本發(fā)明涉及預測標志物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種結(jié)腸癌預后預測標志物及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，疾病發(fā)生率在男性中排名第三位，病死率第四位，在女性疾病發(fā)病率中排名第二位，病死率達第三位。結(jié)腸癌的發(fā)生始于結(jié)腸組織細胞在異常的生物、物理、化學或其他環(huán)境因素的刺激下產(chǎn)生異常病變并最終產(chǎn)生癌變。在過去的幾十年中，許多國家或地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前針對結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)為主，結(jié)合放療化療為輔的綜合治療方法。但目前結(jié)腸癌的預后情況很差，術(shù)后存在生存率低、耐藥性高或復發(fā)轉(zhuǎn)移的情況，對病人及其家人身體及經(jīng)濟上帶來很大的負擔，嚴重影響著人們的生活水平。目前在臨床實踐中結(jié)腸癌的預后分級以病理學癥狀作為最重要和最可靠的預后指標，而分子標志物被認為是結(jié)腸癌預后生存診斷的新發(fā)展方向。目前，研究者發(fā)現(xiàn)包括CD166、CD44、CD29、lgr5和β-catenin等基因在結(jié)腸癌組織中存在異常表達的情況，對這些關(guān)鍵分子標志在患者中的表達量測量有望成為新的結(jié)腸癌的預后診斷方式。盡管如此，這些標志物仍未進入臨床應用階段，而許多更加特異的結(jié)腸癌分子標志物有待開發(fā)。PBRM1(Polybromo-1)，又名BAF180或PB1，其編碼基因位于人類染色體3p21區(qū)段，蛋白編碼長度為1689個氨基酸。PBRM1蛋白是SWI/SNF染色體重塑家族復合物核心成分之一，介導ATP依賴的染色質(zhì)重塑過程。PBRM1基因廣泛參與了如細胞增殖、DNA修復、細胞黏附等多種生物學過程。研究表明，PBRM1基因在多種癌癥中扮演著抑癌基因的作用。腎癌中，PBRM1基因通過調(diào)節(jié)BCL-2家族及Caspase家族基因的表達水平來調(diào)控凋亡，最后引起癌變。子宮內(nèi)膜癌中PBRM1基因的表達分析也發(fā)現(xiàn)PBRM1基因的表達量癌旁組織明顯高于癌組織。但是，目前對于PBRM1基因在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用機制尚不明確。因此，現(xiàn)有技術(shù)有待于改進和發(fā)展。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)腸癌預后預測標志物及其檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中結(jié)腸癌預后標志物匱乏及特異性較低等問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種結(jié)腸癌預后預測標志物，其中，所述結(jié)腸癌預后預測標志物為PBRM1蛋白。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，采用免疫組織化學法對樣本組織中的PBRM1蛋白進行定量檢測，確定樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，具體包括：對樣本組織進行免疫組織化學檢測，檢測樣本組織中的染色指數(shù)，根據(jù)檢測到的樣本組織的染色指數(shù)確定樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，根據(jù)檢測到的樣本組織的染色指數(shù)確定樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況的確定方法為：當檢測到樣本組織的染色指數(shù)≥6時，判斷PBRM1蛋白為高表達；反之，當檢測到樣本組織的染色指數(shù)<6時，判斷PBRM1蛋白為低表達。