劑盒能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)牙周病相關(guān)蛋白，克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測(cè)指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價(jià)、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測(cè)牙周病相關(guān)蛋白的抗體芯片試劑盒，包括抗體芯片，牙周病相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，生物素標(biāo)記的牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物；和熒光素cy3標(biāo)記的鏈霉親和素；其中，所述抗體芯片以含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片作為固相載體，且多種牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體混合物在22～24℃、30～40％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。以沒(méi)有空間限制的標(biāo)準(zhǔn)組織玻片作為載體，可使點(diǎn)在同一微陣列上檢測(cè)細(xì)胞粘附因子的數(shù)目不受空間的限制，另外，玻片具有非常低的自身熒光，而且熒光信號(hào)不具擴(kuò)散性，不同點(diǎn)間的熒光信號(hào)不會(huì)彼此干擾，所以一次可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞粘附因子。但是，以不同的方法來(lái)處理標(biāo)準(zhǔn)組織玻片，會(huì)影響玻片的背景、檢測(cè)靈敏度，本發(fā)明通過(guò)比較多種處理玻片的方法，發(fā)現(xiàn)以親水試劑烷基糖苷處理的玻片背景低，檢測(cè)靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了不僅一次可以檢測(cè)十幾個(gè)細(xì)胞粘附因子，并且所檢測(cè)的細(xì)胞粘附因子靈敏度可達(dá)單因子的elisa檢測(cè)靈敏度。優(yōu)選地，所述牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物為c反應(yīng)蛋白、干擾素γ、白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-17、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶13、骨保護(hù)素、骨橋蛋白、骨活素、腫瘤壞死相關(guān)蛋白、腫瘤壞死因子β1、腫瘤壞死因子α的特異性抗體的混合物。更優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超純水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡3～5分鐘，晾干即可。最優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超純水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡3分鐘，晾干即可。優(yōu)選地，所述牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物在22℃、30％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：以不同的方法來(lái)處理標(biāo)準(zhǔn)組織玻片，會(huì)影響玻片的背景、檢測(cè)靈敏度，本發(fā)明通過(guò)比較多種處理玻片的方法，發(fā)現(xiàn)以含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片背景低，檢測(cè)靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了不僅一次可以檢測(cè)十幾個(gè)牙周病相關(guān)蛋白，并且所檢測(cè)的牙周病相關(guān)蛋白的靈敏度可達(dá)單個(gè)蛋白的elisa檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的抗體芯片試劑盒克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測(cè)指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價(jià)、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的抗體芯片試劑盒尤其適用于c反應(yīng)蛋白、干擾素γ、白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-17、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶13、骨保護(hù)素、骨橋蛋白、骨活素、腫瘤壞死相關(guān)蛋白、腫瘤壞死因子β1、腫瘤壞死因子α，這20種牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體的組合方式。因?yàn)?