本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、側(cè)流層析技術(shù)等領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及一種用熒光免疫層析技術(shù)檢測(cè)真菌毒素的試紙條；此外，本發(fā)明還涉及一種用熒光免疫層析技術(shù)來(lái)檢測(cè)真菌毒素的方法。

背景技術(shù)：

糧食飼料在收獲時(shí)未被充分干燥或貯運(yùn)過(guò)程中溫度或濕度過(guò)高，就會(huì)使帶染在糧食飼料上的真菌迅速生長(zhǎng)，真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物叫真菌毒素。真菌毒素包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族鐮刀菌毒素（T-2毒素）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）、赭曲霉毒素A、伏馬毒素、展青霉素、玉米赤霉醇等。許多國(guó)家在玉米、花生及花生油、花生餅、花生醬、棉籽餅、山核桃、無(wú)花果、榛子、可可豆、杏仁、奶粉、牛奶、水牛奶、酸奶、奶酪、大米等都曾查出黃曲霉毒素。真菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物都有害，如黃曲霉毒素或玉米赤霉烯酮會(huì)使人致癌或不孕、流產(chǎn)。鐮刀菌毒素急性中毒會(huì)引起全身痙攣、心力衰竭死亡，慢性中毒常會(huì)引起胃炎、惡心、口、鼻、咽及消化道出血等。因此，有必要對(duì)飼料、面粉、大米、大豆、奶的原料和加工產(chǎn)品都進(jìn)行這些真菌毒素的監(jiān)測(cè)。

目前檢測(cè)真菌毒素的方法主要有色譜法、質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）以及膠體金免疫層析法。其中色譜法、質(zhì)譜法、ELISA都要用到昂貴的設(shè)備，需要專業(yè)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中操作，而且操作步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)。膠體金免疫層析法則操作簡(jiǎn)單、方便、快速且便宜，但是其靈敏度較低，而且不能定量檢測(cè)。因此有必要提供一種快速、方便、簡(jiǎn)單且高靈敏度的真菌毒素定量檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決本領(lǐng)域中的上述各種問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)。具體地，本發(fā)明的目的就是要提供一種方便、快速而且高靈敏度地檢測(cè)樣品中的真菌毒素的試紙條和方法。

具體的，本發(fā)明提供了一種用熒光免疫層析技術(shù)檢測(cè)樣品中的真菌毒素的試紙條。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用免疫層析技術(shù)檢測(cè)真菌毒素的試紙條，包括標(biāo)記物墊和捕獲膜，其特征在于，所述標(biāo)記物墊含有熒光微球標(biāo)記的真菌毒素抗原，所述捕獲膜含有真菌毒素檢測(cè)抗體。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述熒光微球是時(shí)間分辨熒光微球。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述時(shí)間分辨熒光微球是含銪復(fù)合物的微球。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是黃曲霉毒素。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是嘔吐毒素。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是赭曲霉毒素A。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是T-2毒素。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，其特征在于，所述真菌毒素是伏馬毒素。

在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用免疫層析技術(shù)檢測(cè)真菌毒素的方法，其特征在于，在權(quán)利要求1所述的試紙條樣品墊上滴加含真菌毒素的樣品，反應(yīng)后檢測(cè)熒光信號(hào)。

詳細(xì)說(shuō)明

用免疫層析技術(shù)檢測(cè)樣品中真菌毒素的試紙條如圖1示，包括樣品墊1，標(biāo)記物墊2，捕獲膜3，吸水墊4，支撐底板5。捕獲膜3上含有C線6和T線7。

其中樣品墊一般為玻璃纖維、濾紙或?yàn)V血膜。標(biāo)記物墊可為玻璃纖維、濾紙或聚酯膜。當(dāng)樣品墊和標(biāo)記物墊材質(zhì)相同時(shí)可整合在一起，用一條玻璃纖維、濾紙或聚酯膜來(lái)完成樣品墊和標(biāo)記物墊的功能。所述標(biāo)記物墊含有熒光微球標(biāo)記的真菌毒素抗原，還可以含有熒光微球標(biāo)記的對(duì)照蛋白或抗體，如鏈親和素或兔抗體（兔IgG）。