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，PBRM1蛋白定量檢測時，使用到的定量檢測試劑包括與PBRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，PBRM1蛋白定量檢測時，使用到的定量檢測試劑還包括檢測緩沖液。有益效果：本發(fā)明的PBRM1蛋白可以有效區(qū)分結(jié)腸癌病人術(shù)后生存期，從而為結(jié)腸癌預后診斷提供了新途徑，為臨床醫(yī)生對于結(jié)腸癌病情分析提供了參考依據(jù)。附圖說明圖1為結(jié)腸癌組織免疫組織化學染色的顯微圖(100μm)。圖2為癌旁組織免疫組織化學染色的顯微圖(100μm)。圖3為結(jié)腸癌組織免疫組織化學染色的顯微圖(50μm)。圖4為癌旁組織免疫組織化學染色的顯微圖(50μm)。圖5為結(jié)腸癌組織經(jīng)H&E染色后的顯微圖。圖6為癌旁組織經(jīng)H&E染色后的顯微圖。圖7為結(jié)腸癌組織及癌旁組織的染色指數(shù)評分示意圖。圖8為PBRM1蛋白表達水平與病人預后生存率的關(guān)系圖。具體實施方式本發(fā)明提供一種結(jié)腸癌預后預測標志物及其檢測方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明結(jié)腸癌預后診斷是指對結(jié)腸癌病人的生存期進行預測或判斷，其中，結(jié)腸癌患者為腫瘤切除術(shù)后患者。本發(fā)明提供一種結(jié)腸癌預后預測標志物，其中，所述結(jié)腸癌預后預測標志物為PBRM1蛋白。本發(fā)明的PBRM1蛋白在結(jié)腸癌臨床病理樣本中存在異常表達的情況，并且其表達量與病人預后狀況顯著關(guān)聯(lián)，可作為新的分子標志物用于結(jié)腸癌預后診斷。PBRM1蛋白為結(jié)腸癌預后診斷提供了新途徑，為臨床醫(yī)生對于結(jié)腸癌病情分析提供了參考依據(jù)。本發(fā)明還提供一種基于如上所述結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法，其中，采用免疫組織化學法對樣本組織中的PBRM1蛋白進行定量檢測，確定樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況。本發(fā)明的PBRM1蛋白的表達量與結(jié)腸癌病人預后狀況顯著關(guān)聯(lián)，而結(jié)腸癌病人預后狀況是指結(jié)腸癌病人的生存期長短情況，根據(jù)樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況，可預估結(jié)腸癌預后生存期長短。本發(fā)明PBRM1蛋白的定量檢測方法為本領(lǐng)域常見的蛋白定量檢測方法，可以為電泳法、色譜法或免疫組織化學法。優(yōu)選地，本發(fā)明采用免疫組織化學法對樣本組織中的PBRM1蛋白進行定量檢測。本發(fā)明上述檢測方法具體包括：對樣本組織進行免疫組織化學檢測，定量檢測樣本組織中的染色指數(shù)，根據(jù)檢測到的樣本組織的染色指數(shù)確定樣本組織中PBRM1蛋白的表達水平情況。當檢測到的樣本組織的染色指數(shù)≥6時，判斷PBRM1蛋白為高表達，表明結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期長；反之，當檢測到的樣本組織的染色指數(shù)<6時，判斷PBRM1蛋白為低表達，表明結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期短。本發(fā)明PBRM1蛋白定量檢測時，使用到的定量檢測試劑包括與PBRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體。所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。