本發(fā)明具體涉及一種同步檢測(cè)黃曲霉毒素和甲萘威混合污染的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是一類主要的真菌毒素污染物，毒性強(qiáng)、污染廣，被世界衛(wèi)生組織劃分為一類致癌物。其毒性表現(xiàn)在對(duì)動(dòng)物致癌、致突變、致畸，可引起dna損傷和免疫抑制。黃曲霉毒素污染可發(fā)生在種植、收獲和貯藏、運(yùn)輸、消費(fèi)等各環(huán)節(jié)，污染的產(chǎn)品多以谷物、堅(jiān)果為主，在其他產(chǎn)品如肉、蛋、奶中也均有檢出。甲萘威是一種被廣泛用于蔬菜、水果、谷物等農(nóng)作物的一類氨基甲酸酯類農(nóng)藥，對(duì)害蟲具有較好的防治效果，然而由于其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的濫用和違禁使用，使其對(duì)人們的飲食安全造成重大威脅，我國(guó)規(guī)定甲萘威在谷物中限量0.5-1μg/ml，蔬菜中限量為1μg/ml。黃曲霉毒素與甲萘威在谷物中往往會(huì)造成同時(shí)污染，需要研制一種方便快捷的檢測(cè)技術(shù)對(duì)兩類污染物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。
目前，黃曲霉毒素與甲萘威的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但是前處理步驟復(fù)雜，樣品檢測(cè)成本高。免疫層析法克服了上述不足，其以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，用硝酸纖維素將抗原固定，使層析過程中游離靶標(biāo)物與檢測(cè)線上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合已標(biāo)記抗體，通過結(jié)合在檢測(cè)線上標(biāo)記物的量計(jì)算樣品中靶標(biāo)物的含量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種能同步檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫層析時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒、制備方法及其應(yīng)用。該時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒可用于樣品中黃曲霉毒素、甲萘威含量的同步檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
同步檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫層析時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒，其特征在于：它包括免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條和含有銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體、銪標(biāo)記的甲萘威單克隆抗體凍干品的樣品反應(yīng)瓶，其中：所述的免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測(cè)墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，所述檢測(cè)線位于質(zhì)控線下方，個(gè)數(shù)為2條，檢測(cè)線上分別上包被黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物；所述的抗甲萘威單克隆抗體為由保藏編號(hào)為cctccno.c201654的雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2分泌產(chǎn)生的。該雜交瘤細(xì)胞株已于2016年3月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctccno:c201654。
按上述方案，所述銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體是按照以下方法制備得到的：將甲萘威單克隆抗體和活化后的銪標(biāo)記試劑在硼酸緩沖液中振搖反應(yīng)2h以上，離心去上清，封閉得到目標(biāo)產(chǎn)物；所述銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體是按照以下方法制備得到的：將黃曲霉毒素單克隆抗體和活化后的銪標(biāo)記試劑在硼酸緩沖液中振搖反應(yīng)2h以上，離心去上清，封閉得到目標(biāo)產(chǎn)物
按上述方案，所述的活化方法為取銪標(biāo)記試劑，用硼酸緩沖液中超聲分散，然后加緩慢加入碳二亞胺溶液，振蕩活化，離心去上清液，用硼酸緩沖液復(fù)溶，備用。所述的活化時(shí)間為15-30min。
按上述方案，所述的封閉液為含0.5-1％bsa的硼酸緩沖液。
按上述方案，所述銪標(biāo)記試劑以有效量計(jì)與黃曲霉毒素單克隆抗體的質(zhì)量比為1:(0.001-0.1)，銪標(biāo)記試劑以有效量計(jì)與甲萘威抗體的質(zhì)量比為1:(0.001-0.1)。
按上述方案，所述銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體凍干品是將銪標(biāo)記的單克隆抗體加入抗體保護(hù)液中凍干的；
所述銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體凍干品是將銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體加入抗體保護(hù)液中凍干的；
所述的抗體保護(hù)液為0.01％-0.30vt％(體積分?jǐn)?shù))的吐溫-20、0.5-1.5wt％蔗糖和0.1-1wt％牛血清蛋白(bsa)水溶液；
按上述方案，所述免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條中的吸水墊長(zhǎng)15-35mm，寬3-5mm；樣品墊長(zhǎng)12-18mm，寬2-5mm，相鄰各墊的交疊長(zhǎng)度為1-3mm；所述免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條中檢測(cè)墊上靠近質(zhì)控線的檢測(cè)線與硝酸纖維素膜上沿的間距為6-15mm，每相鄰兩條檢測(cè)線之間的間距為1.5-4.5mm，靠近質(zhì)控線的檢測(cè)線與質(zhì)控線的間距為4-10mm；所述的樣品反應(yīng)瓶為1-5ml的卡口瓶。