捕獲膜可以是硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍膜等，所述捕獲膜的T線含有真菌毒素檢測(cè)抗體，C線為陽(yáng)性對(duì)照，C線含有用于試紙條質(zhì)量控制的蛋白或抗體，如生物素標(biāo)記的牛血清白蛋白或卵清蛋白（標(biāo)記物墊上含鏈親和素），或者羊抗兔抗體（標(biāo)記物墊上含兔抗體）。

用免疫層析技術(shù)檢測(cè)樣品中真菌毒素的方法，如圖1示，當(dāng)樣品溶液滴加到試紙條的樣品墊1上后，液體將沿水平箭頭方向移動(dòng)，先到達(dá)標(biāo)記物墊2，樣品中的真菌毒素將與標(biāo)記物墊2中熒光微球標(biāo)記的真菌毒素抗原、熒光微球標(biāo)記的兔抗一起向前移動(dòng)，當(dāng)溶液移動(dòng)到達(dá)捕獲膜的T線時(shí)，溶液中的真菌毒素、‘真菌毒素抗原～熒光微球’將一起競(jìng)爭(zhēng)與固定在T線上的真菌毒素抗體結(jié)合。如果樣品中的真菌毒素濃度高，則主要是樣品中的真菌毒素與T線上的真菌毒素抗體結(jié)合，形成‘真菌毒素-真菌毒素檢測(cè)抗體’復(fù)合物，而標(biāo)記物墊上釋放的‘真菌毒素抗原～熒光微球’則捕獲較少，T線位置熒光信號(hào)較弱；如果樣品中的真菌毒素濃度較低，則樣品中的真菌毒素與T線上的真菌毒素檢測(cè)抗體結(jié)合較少，而T線上的真菌毒素抗體捕獲的‘真菌毒素抗原～熒光微球’較多，形成了較多的‘真菌毒素抗體-真菌毒素抗原～熒光微球’復(fù)合物，T線位置熒光信號(hào)較強(qiáng)。而標(biāo)記物墊釋放的兔IgG~熒光微球則繼續(xù)移動(dòng)，可被C線處能結(jié)合兔IgG的羊抗兔二抗結(jié)合。隨后用檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)T線上的熒光信號(hào)，并與熒光信號(hào)-真菌毒素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算出待測(cè)樣品中真菌毒素的濃度。

由于T線處真菌毒素抗體捕獲的熒光微球包含有很多熒光分子，所以T線處可以檢測(cè)到很強(qiáng)的熒光信號(hào)，從而使這種免疫層析技術(shù)檢測(cè)真菌毒素的方法有很高的靈敏度。當(dāng)熒光分子是時(shí)間分辨熒光復(fù)合物時(shí)，由于發(fā)射光有數(shù)百微秒到數(shù)毫秒的熒光壽命，可以在激發(fā)光撤掉后數(shù)十微秒到數(shù)百微秒檢測(cè)發(fā)射光信號(hào)，此時(shí)激發(fā)光和背景熒光都已經(jīng)消失，只有熒光分子特異的熒光信號(hào)，所以檢測(cè)的特異性和靈敏度都大大提高。

本發(fā)明中的‘真菌毒素’指真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族鐮刀菌毒素（T-2毒素）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）、赭曲霉毒素A、伏馬毒素、展青霉素、玉米赤霉醇等。

本發(fā)明中的‘微球’可以是二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或其他高分子微球，微球直徑在10nm到10μm之間，其表面可帶有羧基、氨基或酮基等官能團(tuán)。

本發(fā)明中的‘熒光微球’指球體中包埋了熒光分子的微球。所述‘熒光分子’包括熒光素、羅丹明等熒光分子或其衍生物、銪復(fù)合物、釤復(fù)合物、鋱復(fù)合物等鑭系元素復(fù)合物熒光分子以及鉑復(fù)合物、鈀復(fù)合物等磷光分子，其中銪復(fù)合物為銪與配體螯合后再與其他有機(jī)分子形成的復(fù)合物，鉑復(fù)合物為鉑與配體（包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物）螯合形成的復(fù)合物，其中銪復(fù)合物又為時(shí)間分辨熒光復(fù)合物，鉑復(fù)合物又為磷光復(fù)合物。

