亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑在制備檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒中的用途的制作方法

文檔序號(hào):11824582閱讀:490來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體地,涉及生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑在制備檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒中的用途。



背景技術(shù):

垂體腺瘤占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的10%-15%,是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一。雖然垂體腺瘤整體上是良性腫瘤,但一部分腫瘤介于良、惡性之間,腫瘤呈侵襲性生長(zhǎng)。Jefferson在1940年首次提出侵襲性垂體腺瘤的概念。1965年Martins將其定義為:“垂體腺瘤生長(zhǎng)突破包膜或侵犯臨近結(jié)構(gòu)”。一般認(rèn)為,侵襲性垂體腺瘤是介于良性腺瘤與垂體腺癌之間的病理類型,其組織學(xué)形態(tài)屬良性但生物學(xué)特性卻近似惡性腫瘤??上虻]、兩側(cè)海綿竇、鞍上及鞍旁等周圍結(jié)構(gòu)浸潤(rùn)生長(zhǎng),手術(shù)中很難達(dá)到全切除。多項(xiàng)研究指出,垂體腺瘤侵襲和浸潤(rùn)周圍組織是影響手術(shù)效果的關(guān)鍵因素,并與患者預(yù)后高度相關(guān)。

因此,有必要開發(fā)與垂體腺瘤侵襲性相關(guān)的蛋白標(biāo)志物和檢測(cè)手段,從而為更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的了解垂體腺瘤的侵襲性、指導(dǎo)臨床治療提供有效途徑。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的方案。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本公開提供了生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑在制備檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒中的用途,其中,所述生物標(biāo)志物選自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一種。

優(yōu)選地,所述生物標(biāo)志物為EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。

另一方面,本公開提供一種檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒,其中,所述試劑盒包括生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑,所述生物標(biāo)志物選自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一種。

本公開還提供了垂體腺瘤侵襲性生物標(biāo)志物組合,其中,包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少兩種。

優(yōu)選的,所述垂體腺瘤侵襲性生物標(biāo)志物組合包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。

本發(fā)明所提供的用途、試劑盒以及生物標(biāo)志物組合可以應(yīng)用于通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平檢測(cè)出患者垂體腺瘤的侵襲性,從而為了解垂體腺瘤的惡性程度和了解垂體腺瘤患者的預(yù)后及指導(dǎo)臨床診療提供了有效依據(jù)。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是,此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。

本公開首先提供了生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑在制備檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒中的用途,其中,所述生物標(biāo)志物選自EGFL7(NCBI Gene ID:51162)、Notch3(NCBI Gene ID:4854)、EGFR(NCBI Gene ID:1956)、β-catenin(NCBI Gene ID:1499)和c-Myc(NCBI Gene ID:4609)中的至少一種。

其中,EGFL7,又名VE-statin,即類表皮生長(zhǎng)因子域-7,是V.Mattot在2006年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)內(nèi)皮特異性基因。

其中,Notch3屬于由Notch基因編碼的一類跨細(xì)胞膜受體,該類受體在人類中分為4類:Notch1、2、3、4。

其中,EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族成員之一,是NOTCH通路下游信號(hào)分子。

其中,EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc、β-catenin的表達(dá)水平均與垂體腺瘤的侵襲性正相關(guān)。

其中,本公開中所述的垂體腺瘤侵襲性,是指垂體腺瘤向蝶竇、兩側(cè)海綿竇、鞍上及鞍旁等周圍結(jié)構(gòu)浸潤(rùn)生長(zhǎng)的程度。

在本公開的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述生物標(biāo)志物為EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。所述生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑為檢測(cè)EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc表達(dá)水平的試劑。

在本公開中,生物標(biāo)志物的表達(dá)水平為垂體腺瘤組織和/或患者血清中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

進(jìn)一步地,檢測(cè)生物標(biāo)志物表達(dá)水平可以是通過(guò)以下步驟進(jìn)行的:

1)獲得待測(cè)樣本;以及

2)確定樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

其中,步驟2)的方法可以選自PCR、Western印跡、North-Western印跡、免疫吸附測(cè)定、抗體微陣列、組織微陣列、免疫沉淀、原位雜交和其他免疫組織化學(xué)技術(shù)、放射免疫測(cè)定法和免疫酶測(cè)定法中的至少一種。

在本公開的一種實(shí)施方式中,所述方法為免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)方法或者為Western印跡檢測(cè)方法。

另一方面,本公開提供一種檢測(cè)垂體腺瘤侵襲性的試劑盒,其中,所述試劑盒包括生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑,所述生物標(biāo)志物選自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一種。

在本公開的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中,在所述試劑盒中包括檢測(cè)EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc的表達(dá)水平的試劑。

進(jìn)一步地,所述試劑為PCR、Western印跡、North-Western印跡、免疫吸附、抗體微陣列、組織微陣列、免疫沉淀、原位雜交和其他免疫組織化學(xué)技術(shù)、放射免疫測(cè)定和免疫酶測(cè)定試劑中的至少一種。

在使用本公開所述的試劑盒時(shí),將待測(cè)樣品中生物標(biāo)志物表達(dá)水平與作為對(duì)照樣品的確診的不具有侵襲性的樣品中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行比較,判斷待測(cè)樣品與對(duì)照樣品相比的表達(dá)量差異。

當(dāng)EGFL7表達(dá)量上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

當(dāng)Notch3表達(dá)量上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

當(dāng)EGFR表達(dá)量上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

當(dāng)c-Myc表達(dá)量上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

當(dāng)β-catenin表達(dá)量上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

本公開的一個(gè)方面還涉及垂體腺瘤侵襲性生物標(biāo)志物組合,包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少兩種。

