本發(fā)明屬于快速檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測甲氰菊酯的試紙，其特別適用于茶葉樣品中甲氰菊酯的檢測。
背景技術(shù)：
：甲氰菊酯(fenpropathrin)，α-氰基-苯氧基芐基-2,2,3,3-四甲基環(huán)丙烷羧基酸酯，又名滅掃利，是一種擬除菊酯類殺蟲殺螨劑。甲氰菊酯屬于神經(jīng)毒劑，能作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，使昆蟲過度興奮、麻痹而死。近年來，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥因具有除蟲高效優(yōu)點而得到普遍使用，其中的甲氰菊酯在食品中時有檢出，甲氰菊酯對高等動物具有中等毒性。目前甲氰菊酯殘留的檢測主要為液相色譜、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法等，儀器方法具有檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢，但是檢測樣本前處理繁瑣、耗時長，并且儀器檢測需要昂貴的大型儀器和設(shè)備，配備專業(yè)的檢測技術(shù)人員，其推廣應(yīng)用受到一定限制。膠體金免疫層析法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品檢測等優(yōu)點，是理想的快速篩選手段。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測靈敏度高、操作簡便、成本低、檢測時間短的檢測甲氰菊酯的試紙及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的檢測甲氰菊酯的試紙，包括樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4和底板7，所述樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4依次粘貼在底板7上，所述反應(yīng)膜3上具有包被有甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線5和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線6，所述結(jié)合物釋放墊2包被有甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物。所述結(jié)合物釋放墊2疊放于樣品吸收墊1下，并且結(jié)合物釋放墊2的1/3被覆蓋于樣品吸收墊1下。所述甲氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由甲氰菊酯半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺蛋白。所述甲氰菊酯半抗原是由甲氰菊酯與間羥基苯甲醛、氰化鉀、甲氰菊酰氯、對羥基苯丙酸反應(yīng)合成得到，所示甲氰菊酯半抗原結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示，所述甲氰菊酯單克隆抗體是以甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得；所述羊抗鼠抗抗體是由鼠源抗體免疫羊得到的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述試紙的制備方法，其主要包括以下步驟：a)制備包被有甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊2；b)制備具有包被有甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線5和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線6的反應(yīng)膜3；c)將a)和b)制備好的結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3與樣品吸收墊1、吸水墊4和底板7組裝成試紙。本發(fā)明檢測甲氰菊酯的試紙采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，將甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物固定于結(jié)合物釋放墊上，樣品中的甲氰菊酯在流動過程中，先與結(jié)合物釋放墊上的甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物，形成藥物－抗體－膠體金標(biāo)記物。樣品中的藥物與反應(yīng)膜檢測線上的甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物競爭結(jié)合甲氰菊酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)檢測線紅色條帶有無或顏色深淺來判斷待測樣品液中甲氰菊酯殘留量，對茶青樣品檢測限為1mg/kg，對干茶樣品檢測限為2mg/kg。檢測時，樣品經(jīng)處理后滴入試紙卡孔內(nèi)，當(dāng)甲氰菊酯在樣品中的濃度低于檢測限或為零時，甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物在層析過程中會與固定在反應(yīng)膜上的甲氰菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，在檢測線(t線)和質(zhì)控線(c線)內(nèi)各出現(xiàn)一條紅色條帶；如果甲氰菊酯在樣品中的濃度等于或高于檢測限，甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物會與甲氰菊酯全部結(jié)合，從而在t線處因為競爭反應(yīng)不會與甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。本發(fā)明的試紙具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、檢測時間短、儲存簡單、保質(zhì)期長、適用范圍廣、易于推廣應(yīng)用等優(yōu)點。附圖說明圖1為本發(fā)明甲氰菊酯半抗原合成路線圖；圖2甲氰菊酯半抗原鑒定圖(氫譜圖)；圖3甲氰菊酯半抗原鑒定圖(碳譜圖)；圖4為本發(fā)明試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為本發(fā)明試紙檢測結(jié)果判定圖。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明試劑如無特別說明，均為常規(guī)試劑。