本發(fā)明中的‘熒光微球標(biāo)記的真菌毒素抗原’指跟熒光微球耦聯(lián)的真菌毒素抗原。該真菌毒素抗原為真菌毒素與蛋白的耦合物，該蛋白可以是BSA、卵清蛋白或其他蛋白。

本發(fā)明中的‘真菌毒素抗體’指結(jié)合在試紙條捕獲膜上的真菌毒素抗體。更具體的，真菌毒素抗體為用跟牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白或其他蛋白耦聯(lián)的真菌毒素免疫動(dòng)物后動(dòng)物血液中出現(xiàn)的能跟真菌毒素特異性結(jié)合的抗體。

本發(fā)明中試紙條捕獲膜上的‘T線’指真菌毒素抗體所在的區(qū)域，也就是熒光微球標(biāo)記的真菌毒素抗原與真菌毒素抗體結(jié)合的區(qū)域。

本發(fā)明中試紙條捕獲膜上的‘C線’指熒光微球標(biāo)記的兔IgG與羊抗兔二抗結(jié)合的區(qū)域，或者其他作為試紙條質(zhì)量控制的抗體或抗原所在的區(qū)域。

因?yàn)檎婢舅囟拘院艽螅燥暳匣蚴称分屑词购倭康恼婢舅?，也?huì)對(duì)身體產(chǎn)生傷害。而本發(fā)明可以通過(guò)免疫層析法方便、簡(jiǎn)單、快速并且高靈敏度地檢測(cè)樣品中的真菌毒素，避免含真菌毒素的飼料或食品被人或動(dòng)物食用而對(duì)身體產(chǎn)生傷害。

附圖說(shuō)明

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)不同的實(shí)施方式，參考下列附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述。附圖僅為示例目的而提供，并且僅描述本發(fā)明典型或示例性的實(shí)施方式。這些附圖被提供以促進(jìn)讀者對(duì)本發(fā)明的理解，將不被認(rèn)為限制本發(fā)明的寬度、范圍或應(yīng)用性。

圖1是本發(fā)明中熒光免疫層析檢測(cè)真菌毒素的試紙條示意圖。圖1中，附圖標(biāo)記1-7說(shuō)明：1-樣品墊；2-標(biāo)記物墊；3-捕獲膜；4-吸水墊；5-支撐底板；6-C線；7-T線。

圖2是實(shí)施例中用熒光免疫層析法所得熒光強(qiáng)度與真菌毒素濃度的關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1，用熒光免疫層析檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素M1的試紙條的制備

圖1所示的用免疫層析檢測(cè)黃曲霉毒素M1的試紙條準(zhǔn)備方法如下：

1，羧基修飾的含銪復(fù)合物的SiO₂微球由長(zhǎng)春志昂生物科技有限公司提供，黃曲霉毒素M1抗體以及黃曲霉毒素M1抗原由北京為康惠華生物技術(shù)有限公司提供。

2，熒光微球與黃曲霉毒素M1抗原、兔IgG的耦聯(lián)

將200μl 20mM PBS, pH7.4，固含量1%的熒光微球與6毫克碳化二亞胺混合，室溫振蕩30分鐘，12,000rpm離心10分鐘，用硼酸鹽緩沖液清洗2次，將活化的熒光微球重懸于300μl硼酸鹽緩沖液中。在微球懸液中加入200μl 1mg/ml的黃曲霉毒素M1抗原，在室溫下振蕩反應(yīng)2.5小時(shí)。將反應(yīng)后的溶液于12,000rpm離心10分鐘，加入400μl 0.25M乙醇胺在室溫再振蕩30分鐘。將反應(yīng)后的溶液離心后再用PBS緩沖液洗2次。離心沉淀后加入300μl 2mg/ml的BSA重懸，常溫振蕩30分鐘后用PBS洗3次，再用200μl 50mM PBS, pH7.4, 0.1% Tween 20, 5%蔗糖重懸熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗原。