例如，所述抗體為抗PBRM1的多克隆抗體，可購于美國Millipore公司，其貨號為ABE70，稀釋比例為1:4000。所述PBRM1蛋白的定量檢測試劑還包括檢測緩沖液。下面通過實施例對本發(fā)明結(jié)腸癌預后預測標志物的檢測方法進行詳細說明。先將組織切片在63℃烘箱中烘烤60分鐘，然后二甲苯脫蠟2次，每次15分鐘，無水乙醇清洗2次，每次7分鐘，接著梯度乙醇水化(90％，80％，70％)，每次5分鐘，然后置于純水中洗滌2次，每次1分鐘。隨后進行檸檬酸高壓修復，檸檬酸修復液沸騰后，將組織切片放入高壓鍋中，蓋上高壓鍋蓋，待出氣后開始計時5分鐘。將高壓鍋蓋打開，使其自然冷卻30分鐘，接著在組織切片上滴加商品化即用阻斷劑，孵育10分鐘，1×PBS洗滌3次，每次1分鐘，加入兔源抗PBRM1多克隆抗體(抗體購于美國Millipore公司，貨號ABE70，稀釋比例1:4000)，室溫孵育30分鐘，隨后取出組織切片經(jīng)1×PBS洗滌3次，每次1分鐘，隨后滴加抗兔二抗工作液(購于丹麥DAKO公司，試劑盒貨號為DAKOK8000IHC)室溫孵育30分鐘，1×PBS洗滌3次，每次2分鐘，在組織切片上滴加DAB試劑進行顯色，觀察顯色強度，蘇木素復染(購于美國Sigma公司)1分鐘，再用0.25％的鹽酸酒精中浸沒2s，用自來水沖洗2分鐘，室溫晾干后封片，使用儀器DAKOAutostainerLink48進行鏡檢和染色指數(shù)評分。根據(jù)現(xiàn)有標準，對樣本組織切片進行免疫組織分析。隨后對樣本染色程度進行評估，具體方法為：顯微鏡下細胞被染成黃色或棕黃色,陽性細胞數(shù)得分為：0％,0分；1％～25％,1分；26％～50％，2分；51％～75％，3分；≥76％,4分；染色強度得分為：0(無染色)，1(淺黃)，2(棕黃)，3(淺褐)，4(深褐)。陽性細胞數(shù)得分和染色強度得分之和為樣本的最終的染色指數(shù)。根據(jù)染色指數(shù)數(shù)值來評估PBRM1蛋白在結(jié)腸癌癌組織中的表達水平，染色指數(shù)<6視為低表達，染色指數(shù)≥6視為高表達。本發(fā)明結(jié)腸癌病理樣本根據(jù)AJCC(AmericanJointCommitteeonCancer)分期系統(tǒng)第七版病理標準進行分級，具體地，原發(fā)腫瘤(T)分期，Tx:原發(fā)腫瘤無法評估；T0:沒有原發(fā)腫瘤的證據(jù)；Tis：原位癌：上皮內(nèi)癌或粘膜內(nèi)癌未穿透粘膜肌層而達粘膜下層；T1:腫瘤侵及粘膜下層；T2：腫瘤侵及腸壁固有肌層；T3:腫瘤侵透固有肌層并侵達漿膜下，或原發(fā)病灶位于無漿膜層的結(jié)腸、直腸時、腫瘤已侵及結(jié)腸旁或直腸旁組織；T4：腫瘤已穿透腹膜或直接侵入其他臟器。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)分期，Nx:區(qū)域淋巴結(jié)無法評估；N0:區(qū)域淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移；N1:1～3個區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N2:≥4個區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠處轉(zhuǎn)移(M)分期，M0:無遠處轉(zhuǎn)移；M1:有遠處轉(zhuǎn)移。最終臨床分期為I期:T1～2N0M0；IIA期:T3N0M0；IIB期:T4N0M0；IIIA期:T1～2N1M0；IIIB期:T3～4N1M0；IIIC期:任何TN2M0；IV期：任何T任何NM1。根據(jù)腫瘤組織鏡檢狀態(tài)進行病理分級為：鏡檢清晰可視(I級)，鏡檢中度可視(II級)，鏡檢難以分辨(III級)。下面通過實施例對PBRM1蛋白在結(jié)腸癌預后預測的應用進行詳細說明。試驗一：免疫組織化學檢測PBRM1基因的PBRM1蛋白在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)：為了審查PBRM1蛋白在結(jié)腸癌病例組織中的表達模式，我們將90例結(jié)腸癌病理樣本(每個病例包含癌組織和癌旁組織)進行免疫組織化學染色。