按上述方案，所述免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條中檢測(cè)墊上每厘米檢測(cè)線所需的黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被量為0.4～0.8μg，每厘米檢測(cè)線所需的甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物的包被量為0.8-1.0μg；所述樣品反應(yīng)瓶中銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體凍干品的含量為0.1-0.3μg，所述樣品反應(yīng)瓶中銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體凍干品的含量為0.2-0.4μg；
按上述方案，所述的時(shí)間分辨熒光試紙條的制備方法如下：
(1)將吸水紙剪裁為吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備：
將黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物、甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物配制成濃度為0.25-2mg/ml的包被液，用劃膜方式將其于硝酸纖維素膜上進(jìn)行分別間隔包被，得到2條檢測(cè)線，然后于37-40℃條件下干燥30-60分鐘；
將兔抗鼠多克隆抗體配成濃度為0.1-0.45mg/ml的包被液，用劃膜方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為0.4～0.8μg，然后于37-40℃條件下干燥30-60分鐘；
(3)樣品墊的制備：
將玻璃纖維膜放入封閉液中浸濕，取出，于37-40℃條件下干燥4-10小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
(4)免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條的組裝：
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，即得免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條；
按上述方案，所述免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條的制備中配制黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物包被液、甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物包被液中所使用的包被緩沖液為：每10ml中含有牛血清白蛋白0.1g，疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；
配制兔抗鼠多克隆抗體包被液中所使用的包被緩沖液為：每10ml中含有疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；
所述免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條的制備中使用的封閉液為：每100ml中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，疊氮化鈉0.02g，氯化鈉0.8g，十二水磷酸氫二鈉0.29g，氯化鉀0.02g，磷酸二氫鉀0.02g；
上述免疫層析時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒在黃曲霉毒素、甲萘威含量檢測(cè)中的應(yīng)用：將待測(cè)樣品經(jīng)前處理獲得待測(cè)樣品溶液后，加入樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入時(shí)間分辨熒光試紙條，37℃反應(yīng)6分鐘后，用時(shí)間分辨熒光測(cè)試儀進(jìn)行檢測(cè)，獲得免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條上檢測(cè)線(t)熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線(c)熒光強(qiáng)度的比值；基于預(yù)先獲得的免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)分別與黃曲霉毒素、甲萘威濃度的關(guān)系曲線，獲得待測(cè)樣品溶液中黃曲霉毒素、甲萘威的含量，最后經(jīng)換算即得待測(cè)樣品中黃曲霉毒素、甲萘威的含量；
按上述方案，所述的免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)分別與黃曲霉毒素、甲萘威濃度的關(guān)系曲線是采用以下方法得到的：
(1)配制得到一系列梯度濃度的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；配制得到一系列濃度的甲萘威標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
(2)將適量上述各梯度濃度的黃曲霉毒素、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入到樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條，37℃反應(yīng)10分鐘，用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)得到各免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條上檢測(cè)線(t)和質(zhì)控線(c)的熒光強(qiáng)度值，由此獲得各免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)；
(3)經(jīng)擬合得到免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)與黃曲霉毒素濃度的關(guān)系曲線；經(jīng)擬合得到免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)與甲萘威濃度的關(guān)系曲線；
本發(fā)明的有益效果：