，不同的牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體在本發(fā)明所述芯片檢測(cè)系統(tǒng)中的靈敏性是不同的，所以，如果將一些低靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白抗體與一些高靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白抗體組合，會(huì)造成低靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白的漏檢。附圖說(shuō)明圖1為抗體芯片點(diǎn)陣圖。圖2為牙周病相關(guān)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1抗體芯片載體的篩選：常規(guī)的抗體芯片多以硝酸纖維素膜為載體，由于硝酸纖維素膜是多層結(jié)構(gòu)，芯片的洗滌難度大，以致芯片的背景高，結(jié)果波動(dòng)大。同時(shí)硝酸纖維素膜易碎，不易于大規(guī)模的操作，用于大規(guī)模臨床樣本的使用還不普遍。而傳統(tǒng)的玻片價(jià)廉背景低，這給診斷和研究領(lǐng)域的廣泛使用帶來(lái)了突破。我們篩選了市面上不用活性方法處理的玻片，無(wú)論是醛基化還氨基化的玻片點(diǎn)樣效果都不穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)大量的篩查得出溫度及玻片表面的活性試劑成分才是決定玻片點(diǎn)樣效果的關(guān)鍵。采用以下5組的玻片：第1組為氨基化玻片，購(gòu)自康寧公司，貨號(hào)為ultragaps40019；第2組為醛基化玻片：將第1組玻片加入戊二醛浸泡40分鐘制作醛基化玻片；第3組為apes玻片：將普通玻片加入丙酮稀釋的apes中浸泡0.5～1分鐘，再用純丙酮清洗制成apes玻片；第4組為多聚賴氨酸玻片：將普通玻片加入pbs稀釋的多聚賴氨酸浸泡0.5～1個(gè)小時(shí)，再用純水清洗制成多聚賴氨酸玻片；第5組為經(jīng)親水試劑處理的玻片：將普通玻片用親水試劑浸泡3～5分鐘，室溫晾干即可；所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超純水溶液。優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超純水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡3分鐘，晾干即可。各種玻片的點(diǎn)樣效果不盡相同，加入親水涂層的玻片點(diǎn)樣效果較明顯，點(diǎn)樣效果較未處理過(guò)的高。其中經(jīng)過(guò)氨基化及親水處理的玻片較其他的類(lèi)型效果較高。在22～24℃條件下，膜/玻片點(diǎn)樣效果較清晰，背景值低；而在27～30℃條件下，無(wú)論何種膜/玻片的點(diǎn)樣效果都出現(xiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象，溫度濕度越高，擴(kuò)散越明顯。上述5組玻片結(jié)合抗體后加入二抗及底物，在不同的溫度及濕度條件下的靈敏度篩選結(jié)果如下表1，表1中表示靈敏度的指標(biāo)是最低檢測(cè)線，單位ng/ml。表1綜合以上指標(biāo)，最終選擇經(jīng)過(guò)上述含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片作為固相載體。實(shí)施例2一種同時(shí)定量檢測(cè)多個(gè)牙周病相關(guān)蛋白的抗體芯片試劑盒的制備：為了檢測(cè)樣品中是否存在相應(yīng)的受體，制備固定有20種牙周病相關(guān)蛋白對(duì)應(yīng)的特異性抗體的玻片，20種牙周病相關(guān)蛋白對(duì)應(yīng)的特異性抗體為普通市售產(chǎn)品?？贵w芯片的制備與保存：將100～1000pl的含特異性抗體的pbs緩沖液(含有0.01～10g/100ml牛白蛋白)用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于玻片上。具體的芯片點(diǎn)陣以生物素標(biāo)記的牛igg作為陽(yáng)性對(duì)照。20種抗體及兩種不同濃度的陽(yáng)性對(duì)照在每個(gè)陣列中都有四個(gè)重復(fù)點(diǎn)。在本實(shí)施例中芯片陣列采用如圖1所示的排布方式，但事實(shí)上，在其他實(shí)施例中，芯片陣列還可以以其它的排布方式進(jìn)行組合，并不局限于圖1所表示的形式。每張玻片上有16個(gè)相同的芯片陣列。將點(diǎn)樣好的玻片放于室溫條件下靜置過(guò)夜，然后在干燥器中抽氣干燥2小時(shí)。干燥后的玻片裝上配套的16孔框架把一張玻片分割成16個(gè)互不干擾的小區(qū)。u形框夾從兩側(cè)將16孔框架，硅膠墊與標(biāo)準(zhǔn)載玻片卡貼緊在一起，以致標(biāo)準(zhǔn)載玻片貼緊封閉16孔框架的底部，使16孔框架上的每個(gè)小格形成一個(gè)小的反應(yīng)孔，16孔框架邊緣分別按照孔的位置標(biāo)注1至16的凹陷數(shù)字以方便辨認(rèn)。用粘性膜封閉框架后，把整張芯片用不透氣的小袋封裝然后于2℃到8℃保存?zhèn)溆谩Ｑ乐懿∠嚓P(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備：制備牙周病相關(guān)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品。將20種牙周病相關(guān)蛋白用含0.1％小牛白蛋白的磷酸緩沖液稀釋后按照一定的量混合在一起，分裝后用冷凍干燥法干燥并于－80℃保存。在本實(shí)施例中，用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線用的每種牙周病相關(guān)蛋白的最終使用濃度如表2所示。