實施例1檢測甲氰菊酯的試紙的制備該試紙的制備方法主要包括以下幾個步驟：a)制備包被有甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊2；b)制備具有包被有甲氰菊酯半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物的檢測線5和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線6的反應(yīng)膜3；c)將a)和b)制備好的結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3與樣品吸收墊1、吸水墊4和底板7組裝成試紙。下面分步詳細(xì)敘述：1、甲氰菊酯半抗原的制備，合成路線見圖11)合成間苯氧基苯氰醇將1.22g間羥基苯甲醛溶于50ml四氫呋喃中，冰浴攪拌下緩慢加入0.65g氰化鉀和0.76ml去離子水，繼續(xù)攪拌30min后，緩慢滴加2.1ml2mol/l濃鹽酸，繼續(xù)攪拌1h，tlc法檢測反應(yīng)過程，反應(yīng)結(jié)束后，往反應(yīng)液中加50ml去離子水，用二氯甲烷提取，有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除溶劑，得黃色油狀液體產(chǎn)物；2)間羥基苯甲氰醇接甲氰菊酰氯將上一步所得產(chǎn)物溶于50ml丙酮中，冰浴攪拌冷卻，另取3.54g甲氰菊酰氯溶于50ml二氯甲烷，加入到上述產(chǎn)物的丙酮溶液中，再加入2.14ml嘧啶，混合物繼續(xù)冰浴反應(yīng)3h，反應(yīng)完全后，依次用3mol/l鹽酸和去離子水洗滌反應(yīng)液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，得黃色油狀液體；3)合成甲氰菊酯半抗原將上一步產(chǎn)物溶于100ml98％濃硫酸，再加入1.66g對羥基苯丙酸，100℃加熱回流反應(yīng)6h，tlc檢測，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液倒入冰中，用固體碳酸氫鈉調(diào)節(jié)ph至5.0，用乙酸乙酯提取，無水硫酸鈉干燥，產(chǎn)品用硅膠柱層析提純，收集目標(biāo)組分，經(jīng)核磁共振氫譜確證，圖2中12ppm左側(cè)附近的峰為半抗原連接臂末端羧基上的氫，7ppm附近的一簇峰為甲氰菊酯苯環(huán)上的氫和氰基α位碳上的氫，圖3所示碳譜圖中，110-140ppm之間的峰為甲氰菊酯上兩個苯環(huán)和氰基上的碳，170-180ppm之間左邊的峰為連接臂末端羧基上的碳，右邊的峰為甲氰菊酯分子中酯結(jié)構(gòu)上的碳，表明半抗原合成成功。2、免疫原制備－甲氰菊酯半抗原與牛血清白蛋白(bsa)偶聯(lián)得到免疫原稱取40mg甲氰菊酯半抗原溶解于3mldmf溶液中，加入80mgedc和80mgnhs(二者溶于3ml去離子水中)進行活化30min，將活化甲氰菊酯加入到180～400mgbsa(溶于7ml去離子水)中進行偶聯(lián)制備出免疫原，用0.02mol/l磷酸鹽緩沖液透析3天，每天早晚更換透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，即得到免疫原，分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?、包被原的制備－甲氰菊酯半抗原與卵清蛋白(ova)偶聯(lián)得到包被原稱取20mg甲氰菊酯半抗原用1.5mldmf溶解，冷卻至10℃時得到反應(yīng)液ⅰ；取氯甲酸異丁酯15μl加入反應(yīng)液ⅰ中，10℃條件下攪拌反應(yīng)30min；取45mg卵清蛋白，用3ml50mmol/lna2co3溶解，10℃反應(yīng)4h，轉(zhuǎn)移4℃冰箱過夜；用0.01mol/l磷酸鹽緩沖液4℃透析3天，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，即得到包被原，分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?、甲氰菊酯單克隆抗體的制備1)動物免疫將步驟2得到的免疫原注入balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為120μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。2)細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1(數(shù)量配比)比例與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭elisa測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌甲氰菊酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：將單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。4)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向rpmi1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2％(質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的ph為7.4。5、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。6、甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物的制備1)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1％氯金酸稀釋成0.01％(質(zhì)量百分含量)，取100ml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。2)甲氰菊酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用0.2mol/ltris-hcl溶液調(diào)膠體金的ph值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入40～80μg抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入甲氰菊酯單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，再加入10％bsa混勻，使其在膠體金溶液中的終濃度為1％(體積百分含量)，靜置10min，12000r/min、4℃離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4℃?zhèn)溆谩?fù)溶緩沖液：含牛血清白蛋白0.1％～0.3％(體積百分含量)、吐溫-800.05％～0.2％(質(zhì)量百分含量)、ph7.2的0.01mol/ltris-hcl緩沖液。