(1)快速、同步檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威。本發(fā)明提供的免疫層析時(shí)間分辨熒光試劑盒能在一條試紙條上實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素、甲萘威兩種真菌毒素的同步、快速檢測(cè)，使用的抗體均為單克隆抗體，特異性好、靈敏度高，兩者之間無(wú)干擾，簡(jiǎn)單、快速。
(2)靈敏度高。本發(fā)明提供的免疫層析時(shí)間分辨熒光試劑盒對(duì)檢測(cè)溶液中黃曲霉毒素的最低檢測(cè)限為0.02ng/ml，對(duì)甲萘威的最低檢測(cè)限為0.01ng/ml，該檢測(cè)限能滿足歐盟對(duì)食品中的限量要求。
(3)樣品前處理方法簡(jiǎn)單。樣品前處理只需要將甲醇水提取液加入樣品中超聲提取5-10分鐘，然后靜置5-10分鐘，取上清液稀釋即可進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)樣品前處理過程簡(jiǎn)單、快速。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明提供的黃曲霉毒素、甲萘威時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中：1吸水墊、2檢測(cè)墊、3樣品墊、4質(zhì)控線、5甲萘威檢測(cè)線、6黃曲霉毒素檢測(cè)線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1抗甲萘威單克隆抗體的獲得
雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2的篩選
1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買6周齡balb/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(cnh)偶聯(lián)牛血清白蛋白(bsa)，獲得甲萘威完全抗原cnh-bsa，免疫小鼠。第一次免疫將甲萘威完全抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于3周后進(jìn)行，采用弗氏不完全佐劑與等體積的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第三次與第四次免疫分別與上一次免疫間隔兩周，免疫方式與第二次相同。四次免疫劑量相同，僅為100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾靜脈采血，分離血清，采用間接elisa法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)，并用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前量的2倍。
2.細(xì)胞融合
于加強(qiáng)免疫3天后，采用50％(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即peg(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟：無(wú)菌條件下脫頸處死待融合小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞sp2/0以5：1的個(gè)數(shù)比混合，用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，1200rpm，離心5min。棄去上清，控干，加入1mlpeg，融合1分鐘，緩慢加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，棄上清，沉淀即為融合細(xì)胞，用20mlhat完全培養(yǎng)基重懸，將懸起的細(xì)胞加入到80ml半固體培養(yǎng)基中，混勻后加到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，2ml/孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
所述的含1％hat的細(xì)胞完全培養(yǎng)基含有20％(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，75％(體積百分?jǐn)?shù))rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1％(重量百分?jǐn)?shù))l-谷氨酰胺，1％(體積百分?jǐn)?shù))hepes，1％(體積百分?jǐn)?shù))雙抗(10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素)，2％(體積百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子(hfcs)和1％(重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶嶺-胸腺嘧啶核苷即hat和甲基纖維素購(gòu)于sigma-aldrich公司。
3.細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后2-3周，細(xì)胞集落長(zhǎng)至肉眼可見時(shí)，用微量移液器將克隆從培養(yǎng)基中挑出，轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板采用hat液體培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至2/3孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。采用兩步篩選法，第一步采用間接elisa方法，篩選出抗甲萘威而不抗載體蛋白bsa的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用甲萘威作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為0的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏度較高指抑制率為50％時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦ic50值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆后采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)亞克隆4-5次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:c201654。