表2經(jīng)梯度稀釋后用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的牙周病相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(pg/ml)cntrlstd7std6std5std4std3std2std1crp0551654941,4814,44413,33340,000ifnγ014411233701,1113,33310,000il-1α03825742226672,000il-1β03825742226672,000il-20516491484441,3334,000il-403825742226672,000il-603825742226672,000il-801251544133400il-1003825742226672,000il-1203825742226672,000il-17014411233701,1113,33310,000mip-1α014411233701,1113,33310,000mmp-9014411233701,1113,33310,000mmp-13027822477412,2226,66720,000opg0278224774122226,66720,000opn01374121,2353,70411,11133,333100,000osteoactivin014411233701,1113,33310,000rank01374121,2353,70411,11133,333100,000tgfβ101374121,2353,70411,11133,333100,000tnfα03825742226672,000實(shí)施例3用本發(fā)明的試劑盒定量檢測(cè)多種牙周病相關(guān)蛋白的實(shí)驗(yàn)步驟如下：1、玻片芯片的完全干燥：將玻片芯片從盒子中取出來(lái)，在室溫平衡20～30min后，將包裝袋打開(kāi)，揭開(kāi)密封條，然后將芯片放在真空干燥器或者室溫干燥1～2小時(shí)。2、按表2對(duì)牙周病相關(guān)蛋白進(jìn)行梯度稀釋2.1、添加500μl的樣品稀釋液到牙周病相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)混合物的小管中，重新溶解標(biāo)準(zhǔn)品。打開(kāi)小管前，先快速的離心，輕輕的上下抽打溶解粉末，標(biāo)記這個(gè)小管為std1。2.2、分別標(biāo)記6個(gè)干凈的離心管為std2、std3到std7，添加200μl的樣品稀釋液到每個(gè)小管中。2.3、抽取100μl的std1加入到std2中輕輕混合，然后從std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀釋至std7。2.4、抽取100μl的樣品稀釋液到另一個(gè)新的離心管中，標(biāo)記為cntrl，作為陰性對(duì)照。注：因?yàn)槊糠N牙周病相關(guān)蛋白的起始濃度是不同的，所以std1到std7的梯度稀釋后，每個(gè)牙周病相關(guān)蛋白的系列濃度是不同的，本實(shí)施例中，梯度牙周病相關(guān)蛋白稀釋液的濃度如表2所示。3、芯片操作流程3.1、每個(gè)孔中加100μl的樣品稀釋液，室溫?fù)u床上孵育30分鐘，封閉定量抗體芯片。3.2、抽去每個(gè)孔中的緩沖液，添加100μl的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到孔中，在搖床上4℃過(guò)夜孵育。注：不同樣品的孵育量不一樣：血漿、血清使用前用樣品稀釋液1∶1稀釋?zhuān)患?xì)胞上清液可用原液；細(xì)胞或組織裂解液經(jīng)蛋白濃度測(cè)定后加入5-50ug的量。3.3、清洗：抽去每個(gè)孔中的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液i。抽去每個(gè)孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液ii。3.4檢測(cè)抗體混合物的孵育：離心檢測(cè)抗體混合物小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離心。添加80μl的檢測(cè)抗體到每個(gè)孔中，室溫?fù)u床上孵育2小時(shí)。3.5清洗：抽去每個(gè)孔中的檢測(cè)抗體，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干凈洗液。3.6cy3-鏈霉親和素的孵育：離心cy3-鏈霉親和素小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離心。添加80μl的cy3-鏈霉親和素到每個(gè)孔中，用鋁箔紙包住玻片避光孵育，室溫?fù)u床上孵育1個(gè)小時(shí)。3.7清洗：抽去每個(gè)孔中的cy3-鏈霉親和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室溫?fù)u床震蕩，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干凈洗液。3.8熒光檢測(cè)1)將玻片框架拆掉，小心不要用手接觸到玻片印制抗體的一面。2)將玻片放置在玻片清洗管中，添加約30ml的1×洗液i，能整個(gè)覆蓋住玻片，在室溫?fù)u床上震蕩15min，棄去1×洗液i，添加約30ml的1×洗液ii，在室溫?fù)u床上震蕩5min。3)去除玻片的殘留洗液。將玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不蓋蓋子，在1000rpm離心3min。4)采用激光掃描儀例如axongenepix掃描信號(hào)，采用cy3或者綠色通道(激發(fā)頻率＝532nm)。