技術(shù)領(lǐng)域
本申請(qǐng)涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及胃病的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶原II(簡(jiǎn)稱(chēng)PG II)來(lái)源于全胃腺和遠(yuǎn)端十二指腸Brunner氏腺，胃粘膜合成的PGII約為總量的25％，PG II大部分進(jìn)入消化道，少量進(jìn)入血液循環(huán)，因此被稱(chēng)為“反映胃部狀態(tài)和功能的指針”。
國(guó)內(nèi)外臨床研究指出，PG II與胃底粘膜病變的相關(guān)性較大，其升高與胃底腺管萎縮、腸上皮化生或假幽門(mén)腺化生、異型增生有關(guān)。測(cè)定PG II含量有助檢測(cè)出十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供臨床檢測(cè)和體檢篩查需求。在人群胃病篩查中，每個(gè)人做胃鏡是不現(xiàn)實(shí)的，可通過(guò)非侵入性血清PG檢測(cè)將淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等高危人群篩查出來(lái)，再進(jìn)行胃鏡檢查是一種切實(shí)可行的方案?，F(xiàn)有技術(shù)已知采用時(shí)間分辨熒光測(cè)量技術(shù)，組建的PGII的TRFIIA試劑盒是目前PGII檢測(cè)方法中最靈敏、測(cè)量范圍最寬的方法之一，但是價(jià)格昂貴不利于大規(guī)模推廣。
系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)(SELEX技術(shù))是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)多輪篩選，獲得親和力高、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子(aptamers)。該技術(shù)己成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機(jī)染料、藥物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)(SELEX技術(shù))篩選胃蛋白酶原II的寡核苷酸適配子來(lái)替代抗體，提供一種簡(jiǎn)潔快速、高靈敏度、高特異性的胃蛋白酶原II早期檢測(cè)及分離純化方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：
本發(fā)明中用于系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)篩選的單鏈DNA隨機(jī)文庫(kù)及引物，由美國(guó)invitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為42個(gè)堿基的隨機(jī)序列：5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，庫(kù)容量為1014以上；
引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；
引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'。
人胃蛋白酶原II根據(jù)CN103387971A中公開(kāi)的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制備獲得；
GelRed核酸染料購(gòu)于Biotium公司；
硝酸纖維素濾膜購(gòu)于美國(guó)密理博(MilliPore)公司；
寡聚核苷酸的純化試劑購(gòu)于北京天為時(shí)代公司；
PCR試劑盒和T載體購(gòu)于美國(guó)普洛麥格(ftOmega)公司。
一種親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于核苷酸序列為：SEQ ID NO：1-17任一所示的DNA分子。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸適配子同源序列占60％以上。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：為能與DNA序列進(jìn)行雜交的寡核苷酸序列。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置刪除或增加部分寡核苷酸殘基所得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進(jìn)行核苷酸種類(lèi)和稀有堿基的置換后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進(jìn)行磷酸化、甲基化、氨基、巰基、同位素、生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記修飾后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子，其特征在于：用于人胃蛋白酶原II的檢測(cè)和分離純化，從而用于腦疾病的檢測(cè)。
一種上述親和人胃蛋白酶原II核酸適配子的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：1)單鏈DNA隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)的合成；2)利用系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集方法對(duì)寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行篩選；3)擴(kuò)增與人白蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸；4)進(jìn)行下一輪篩選，經(jīng)過(guò)12輪以上篩選后獲得目的寡核苷酸序列；5)克隆測(cè)序。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫(kù)如隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)和噬菌體表面展示文庫(kù)相比，從寡核苷酸文庫(kù)中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢(shì)：1)本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特異性；3)便于標(biāo)記且可以在不同部位有選擇性的標(biāo)記；4)重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對(duì)高溫和劇烈條件不敏感。因此，系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 人胃蛋白酶原II的制備
根據(jù)CN103387971 A中公開(kāi)的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制備獲得人胃蛋白酶原II，蛋白濃度為100mg/mL。
實(shí)施例2 合成隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物
隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù):5'-TACGACATGAACCGTGATAA(N42)CAGTGAAACCTGATGATCGA-3'，構(gòu)建了長(zhǎng)度為82nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，兩端為固定引物序列，中間為42個(gè)堿基的隨機(jī)序列，庫(kù)容量為I014以上；引物1:5'–TACGACATGAACCGTGATAA-3'；引物2:5'-TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'；將隨機(jī)ssDNA文庫(kù)和兩種引物均用TE緩沖液配制成100μmol/L貯存液_20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
將單鏈DNA文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μg RNA文庫(kù)經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug人胃蛋白酶原II蛋白，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無(wú)水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫(kù)用于下一輪篩選；每輪篩選過(guò)程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫(kù)，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫(kù)，篩選共進(jìn)行10輪。得到了14個(gè)適配子，其序列分別為SEQ ID NO:1-14所示。具體序列如下所示：
PGII-1：TACGACATGAACCGTGATAACTCATATATGTTCCCAACACGTCCAACTTATCCCTGACAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-2：
TACGACATGAACCGTGATAACCGCTTCACACACTACCGCTCTCTCTTAGACTATTAACAATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-3：
TACGACATGAACCGTGATAAATTCATACTTGTACAAATACTCTCGCATCTCCACTTATAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-4：
TACGACATGAACCGTGATAAATAATTCTTTGCTTACCCTAAATATTCCAAACCCATCGACCACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-5：