樣本1、患者都經(jīng)由病理診斷和臨床診斷后確診；2、患者年齡均大于18周歲；3、患者癌組織樣本和癌旁組織樣本是在術(shù)中通過電切或全切獲得；4、組織樣本在收集后立即進行蠟封；5、經(jīng)HE染色(hematoxylin-eosinstaining，蘇木精-伊紅染色法)顯示腫瘤組織超過80％。表1、樣本信息參照表根據(jù)現(xiàn)有報道標準，對樣本組織石蠟切片進行免疫組織化學分析，具體方法如上文所述。隨后對樣本染色程度進行評估，具體方法為：顯微鏡下細胞被染成黃色或棕黃色,陽性細胞數(shù)得分為：0％,0分；1％～25％,1分；26％～50％，2分；51％～75％，3分；≥76％,4分；染色強度得分為：0(無染色)，1(淺黃)，2(棕黃)，3(淺褐)，4(深褐)。陽性細胞數(shù)得分和染色強度得分之和為樣本的最終染色指數(shù)。根據(jù)染色指數(shù)數(shù)值來評估PBRM1蛋白在結(jié)腸癌癌組織中的表達，染色指數(shù)<6視為低表達，染色指數(shù)≥6視為高表達。如圖1～4所示，圖1～4為具有代表性的結(jié)腸癌組織及對應癌旁組織免疫組織化學染色的顯微圖。圖5和圖6分別為結(jié)腸癌組織及癌旁組織經(jīng)H&E染色后的顯微圖。圖7為結(jié)腸癌組織及癌旁組織的染色指數(shù)評分(染色指數(shù))示意圖。由上述圖可看出，PBRM1蛋白在癌組織中染色強度低，但在癌旁組織中染色強度高。試驗二：PBRM1蛋白免疫組織化學檢測與患者預后生存期分析：為了審查PBRM1蛋白在結(jié)腸癌預后診斷的臨床意義，我們將90例結(jié)腸癌病理樣本制備組織芯片，進行免疫組織化學染色，并根據(jù)染色程度進行染色指數(shù)評分，以此將PBRM1蛋白分為高表達組(染色指數(shù)≥6)和低表達組(染色指數(shù)<6)，使用SPSS21.0進行Kaplan-Meier生存分析，檢驗表達模式與預后存活時間的相關(guān)性。進一步，本發(fā)明使用單一變量和多重變量COX回歸分析對PBRM1蛋白表達水平作為獨立預后預測指標的可能性進行評估。同時，本發(fā)明利用卡方檢驗(chi-squaretest)對PBRM1蛋白表達水平與結(jié)腸癌病人各種臨床指標的相關(guān)性進行分析，以映證其作為臨床標記物的重要性。表2、參與驗證試驗的病人信息及PBRM1蛋白在癌組織和癌旁組織中的染色指數(shù)評分(即染色指數(shù))如圖8所示為PBRM1蛋白高表達與病人預后生存率的關(guān)系圖，其中PBRM1蛋白高表達患者組(染色指數(shù)≥6)生存時間較PBRM1蛋白低表達患者組(染色指數(shù)<6)預后存活率高(LogRankp＝0.008)。表3、單一變量COX回歸分析結(jié)腸癌患者中不同預測指標與預后生存率的關(guān)系表4、多重變量COX回歸分析結(jié)腸癌患者中不同預測指標與預后生存率的關(guān)系變量危險比[95％置信區(qū)間]p值年齡1.023[0.989,1.058]0.190臨床分級1.894[0.657,5.461]0.237性別1.390[0.765,2.525]0.280淋巴結(jié)狀態(tài)1.182[0.297,4.695]0.812瘤體直徑大于5cm1.501[0.793,2.840]0.212PBRM1表達水平0.485[0.243,0.969]0.040表5.