優(yōu)選的情況下,所述垂體腺瘤侵襲性生物標(biāo)志物組合由EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc組成。當(dāng)EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc的表達(dá)均上調(diào)時(shí),指征垂體腺瘤具有侵襲性。

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是,此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

收集312例垂體腺瘤的臨床資料,按照Knosp分級(jí)分為侵襲組135例和非侵襲組177例。構(gòu)建組織芯片,通過(guò)Leica-BOND III系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)垂體腺瘤標(biāo)本中EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)水平,分析上述蛋白與垂體腺瘤侵襲等臨床病理特征的相關(guān)性。

利用徠卡自動(dòng)掃描儀進(jìn)行掃描,掃描后進(jìn)行分析,給出高低表達(dá)判讀。當(dāng)EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc、β-catenin表達(dá)顏色2分和3分的細(xì)胞占比分別達(dá)到51%-100%時(shí),確定為高表達(dá),低表達(dá)就是表達(dá)顏色1分的細(xì)胞占比1-100%或者2分和3分的細(xì)胞占比低于50%。

結(jié)果如表1所示,表1為垂體腺瘤侵襲組和非侵襲組中EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc和β-catenin的表達(dá)情況。

表1

由表1的結(jié)果可以得知,存在侵襲性的垂體腺瘤標(biāo)本中EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin、c-Myc存在表達(dá)上調(diào)。

實(shí)施例2

采用實(shí)施例1的方法對(duì)實(shí)施例1中的312例垂體腺瘤標(biāo)本(其中侵襲標(biāo)本135例,非侵襲標(biāo)177例)進(jìn)行生物標(biāo)記物的表達(dá)水平檢測(cè),區(qū)別僅在于,每例標(biāo)本進(jìn)行6次平行檢測(cè),每次檢測(cè)的生物標(biāo)志物的種類如表2所示。

表2

在第1組中,將EGFL7、Notch3、EGFR、和c-My均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲組,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本74例。

在第2組中,將EGFL7、Notch3、EGFR和β-catenin均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲標(biāo)本,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本99例。

在第3組中,將EGFL7、Notch3、c-My和β-catenin均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲標(biāo)本,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本77例。

在第4組中,將EGFL7、EGFR、c-My和β-catenin均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲標(biāo)本,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本72例。

在第5組中,將Notch3、EGFR、c-My和β-catenin均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲標(biāo)本,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本62例。

在第6組中,將EGFL7、Notch3、EGFR、c-My和β-catenin均高表達(dá)的標(biāo)本認(rèn)定為侵襲標(biāo)本,共檢測(cè)出侵襲標(biāo)本111例。

將各組檢測(cè)出的侵襲標(biāo)本數(shù)據(jù)與實(shí)際的侵襲標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,第1組的準(zhǔn)確率為55%,第2組的準(zhǔn)確率為73%,第3組的準(zhǔn)確率為57%,第4組的準(zhǔn)確率為53%,第5組的準(zhǔn)確率為46%,第6組的準(zhǔn)確率為82%。

實(shí)施例3

本實(shí)施例通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)鑒定垂體腺瘤細(xì)胞侵襲能力。

1、融化BD Matrigel為液態(tài)備用。

2、用無(wú)血清培養(yǎng)基,按1:8(Matrigel:無(wú)血清培養(yǎng)基)的體積比稀釋Matrigel。

3、在Transwell小室上室中加入80μL已稀釋的Matrigel工作液,在培養(yǎng)箱中,37℃孵育6小時(shí),聚合Matrigel凝膠。

4、待垂體腺瘤細(xì)胞(GH3,購(gòu)自ATCC)生長(zhǎng)至匯合率為85%,狀態(tài)良好時(shí),消化細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)調(diào)整密度至2×105個(gè)/ml獲得細(xì)胞懸液。

5、包括五個(gè)處理組,其中處理組1-3:在Transwell小室(24孔板,8板)上室加入以上細(xì)胞懸液約200μl,再分為3個(gè)不同處理組分別添加Notch3抑制劑DAPT至終濃度為10μmol/L、EGFR抑制劑AG1478至終濃度為50nmol/L和c-Myc抑制劑10058-F4至終濃度為1μmol/L。在第4處理組中加入過(guò)表達(dá)EGFL7的GH3細(xì)胞株懸液(細(xì)胞密度2×105個(gè)/ml)。在第5處理組中加入過(guò)表達(dá)β-catenin的GH3細(xì)胞株懸液(細(xì)胞密度2×105個(gè)/ml)。同時(shí)在各處理組下室加入600μL含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%的CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí),每個(gè)處理組重復(fù)3個(gè)樣本。

6、用棉擦去除上室底部基質(zhì)并用PBS漂洗移除未侵襲細(xì)胞。用4%PFA固定30分鐘,PBS洗5次,3分鐘/次。亞甲藍(lán)溶液染色25分鐘,自來(lái)水沖洗,PBS清洗3次,5分鐘/次;取下聚碳酸脂膜,置于載玻片上,并覆蓋蓋玻片。

7、計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:隨機(jī)選擇10個(gè)40倍倒置顯微鏡統(tǒng)計(jì)視野中的總細(xì)胞數(shù),以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目標(biāo)示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。取平均值。采用Student-t檢驗(yàn),分析各組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如表3所示。

表3

以上詳細(xì)描述了本公開的優(yōu)選實(shí)施方式,但是,本公開并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié),在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi),可以對(duì)本公開的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型,這些簡(jiǎn)單變型均屬于本公開的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是,在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征,在不矛盾的情況下,可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù),本公開對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外,本公開的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合,只要其不違背本公開的思想,其同樣應(yīng)當(dāng)視為本公開所公開的內(nèi)容。

當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1