4.抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2抗體可變區(qū)序列測(cè)定。
(1)提取總rna：采用天根公司的總rna提取試劑盒并按照說(shuō)明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2的總rna；
(2)合成cdna：以步驟1獲得的總rna為模板，oligo(dt)15為引物，按照superscripttm-2ii反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna第一鏈；引物oligo(dt)15由invitrogen購(gòu)得；
(3)pcr法克隆可變區(qū)基因：根據(jù)genebank中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cdna為模板擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。pcr程序?yàn)椋?4℃30s、58℃45s、72℃1min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)過1％(重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收dna片段，連接在載體pmd18-t中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為：重鏈可變區(qū)引物為5’-acgacgttgtaaaacgacggc-3’(21mer)和輕鏈可變區(qū)引物為5’-acgacgttgtaaaacgacggc-3’(21mer)和5’-caggggccagtggatagacagatgg-3’(21mer)。
得到的基因序列結(jié)果：重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)339bp，序列如seqidno:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由113個(gè)氨基酸組成，序列如seqidno:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)315bp,序列如seqidno:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由105個(gè)氨基酸組成，序列如seqidno:4所示。
5.抗甲萘威單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將獲得的抗甲萘威單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過的balb/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為：用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上。12000r/min，4℃離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph至7.4，冰浴中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后12000r/min，4℃離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10體積的摩爾濃度為0.01mol/l、ph為7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用0.01mol/lpbs透析兩天，再改用pb透析兩天，將透析袋中蛋白溶液取出，離心，收集上清，棄沉淀，放入-70℃預(yù)凍后放入凍干機(jī)中凍干。收集凍干粉，即為純化好的抗甲萘威單克隆抗體；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得。
用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株jnw1d2分泌的抗甲萘威單克隆抗體的亞型為igg2b。通過酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)測(cè)得抗體的效價(jià)可達(dá)1.6×104。對(duì)甲萘威的50％抑制濃度ic50為0.668ng/kg，與克百威、涕滅威、滅多威等無(wú)交叉反應(yīng)。
實(shí)施例2抗黃曲霉毒素單克隆抗體的獲得
抗黃曲霉毒素單克隆抗體由保藏編號(hào)為cctccno.c201018的雜交瘤細(xì)胞株1c11分泌產(chǎn)生，具體根據(jù)授權(quán)號(hào)為cn201010245095.5的專利中報(bào)道的方法預(yù)先制得，制備方法為：將獲得的雜交瘤細(xì)胞株1c11注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的balb/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化處理后獲得抗黃曲霉毒素單克隆抗體。其中，純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為：用雙層濾紙過濾小鼠腹水，過濾后的腹水于4℃，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30-35μl，室溫混合30-60min，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.1mol/l和ph值7.4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的ph值至7.4，4℃預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/ml，4℃靜置2h以上，然后4℃，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，用純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷凍，然后用冷凍真空干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素單克隆抗體，將抗體置-20℃冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容到100ml所得；所述的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為8g氯化鈉，2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀，加水定容到100ml所得；