7、結(jié)合物釋放墊的制備將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為0.5％)和ph7.2，0.5mol/l磷酸鹽緩沖液中，均勻浸濕1h，37℃烘3h備用。用百道公司生產(chǎn)zx1000型噴膜儀，將制備好的甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合物釋放墊上，每1cm結(jié)合物釋放墊包被0.01ml甲氰菊酯單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物后，置于37℃環(huán)境中(濕度＜20％)60min后取出，密封置于干燥環(huán)境(濕度＜20％)中保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)合物釋放墊材質(zhì)為硝酸纖維素膜。8、反應(yīng)膜的制備將甲氰菊酯半抗原－卵清蛋白偶聯(lián)物包被到反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線5，將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線6。反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。包被過程：用0.1mol/lph7.4磷酸緩沖液將甲氰菊酯半抗原－卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用百道公司生產(chǎn)zx1000型點膜儀，將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線(t線)，包被量為1.0μg/cm2；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/ml，用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線(c線)，包被量為1.0μg/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2h，備用。9、樣品吸收墊的制備將樣品吸收墊置于含0.5％牛血清白蛋白(體積百分含量)、ph7.20.1mol/l磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37℃烘2h備用。樣品吸收墊的材質(zhì)可為玻纖、無紡布、濾血膜，優(yōu)選無紡布。10、試紙的組裝，見圖4將樣品吸收墊1、結(jié)合物釋放墊2、反應(yīng)膜3、吸水墊4依次按順序粘貼在底板7上；結(jié)合物釋放墊2從起始端有1/3區(qū)域被樣品吸收墊1覆蓋，結(jié)合物釋放墊2的末端與反應(yīng)膜3的始端連接，反應(yīng)膜3的末端與吸水墊4的始端相連，樣品吸收墊1的始端與底板7的始端對齊，吸水墊4的末端與底板7的末端對齊；所述反應(yīng)膜3上有檢測線5和質(zhì)控線6，檢測線5和質(zhì)控線6均為與所述試紙的長相垂直的條狀帶；檢測線5位于靠近結(jié)合物釋放墊2的末端的一側(cè)；質(zhì)控線6位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊2的末端的一側(cè)；將試紙用機器切成3mm寬的小條，裝在特制的塑料制卡中，形成帶有加樣孔和觀察窗的試紙卡，4～30℃條件下可保存12個月。實施例2茶葉樣品中甲氰菊酯殘留的檢測1.茶葉樣品的前處理1)檢測前樣品應(yīng)恢復(fù)至室溫20～25℃；2)稱取2.0±0.05g樣本至聚苯乙烯離心管中；3)加入10ml樣本提取液，用渦旋儀混勻；；4)茶青和干茶的稀釋方法如下：茶青：100μl樣品液+400μl樣品稀釋液；干茶：100μl樣品液+900μl樣品稀釋液；樣品稀釋液為0.2mol/l磷酸鹽緩沖液。2、用實施例1的試紙進行檢測用吸管吸取待檢茶葉樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔，液體流動時開始計時，反應(yīng)5min，判定結(jié)果，其他時間判定無效。3、分析檢測結(jié)果，見圖5陰性(－)：t線和c線都顯色，表示茶葉樣品中甲氰菊酯藥物濃度低于檢測限，如圖5a。陽性(+)：t線無顯色，c線顯色，表示樣品中甲氰菊酯藥物濃度等于或高于檢測限，如圖5b。無效：未出現(xiàn)c線，表明不正確的操作過程或試紙已變質(zhì)失效，如圖5c。在此情況下，應(yīng)用新的試紙卡重新測試。4、檢測限試驗取空白干茶樣品，在其中分別添加甲氰菊酯至終濃度為1、2、4mg/kg，取試紙進行檢測，每個樣品重復(fù)測定三次。用試紙檢測茶葉樣品時，當(dāng)其中甲氰菊酯添加濃度為1mg/kg時，試紙上顯示出肉眼可見的兩條紅色線條，呈陰性；當(dāng)其中甲氰菊酯添加濃度為2、4mg/kg時，試紙質(zhì)控線顯示，但檢測線不顯示，呈陽性；表明本試紙干茶樣品中甲氰菊酯的檢測線為2mg/kg。取空白茶青樣品，在其中分別添加甲氰菊酯至終濃度為0.5、1、2mg/kg，取試紙進行檢測，每個樣品重復(fù)測定三次。用試紙檢測茶青樣品時，當(dāng)其中甲氰菊酯添加濃度為0.5mg/kg時，試紙上顯示出肉眼可見的兩條紅色線條，呈陰性；當(dāng)其中甲氰菊酯添加濃度為1、2mg/kg時，試紙質(zhì)控線顯示，但檢測線不顯示，呈陽性；表明本試紙茶青樣品中甲氰菊酯的檢測線為1mg/kg。5、假陽性率、假陰性率試驗取已知甲氰菊酯含量大于1mg/kg的茶青陽性樣品、含量大于2mg/kg的干茶陽性樣品各20份和含量小于1mg/kg茶青陰性樣品、含量小于2mg/kg干茶陰性樣品各20份，用三批試紙進行檢測，計算其假陽性率和假陰性率。檢測結(jié)果見表1～4。表1檢測陽性樣品結(jié)果批次陽性茶青樣品(20份)120份陽性220份陽性320份陽性表2檢測陽性樣品結(jié)果批次陽性干茶樣品(20份)120份陽性220份陽性320份陽性表3檢測陰性樣品結(jié)果批次陰性茶青樣品(20份)120份陰性220份陰性320份陰性表4檢測陰性樣品結(jié)果批次陰性干茶樣品(20份)120份陰性220份陰性320份陰性用3個批次生產(chǎn)的試紙檢測陽性樣品時，結(jié)果全為陽性，可知陽性樣品符合率為100％，檢測20份陰性茶青樣品時，全為陰性，檢測20份陰性干茶樣品時，只有一批次檢出一份陽性。說明本發(fā)明試紙可以對茶青、干茶中甲氰菊酯進行快速檢測。6、特異性試驗特異性常用交叉反應(yīng)率表示，是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。將常檢的多菌靈、三唑醇、甲菌靈藥物500μg/l的樣品，用本發(fā)明試紙進行檢測。結(jié)果顯示，用本發(fā)明試紙檢測500μg/l的多菌靈、三唑醇、甲菌靈藥物時，試紙質(zhì)控線和檢測線均顯色，呈現(xiàn)陰性，說明本試紙對這些藥物無交叉反應(yīng)。當(dāng)前第1頁12