統(tǒng)計分析PBRM1蛋白表達量與結(jié)腸癌病人臨床指標的關(guān)系本發(fā)明的人PBRM1蛋白氨基酸序列如下：MGSKRRRATSPSSSVSGDFDDGHHSVSTPGPSRKRRRLSNLPTVDPIAVCHELYNTIRDYKDEQGRLLCELFIRAPKRRNQPDYYEVVSQPIDLMKIQQKLKMEEYDDVNLLTADFQLLFNNAKSYYKPDSPEYKAACKLWDLYLRTRNEFVQKGEADDEDDDEDGQDNQGTVTEGSSPAYLKEILEQLLEAIVVATNPSGRLISELFQKLPSKVQYPDYYAIIKEPIDLKTIAQRIQNGSYKSIHAMAKDIDLLAKNAKTYNEPGSQVFKDANSIKKIFYMKKAEIEHHEMAKSSLRMRTPSNLAAARLTGPSHSKGSLGEERNPTSKYYRNKRAVQGGRLSAITMALQYGSESEEDAALAAARYEEGESEAESITSFMDVSNPFYQLYDTVRSCRNNQGQLIAEPFYHLPSKKKYPDYYQQIKMPISLQQIRTKLKNQEYETLDHLECDLNLMFENAKRYNVPNSAIYKRVLKLQQVMQAKKKELARRDDIEDGDSMISSATSDTGSAKRKSKKNIRKQRMKILFNVVLEAREPGSGRRLCDLFMVKPSKKDYPDYYKIILEPMDLKIIEHNIRNDKYAGEEGMIEDMKLMFRNARHYNEEGSQVYNDAHILEKLLKEKRKELGPLPDDDDMASPKLKLSRKSGISPKKSKYMTPMQQKLNEVYEAVKNYTDKRGRRLSAIFLRLPSRSELPDYYLTIKKPMDMEKIRSHMMANKYQDIDSMVEDFVMMFNNACTYNEPESLIYKDALVLHKVLLETRRDLEGDEDSHVPNVTLLIQELIHNLFVSVMSHQDDEGRCYSDSLAEIPAVDPNFPNKPPLTFDIIRKNVENNRYRRLDLFQEHMFEVLERARRMNRTDSEIYEDAVELQQFFIKIRDELCKNGEILLSPALSYTTKHLHNDVEKERKEKLPKEIEEDKLKREEEKREAEKSEDSSGAAGLSGLHRTYSQDCSFKNSMYHVGDYVYVEPAEANLQPHIVCIERLWEDSAEKEVFKSDYYNKVPVSKILGKCVVMFVKEYFKLCPENFRDEDVFVCESRYSAKTKSFKKIKLWTMPISSVRFVPRDVPLPVVRVASVFANADKGDDEKNTDNSEDSRAEDNFNLEKEKEDVPVEMSNGEPGCHYFEQLHYNDMWLKVGDCVFIKSHGLVRPRVGRIEKVWVRDGAAYFYGPIFIHPEETEHEPTKMFYKKEVFLSNLEETCPMTCILGKCAVLSFKDFLSCRPTEIPENDILLCESRYNESDKQMKKFKGLKRFSLSAKVVDDEIYYFRKPIVPQKEPSPLLEKKIQLLEAKFAELEGGDDDIEEMGEEDSESTPKSAKGSAKKEGSKRKINMSGYILFSSEMRAVIKAQHPDYSFGELSRLVGTEWRNLETAKKAEYEGMMGGYPPGLPPLQGPVDGLVSMGSMQPLHPGGPPPHHLPPGVPGLPGIPPPGVMNQGVAPMVGTPAPGGSPYGQQVGVLGPPGQQAPPPYPGPHPAGPPVIQQPTTPMFVAPPPKTQRLLHSEAYLKYIEGLSAESNSISKWDQTLAARRRDVHLSKEQESRLPSHWLKSKGAHTTMADALWRLRDLMLRDTLNIRQAYNLENV綜上所述，本發(fā)明提供一種結(jié)腸癌預后預測標志物及其檢測方法，本發(fā)明的PBRM1蛋白表達水平可以有效區(qū)分結(jié)腸癌病人術(shù)后生存期長短，從而為結(jié)腸癌預后判斷提供了新途徑，為臨床醫(yī)生對于結(jié)腸癌病情分析提供了參考依據(jù)。該PBRM1蛋白作為檢測標志物具有以下特征:當樣本組織的染色指數(shù)≥6時，判斷為PBRM1蛋白高表達，提示結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期長；反之，當樣本組織的染色指數(shù)<6時，判斷PBRM1蛋白為低表達，提示結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期短。應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。當前第1頁1 2 3