3.9芯片的數(shù)據(jù)提取以及用分析軟件來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析1)用genepix軟件來(lái)讀取生物芯片的熒光值。2)讀數(shù)后選用的數(shù)值為扣除點(diǎn)周?chē)尘暗闹虚g值讀數(shù)(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片軟件來(lái)作每個(gè)牙周病相關(guān)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)體系交叉反應(yīng)的測(cè)試?？贵w芯片實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性在一定程度上受限于所選擇的抗原或抗體的來(lái)源，純度與特異性，并且蛋白類(lèi)抗體的生物與應(yīng)用存在著抗原性，免疫原性的強(qiáng)弱，異源抗體的類(lèi)風(fēng)濕因子和自身抗體的干擾，罕見(jiàn)抗體的高工作量篩選，因些篩選抗體對(duì)需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？贵w對(duì)間的交叉反應(yīng)測(cè)試是根據(jù)以下方法進(jìn)行的。不同芯片首先與單個(gè)抗原濃度為100ng/ml的不同抗原孵育，洗片后再與每種抗原相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體反應(yīng).最后經(jīng)cy3-鏈霉親和素孵育，芯片掃描后讀數(shù)。以每種抗原的捕獲抗體為橫軸，以加入的抗原和相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體為縱軸可以得到表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表3.抗體對(duì)間的交叉反應(yīng)測(cè)試結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明每種抗體對(duì)可以特異地識(shí)別自己的檢測(cè)抗原而與其他的抗原沒(méi)有交叉反應(yīng)。實(shí)施例5實(shí)驗(yàn)體系的介質(zhì)回收率。該定量抗體芯片的在不同樣品介質(zhì)中的適用程度通過(guò)測(cè)定介質(zhì)回收率來(lái)顯示。在2倍稀釋的正常人血清和2倍稀釋的細(xì)胞上清液(cm)中分別加入不同濃度的各個(gè)牙周病相關(guān)蛋白，用該定量抗體芯片檢測(cè)，然后計(jì)算樣品的介質(zhì)回收率＝(介入樣品的牙周病相關(guān)蛋白濃度-對(duì)照樣品的牙周病相關(guān)蛋白濃度)/理論上介入的牙周病相關(guān)蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)顯示該發(fā)明的試劑盒在人血清和細(xì)胞上清液中的回收率達(dá)31～126％。表4.定量抗體芯片在不同介質(zhì)中的回收率(pgml)spikingcmcm+agcm％serumserum+agserum％crp20,000014,41172％7,44420,94568％ifnγ5,0003914,42581％273,60772％il-1α1,0002174672％1065464％il-1β1,000063163％051351％il-22,0004322,536105％492,152105％il-41,000141,244123％101,361135％il-61,0001,7262,43671％271,023100％il-81,0001591,156100％695695％il-101,000972672％159059％il-121,00021,198120％285785％il-175,00003,46169％23,25565％mip-1α5,0001107,134140％03,93479％mmp-95,000152,58751％3,3684,06714％mmp-1310,0001299,91998％66,12861％opg10,00034,60239,00944％2312,799128％opn50,00095847,04392％20328,86157％osteoactivin5,000894,99398％2,4934,53841％rank25,0006819,11976％2117,50370％tgfβ150,00031354,434108％060,182120％tnfα1,0004276572％161,301128％綜上所述，本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)定量檢測(cè)多個(gè)牙周病相關(guān)蛋白的抗體芯片試劑盒。該試劑盒一方面克服了常規(guī)elisa在受體檢測(cè)中的檢測(cè)指標(biāo)單一，耗時(shí)，耗力，耗材等缺點(diǎn)，同時(shí)也克服了現(xiàn)有多蛋白檢測(cè)技術(shù)中的低通量，重復(fù)性差等弱點(diǎn)。該系統(tǒng)使用標(biāo)準(zhǔn)組織玻片作為表面載體，可以在玻片表面完成多重夾心elisa的反應(yīng)。同時(shí)抗體芯片的規(guī)格符合標(biāo)準(zhǔn)96孔酶標(biāo)板的尺寸，使得高通量樣品操作成為可能。另外，我們也證實(shí)用該發(fā)明所檢測(cè)的受體的濃度可以達(dá)到單個(gè)elisa的檢測(cè)靈敏度和精確度。最后，通過(guò)對(duì)該芯片在不同樣品中介質(zhì)回收率的測(cè)定確準(zhǔn)該發(fā)明的芯片試劑盒可以運(yùn)用于血清，細(xì)胞上清液等不同的生物樣品。當(dāng)前第1頁(yè)12