實(shí)施例3同步檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威時(shí)間分辨熒光試劑盒及其應(yīng)用
定量檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒，包括熒光試紙條、含有銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體、銪標(biāo)記的甲萘威單克隆抗體、樣品反應(yīng)瓶，所述的熒光試紙條如圖1所示，包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長(zhǎng)度為1mm，免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條中的吸水墊長(zhǎng)18mm，寬4mm；檢測(cè)墊長(zhǎng)25mm，寬4mm；樣品墊長(zhǎng)15mm，寬4mm，相鄰各墊的交疊長(zhǎng)度為1mm；所述檢測(cè)墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和2條檢測(cè)線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，包被量為0.4μg/cm，質(zhì)控線所述檢測(cè)線位于質(zhì)控線下方，個(gè)數(shù)為2條，檢測(cè)線上分別上包被黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物，包被量分別為0.4μg/cm和1μg/cm，包被黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線與硝酸纖維素膜上沿的間距為8mm，質(zhì)控線和包被黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線的間距4mm，兩條檢測(cè)線的間距4mm。
所述熒光試紙條的獲得：
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長(zhǎng)18mm，寬4mm的規(guī)格，即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備
檢測(cè)線的包被：
將甲萘威包被抗原(甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(cnh)偶聯(lián)卵清白蛋白獲得)用包被緩沖液配制成濃度為1mg/ml的包被液；于距硝酸纖維素膜上沿12mm的位置，用劃膜方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需包被抗原的包被量為1.0μg，然后于37℃條件下干燥60分鐘；
將黃曲霉毒素包被抗原(黃曲霉毒素-牛血清白蛋白)用包被緩沖液配制成濃度為0.25mg/ml的包被液；于距硝酸纖維素膜上沿8mm的位置，用劃膜方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需包被抗原的包被量為0.4μg，然后于37℃條件下干燥60分鐘；
所述的包被緩沖液為：每10ml中含有牛血清白蛋白bsa0.1g，疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；
質(zhì)控線的包被：
將兔抗鼠多克隆抗體用包被緩沖液配成濃度為0.25mg/ml的包被液；于距靠近包被黃曲霉毒素包被抗原的檢測(cè)線4mm的位置，用劃膜方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為0.4μg，然后于37℃條件下干燥2小時(shí)；
所述的包被緩沖液為：
每10ml中含有牛血清白蛋白0.1g，疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；
所述的硝酸纖維素膜長(zhǎng)25mm，寬4mm。
(3)樣品墊的制備：
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)15mm，寬4mm的規(guī)格，放入封閉液中浸濕，取出，于37℃條件下干燥6小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液為2.9g十二水磷酸氫二鈉，0.3g二水合磷酸二氫鈉，1.0gtween-20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(pvpk-30)，0.25gedta，0.5g牛血清白蛋白bsa，0.02g疊氮鈉，加水定容至100ml所得；
(4)熒光試紙條的組裝：
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長(zhǎng)度為1mm，即得熒光試紙條。
所述銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體的獲得：
取0.2mol/lph8.18的硼酸緩沖液800μl，加入200μl銪標(biāo)記試劑(粒徑100nm，固形物含量1％)，振蕩混勻。超聲3s。加入40μl15mg/mledc溶液，振蕩混勻15min。13000r/min，10℃，離心10min，去上清液，加入1ml硼酸緩沖液復(fù)溶，振蕩混勻，超聲3s。加入20μg黃曲霉毒素單克隆抗體，混勻，250r/min、25℃下?lián)u床過夜。再次離心去上清，加入1ml含0.5％bsa的硼酸緩沖液復(fù)溶，振蕩混勻，超聲10min，25℃下?lián)u床2h，得目標(biāo)產(chǎn)物銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體。上述銪標(biāo)記試劑可購(gòu)于上海優(yōu)你生物科技有限公司，但不限于此。
所述銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體的獲得：
取0.2mol/lph8.18的硼酸緩沖液800μl，加入200μl銪標(biāo)記試劑(粒徑100nm，固形物含量1％)，振蕩混勻。超聲3s。加入40μl15mg/mledc溶液，振蕩混勻15min。13000r/min，10℃，離心10min，去上清液，加入1ml硼酸緩沖液復(fù)溶，振蕩混勻，超聲3s。加入20μg抗甲萘威單克隆抗體，混勻，250r/min、25℃下?lián)u床過夜。再次離心去上清，加入1ml含0.5％bsa的硼酸緩沖液復(fù)溶，振蕩混勻，超聲10min，25℃下?lián)u床2h，得目標(biāo)產(chǎn)物銪標(biāo)記的抗甲萘威單克隆抗體。上述銪標(biāo)記試劑可購(gòu)于上海優(yōu)你生物科技有限公司，但不限于此。