兔IgG與熒光微球的藕聯(lián)同上方法。

3，熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗原、熒光微球標(biāo)記的兔IgG處理標(biāo)記物墊，黃曲霉毒素M1抗體以及羊抗兔抗體（美國(guó)Sigma公司）處理捕獲膜

將熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗原溶液與熒光微球標(biāo)記的兔IgG溶液等體積混合，再用BioDot噴膜儀噴到標(biāo)記物墊（Millipore公司）上，噴速為9μl/cm。將1mg/ml黃曲霉毒素M1抗體以及1mg/ml羊抗兔抗體用BioDot公司噴膜儀劃線捕獲膜（Millipore公司NC膜），劃線速度為2μl/cm。然后將噴好的標(biāo)記物墊和捕獲膜置于37°C恒溫箱中干燥1小時(shí)，再將標(biāo)記物墊上含有熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗原的部分切割下來(lái)，得到5mm寬，30cm長(zhǎng)的條帶。

4，試紙條大卡的組裝與切割

按照?qǐng)D1中試紙條的結(jié)構(gòu)所示，將捕獲膜首先粘貼在支撐底板（Millipore公司）上，在靠T線一側(cè)先后粘貼標(biāo)記物墊以及樣品墊（Millipore公司），在靠C線一側(cè)粘貼吸水墊（Millipore公司），然后用BioDot公司切割機(jī)切割成5mm寬的試紙條，于鋁箔袋中封閉保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2，用熒光免疫層析法檢測(cè)樣品中的黃曲霉毒素M1

將100μl 含0μg/L, 0.05μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 50μg/L的黃曲霉毒素M1溶液分別滴加到免疫層析試紙條上，反應(yīng)15分鐘后用熒光檢測(cè)儀（上海海躍塑模有限公司）檢測(cè)熒光信號(hào)，然后用熒光強(qiáng)度相對(duì)黃曲霉毒素M1濃度作圖得熒光強(qiáng)度對(duì)黃曲霉毒素M1濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

將100μl含黃曲霉毒素M1的牛奶滴加到免疫層析試紙條的樣品墊上，反應(yīng)15分鐘后檢測(cè)熒光信號(hào)，將熒光強(qiáng)度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得黃曲霉毒素M1濃度為0.45μg/L，與用ELISA法檢測(cè)的結(jié)果一致，說(shuō)明免疫層析定量檢測(cè)黃曲霉毒素M1的方法是可靠的。

實(shí)施例3，用熒光免疫層析法檢測(cè)樣品中的玉米赤霉烯酮

檢測(cè)玉米赤霉烯酮的試紙條制備方法同實(shí)施例1，其中的黃曲霉毒素抗原更換為玉米赤霉烯酮抗原，黃曲霉毒素抗體更換為玉米赤霉烯酮抗體，玉米赤霉烯酮的抗原和抗體也由北京為康惠華生物技術(shù)有限公司提供。

將100μl 含0μg/L, 0.05μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 50μg/L的玉米赤霉烯酮溶液分別滴加到免疫層析試紙條上，反應(yīng)15分鐘后用檢測(cè)儀（上海海躍塑模有限公司）檢測(cè)熒光信號(hào)，然后用熒光強(qiáng)度相對(duì)玉米赤霉烯酮濃度作圖得熒光強(qiáng)度對(duì)玉米赤霉烯酮濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取100μl含玉米赤霉烯酮的樣品溶液滴加到免疫層析試紙條的樣品墊上，反應(yīng)15分鐘后檢測(cè)熒光信號(hào)，將熒光強(qiáng)度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得玉米赤霉烯酮濃度為0.4μg/L，與用ELISA法檢測(cè)的結(jié)果一致，說(shuō)明免疫層析定量檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法是可靠的。

雖然本申請(qǐng)?jiān)敿?xì)描述了具體的實(shí)施例，但本申請(qǐng)不限于這些實(shí)施例，相反，其意圖涵蓋包括在實(shí)施例的精神和范圍內(nèi)的各種修改和等同方案，在一些具體情況下，可以缺少和增加某個(gè)或某些技術(shù)特征而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，本申請(qǐng)的范圍僅由權(quán)利要求書限定。