TACGACATGAACCGTGATAAACCTTATTATCCTACCACATCTCCTCAAACCAGCATTTAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-6：
TACGACATGAACCGTGATAACAATCCACTGCCTCATTCCTTCCTTTATTCACATATTCCAAACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-7：
TACGACATGAACCGTGATAACGCTTATCTTCTCACATAATTCCGAAACATAAAACCTCTCCACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-8：
TACGACATGAACCGTGATAAATCGCCAACACCCTCCGTCTCGCTCTCCTAATATACAATCCTCAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-9：
TACGACATGAACCGTGATAATCGAACATTAACAATACCACGCCTATATTCTTAACATAAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-10：
TACGACATGAACCGTGATAACACTTATAACAAACTCCAAGCCTCCTACAACGTACTATCACACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-11：
TACGACATGAACCGTGATAAAAATATAAAGCTCTATGTTATTCACACGCATACTTCTTATCACAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-12：
TACGACATGAACCGTGATAACGCCCTACAATTCCCAATTAGCCTATTATTTAACATCCTAATCAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-13：
TACGACATGAACCGTGATAACCATATCTTGACCTATCACTTAGCCTAAATACTTTAAACATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
PGII-14：
TACGACATGAACCGTGATAACTACCTTCATACAATCGCAATATTCACTTTTAAACACAATAACAGTGAAACCTGATGATCGA
實(shí)施例3 蛋白結(jié)合適配子的性能測(cè)定
將適配子分別取2.0μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，純化回收去磷酸化的RNA；通過(guò)T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度(1-200nM)的人胃蛋白酶原II 37℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與目的蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
實(shí)施例4 所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析
分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pg120蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，胃蛋白酶原II，與14條適配子進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過(guò)結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與人蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有被降解。
實(shí)施例5 所述適配子疾病的診斷
取9個(gè)胃潰瘍患者和4個(gè)正常人的血液，使用生理鹽水稀釋?zhuān)@得目標(biāo)樣本。
將14個(gè)偶聯(lián)有標(biāo)記的適配子分別與9個(gè)患者以及4個(gè)正常人的樣本混合40min，通過(guò)生物素分離，定量分析其中的人胃蛋白酶原II的含量，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)患者中胃蛋白酶原II的含量顯著增加，超過(guò)了規(guī)定的閾值。達(dá)到了相應(yīng)胃病病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。由此可見(jiàn)，其診斷效果較好。
以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
序列表
〈110〉盧美珍
〈120〉一種用于胃病檢測(cè)的試劑盒
〈160〉14
〈210〉1
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-1
TACGACATGAACCGTGATAACTCATATATGTTCCCAACACGTCCAACTTATCCCTGACAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉2
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-2
TACGACATGAACCGTGATAACCGCTTCACACACTACCGCTCTCTCTTAGACTATTAACAATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉3
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-3
TACGACATGAACCGTGATAAATTCATACTTGTACAAATACTCTCGCATCTCCACTTATAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉4
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-4
TACGACATGAACCGTGATAAATAATTCTTTGCTTACCCTAAATATTCCAAACCCATCGACCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉5
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-5
TACGACATGAACCGTGATAAACCTTATTATCCTACCACATCTCCTCAAACCAGCATTTAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉6
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-6
TACGACATGAACCGTGATAACAATCCACTGCCTCATTCCTTCCTTTATTCACATATTCCAAACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉7
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-7
TACGACATGAACCGTGATAACGCTTATCTTCTCACATAATTCCGAAACATAAAACCTCTCCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉8
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-8
TACGACATGAACCGTGATAAATCGCCAACACCCTCCGTCTCGCTCTCCTAATATACAATCCTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉9
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-9
TACGACATGAACCGTGATAATCGAACATTAACAATACCACGCCTATATTCTTAACATAAATACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉10
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-10
TACGACATGAACCGTGATAACACTTATAACAAACTCCAAGCCTCCTACAACGTACTATCACACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉11
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-11
TACGACATGAACCGTGATAAAAATATAAAGCTCTATGTTATTCACACGCATACTTCTTATCACAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉12
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-12
TACGACATGAACCGTGATAACGCCCTACAATTCCCAATTAGCCTATTATTTAACATCCTAATCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉13
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-13
TACGACATGAACCGTGATAACCATATCTTGACCTATCACTTAGCCTAAATACTTTAAACATTCAGTGAAACCTGATGATCGA
〈210〉14
〈211〉 82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉PG II-14
TACGACATGAACCGTGATAACTACCTTCATACAATCGCAATATTCACTTTTAAACACAATAACAGTGAAACCTGATGATCGA