所述樣品反應(yīng)瓶的獲得:將上述銪標(biāo)記抗黃曲霉毒素單克隆抗體以1：300(v:v)的比例，上述銪標(biāo)記抗甲萘威單克隆抗體以1：250(v:v)的比例加入到一定體積的抗體保護(hù)液中用凍干機(jī)凍干，取銪標(biāo)記抗黃曲霉毒素單克隆抗體凍干品0.1μg和銪標(biāo)記抗甲萘威單克隆抗體凍干品0.3μg放入樣品反應(yīng)瓶中。所述的抗體保護(hù)液為0.01vt％的吐溫-20、0.5wt％蔗糖和1wt％牛血清蛋白(bsa)。
上述的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條黃曲霉毒素、甲萘威定量檢測(cè)中的應(yīng)用：
1.熒光試紙條檢測(cè)線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度的比值(t/c)與黃曲霉毒素、甲萘威濃度的關(guān)系曲線的建立：
(1)對(duì)經(jīng)高效液相色譜法(hplc)檢測(cè)為黃曲霉毒素和甲萘威為陰性的谷物進(jìn)行樣品前處理。取谷物樣品25g，添加80％甲醇水溶液100ml，均質(zhì)提取5分鐘，靜置，過雙層濾紙，搜集濾液，以1：4的比例進(jìn)行稀釋。
(2)對(duì)上述谷物樣品稀釋液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)加標(biāo)，制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將黃曲霉毒素/甲萘威以1：10的比例添加配得各黃曲霉毒素和甲萘威濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。黃曲霉毒素濃度分別為1.5ng/ml、0.5ng/ml、0.15ng/ml、0.05ng/ml、0.015ng/ml、0.005ng/ml的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和15ng/ml、5ng/ml、1.5ng/ml、0.5ng/ml、0.15ng/ml、0.05ng/ml；
(3)取黃曲霉毒素與甲萘威混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液300μl加入樣品瓶，加入到含有銪標(biāo)記的單克隆抗體的樣品反應(yīng)瓶中，混勻，將熒光試紙條樣品墊一端插入反應(yīng)瓶中，37℃反應(yīng)10分鐘，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm。檢測(cè)得到各熒光試紙條檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值(t/c)；
(4)分別以黃曲霉毒素和甲萘威標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液相應(yīng)的檢測(cè)線與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值即t/c值為縱坐標(biāo)，擬合得到關(guān)系曲線。該方法的有效檢測(cè)范圍為甲萘威0.1-1ng/ml；黃曲霉毒素0.02-0.85ng/ml。
2.谷物樣品中黃曲霉毒素和甲萘威含量的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：
取谷物樣品25g，添加80％甲醇水溶液100ml，均質(zhì)提取5分鐘，靜置，過雙層濾紙，搜集濾液，以1：1的比例進(jìn)行稀釋。向其中分別準(zhǔn)確添加黃曲霉毒素(甲萘威)標(biāo)準(zhǔn)品0.1ng/ml、0.5ng/ml和0.8ng/ml，取上述待測(cè)樣品檢測(cè)液300μl加入到含有銪標(biāo)記的單克隆抗體的樣品反應(yīng)瓶中，混勻，將熒光試紙條樣品墊一端插入反應(yīng)瓶中，37℃反應(yīng)10min，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm。檢測(cè)得到各熒光試紙條檢測(cè)線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度的比值(t/c)；然后將其代入上述得到的熒光試紙條檢測(cè)線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度的比值(t/c)與標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)濃度的關(guān)系曲線，得到樣品溶液中的黃曲霉毒素與甲萘威物質(zhì)濃度，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)即可求得樣品中黃曲霉毒素與甲萘威物質(zhì)含量。測(cè)得谷物樣品中的黃曲霉毒素加標(biāo)回收率依次為：106.5％，90.2％，86.1％；甲萘威加標(biāo)回收率依次為：104.1％，89.5％，83.7％。
實(shí)施例5
定量檢測(cè)黃曲霉毒素、甲萘威的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒，包括熒光試紙條、含有銪標(biāo)記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體、銪標(biāo)記的甲萘威單克隆抗體、樣品反應(yīng)瓶，所述的熒光試紙條包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長(zhǎng)度為2mm，免疫層析時(shí)間分辨熒光試紙條中的吸水墊長(zhǎng)18mm，寬3mm；檢測(cè)墊長(zhǎng)25mm，寬3mm；樣品墊長(zhǎng)15mm，寬3mm，相鄰各墊的交疊長(zhǎng)度為2mm；所述檢測(cè)墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和2條檢測(cè)線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，包被量為0.6μg/cm，質(zhì)控線所述檢測(cè)線位于質(zhì)控線下方，個(gè)數(shù)為2條，檢測(cè)線上分別上包被黃曲霉毒素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和甲萘威-卵清白蛋白偶聯(lián)物，包被量分別為0.6μg/cm和0.6μg/cm，靠近質(zhì)控線的檢測(cè)線與硝酸纖維素膜上沿的間距為12mm，質(zhì)控線和第一條檢測(cè)線的間距3mm，兩條檢測(cè)線的間距3mm。
所述的樣品反應(yīng)瓶中銪標(biāo)記抗黃曲霉毒素單克隆抗體凍干品0.2μg和銪標(biāo)記抗甲萘威單克隆抗體凍干品0.2μg放入樣品反應(yīng)瓶中。所述的抗體保護(hù)液為0.1vt％(體積分?jǐn)?shù))的吐溫-20、1wt％蔗糖和0.5wt％牛血清蛋白(bsa)水溶液；銪標(biāo)記抗黃曲霉毒素單克隆抗體制備中銪標(biāo)記試劑以有效量計(jì)與黃曲霉毒素單克隆抗體的質(zhì)量比為1:0.1，銪標(biāo)記抗甲萘威單克隆抗體制備中銪標(biāo)記試劑以有效量計(jì)與甲萘威抗體的質(zhì)量比為1:0.1。
堅(jiān)果樣品中黃曲霉毒素和甲萘威含量的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：取堅(jiān)果樣品5g，添加80％甲醇水溶液20ml，均質(zhì)提取5分鐘，靜置，過雙層濾紙，搜集濾液，以1：1的比例進(jìn)行稀釋。向其中分別準(zhǔn)確添加黃曲霉毒素(甲萘威)標(biāo)準(zhǔn)品0.005ng/ml、0.01ng/ml和0.1ng/ml(0.05ng/ml、0.1ng/ml和1ng/ml)，取上述待測(cè)樣品檢測(cè)液300μl加入到含有銪標(biāo)記的單克隆抗體的樣品反應(yīng)瓶中，混勻，將熒光試紙條樣品墊一端插入反應(yīng)瓶中，37℃反應(yīng)10min，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm。檢測(cè)得到各熒光試紙條檢測(cè)線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度的比值(t/c)；然后將其代入上述得到的熒光試紙條檢測(cè)線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度的比值(t/c)與標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)濃度的關(guān)系曲線，得到樣品溶液中的黃曲霉毒素與甲萘威物質(zhì)濃度，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)即可求得樣品中黃曲霉毒素與甲萘威物質(zhì)含量。測(cè)得堅(jiān)果樣品中的黃曲霉毒素加標(biāo)回收率依次為：103.0％，92.0％，85.4％；甲萘威加標(biāo)回收率依次為：108.5％，91.5％，80.9％。
序列表
＜110＞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
＜120＞同步檢測(cè)黃曲霉毒素和甲萘威混合污染的時(shí)間分辨熒光免疫層析試劑盒、制備方法及應(yīng)用
＜160＞4
＜210＞1
＜211＞339bp
＜212＞dna
＜213＞小鼠
＜400＞1
caggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagag50
cctgtccatcacttgcactgtctctgggctttcattaaccagctatggtg100
tacactgggttcgtcaggccccaggaaagggtctggagtggctgggagta150
atttggggtggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagact200
gagcatcagcaaagacaactccaggagccaagttttcttaagaatgaaca250
gtctgcaaattgatgacacagccatgtactattgtgccagaggcaggatg300
gactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgtca339
＜210＞1
＜211＞315bp
＜212＞dna
＜213＞小鼠
＜400＞2
gacatcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctaggaga50
aagagtcactatcacttgcaaggcgagtcaggacattagtagctatttag100
gctggttacagcagaaaccagggaaatctcctaagaccctgatctatcgt150
gcaaacacattggtagaaggggtcccatccagattcagtggcagtggatc200
tggggaagattattctctcaccatcagcagcctggagtatgaagatatgg250
gaatttattattgtctacagtatgatgagtttccgtacacgttcggaggg300
gggaccaagctggaa315
＜210＞1
＜211＞113
＜212＞prt
＜213＞小鼠
＜400＞3
glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvalalaproserglnserleuserile
15101520
thrcysthrvalserglyleuserleuthrsertyrglyvalhistrpvalargglnala
25303540
proglylysgluleuglutrpleuglyvaliletrpglyglyglyasnthrasntyrasn
45505560
seralaleumetserargleuserileserlysaspasnserargserglnvalpheleu
65707580
argmetasnserleuglnileaspaspthralamettyrtyrcysalaargglyargmet
81859095100
asptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserser
105110113
＜210＞1
＜211＞105
＜212＞prt
＜213＞小鼠
＜400＞4
aspilelysmetthrglnserprosersermettyralaserleuglygluargvalthr
15101520
ilethrcyslysalaserglnaspilesersertyrleuglythrleuglnglnlyspro
25303540
glylysserprolysthrleuiletyrargalaasnthrleuvalgluglyvalproser
45505560
argpheserglyserglyserglygluasptyrserleuthrileserserleugluthr
65707580
gluaspmetglyiletyrtyrcysleuglntyraspglupheprotyrthrpheglygly
859095100
glythrlysleuglu
105