本發(fā)明涉及預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟炎癥程度的系統(tǒng)，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在中國，乙型肝炎病毒慢性感染是嚴(yán)重威脅我國人民健康的公共衛(wèi)生問題；根據(jù)2006年全國乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國1～59歲一般人群HBsAg(乙肝表面抗原：已感染乙肝病毒的標(biāo)志)攜帶率為7.18％。據(jù)此推算，我國現(xiàn)有慢性乙型肝炎病毒感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。慢性乙型肝炎患者若未經(jīng)有效治療多會進(jìn)展為肝臟纖維化、肝硬化，發(fā)生多種危及生命的并發(fā)癥。

國際及國內(nèi)指南將谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乙肝病毒基因(HBVDNA)、乙肝抗原(HBe抗原)狀態(tài)作為衡量乙肝是否抗病毒治療的臨床指標(biāo)；其中ALT是目前臨床中最為常用判斷肝臟受損、肝臟炎癥程度的血清學(xué)指標(biāo)(金標(biāo)準(zhǔn)為肝臟穿刺)；當(dāng)乙肝患者的谷丙轉(zhuǎn)氨酶大于或等于二倍正常上限(ALT≥2倍)，是肝炎活動的標(biāo)準(zhǔn)，臨床上必須進(jìn)行抗病毒治療；而對于谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限(ALT<2倍)的乙肝患者，文獻(xiàn)報道大約30％該類患者肝臟有明顯的纖維化或者中重度炎癥，若不及時治療，可能導(dǎo)致病情的延誤。

對于ALT<2倍的乙肝患者，現(xiàn)行方法是通過肝臟穿刺來判斷肝臟的病理狀態(tài)來進(jìn)行臨床抗病毒治療決策；然而肝臟穿刺活檢是侵襲性檢查，存在判讀和取樣誤差，且有出血、膽漏等風(fēng)險，且費用較為昂貴不適用于所有患者。但是目前除有創(chuàng)肝臟穿刺之外，尚無較好的判斷肝臟病理狀態(tài)的指標(biāo)。尤其是對于ALT<2倍的人群，國際及國內(nèi)對于此區(qū)病人群的研究并不多，對其肝臟病理炎癥狀態(tài)的無創(chuàng)診斷方法幾乎沒有。

相關(guān)研究都表明，乙肝核心抗體(Anti-HBc)水平與慢乙肝患者的谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平(ALT)具有很好的相關(guān)性；本發(fā)明針對此問題，入組590例慢性乙肝患者分別做了肝臟穿刺病理分析及血清Anti-HBc檢測，得到Anti-HBc水平與慢乙肝患者實際肝臟中炎癥程度的相關(guān)性關(guān)系。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)問題，提供一種預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限(ALT<2倍)的慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟炎癥程度的系統(tǒng)，本發(fā)明系統(tǒng)根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者的血清中乙肝核心抗體含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，預(yù)測其肝臟的炎癥程度，從而判斷是否需要進(jìn)行治療；經(jīng)臨床驗證，本發(fā)明系統(tǒng)對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟炎癥程度的預(yù)測準(zhǔn)確率高。

本發(fā)明一方面提供一種預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟炎癥程度的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括：

檢測模塊，用于檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量；

Inf-index1計算模塊，用于根據(jù)所述乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量，計算Inf-index1；及，

肝臟炎癥程度預(yù)測模塊，用于根據(jù)所述Inf-index1預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者的肝臟炎癥程度；

其中，所述Inf-index1為炎癥指數(shù)。

其中，所述檢測模塊包括檢測所述乙肝核心抗體含量所需的試劑。

特別是，所述檢測模塊包括檢測所述谷草轉(zhuǎn)氨酶含量所需的試劑。

尤其是，所述檢測模塊包括檢測所述白蛋白含量所需的試劑。

特別是，所述檢測模塊包括檢測所述乙肝核心抗體含量所需的試劑盒。

尤其是，所述檢測模塊包括檢測所述谷草轉(zhuǎn)氨酶含量所需的試劑盒。

特別是，所述檢測模塊包括檢測所述白蛋白含量所需的試劑盒。

尤其是，所述檢測模塊包括檢測所述乙肝核心抗體含量所需的儀器。

特別是，所述檢測模塊包括檢測所述谷草轉(zhuǎn)氨酶含量所需的儀器。

尤其是，所述檢測模塊包括檢測所述白蛋白含量所需的儀器。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫吸附法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用酶速率法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用溴甲酚綠法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

其中，所述Inf-index1經(jīng)由以下公式計算得到：

Inf-index1＝A1×log₁₀Anti-HBc+A2×AST-A3×Albumin-A4；

其中，所述Anti-HBc為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中乙肝核心抗體含量，單位為log₁₀IU/mL。

特別是，所述AST為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，單位為IU/L。

尤其是，所述Albumin為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中白蛋白含量，單位為g/L。

其中，所述A1、A2、A3、A4為系數(shù)；A1＝1.251(±10％)；A2＝0.03(±10％)；A3＝0.061(±10％)；A4＝3.845(±10％)。

其中，根據(jù)所述Inf-index1預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者的肝臟炎癥程度包括：

根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶正常或輕度升高的慢性乙型肝炎病毒感染人群的肝臟炎癥程度統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，確定需要進(jìn)行乙肝治療的臨界值；

將所述Inf-index1與所述臨界值進(jìn)行比較處理；

當(dāng)比較結(jié)果為Inf-index1大于所述臨界值時，預(yù)測所述谷丙轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者的肝臟炎癥程度達(dá)到了需要進(jìn)行治療的程度。

特別是，所述臨界值為0.21，如果所述檢測對象的Inf-index1界值≥0.21時，預(yù)測該檢測對象為明顯肝臟炎癥患者，其肝臟炎癥程度達(dá)到了需要進(jìn)行治療的程度；如果所述檢測對象的Inf-index1界值＜0.21時，預(yù)測該檢測對象為無明顯肝臟炎癥患者。

其中，所述計算模塊的輸入連接所述預(yù)測模塊的輸出。

特別是，所述預(yù)測模塊的輸入連接所述計算模塊的輸出。

本發(fā)明另一方面提供一種獲得谷丙轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者肝臟炎癥指數(shù)的方法，其特征在于，包括：

檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶正常或輕度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者血清中乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量；

根據(jù)所述乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量，計算Inf-index1；

其中，所述Inf-index1為炎癥指數(shù)。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫吸附法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用酶速率法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用溴甲酚綠法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

其中，所述Inf-index1經(jīng)由以下公式計算得到：

Inf-index1＝A1×log₁₀Anti-HBc+A2×AST-A3×Albumin-A4；

其中，所述Anti-HBc為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中乙肝核心抗體含量，單位為log₁₀IU/mL。

特別是，所述AST為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，單位為IU/L。

尤其是，所述Albumin為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中白蛋白含量，單位為g/L。

其中，所述A1、A2、A3、A4為系數(shù)；A1＝1.251(±10％)；A2＝0.03(±10％)；A3＝0.061(±10％)；A4＝3.845(±10％)。

本發(fā)明再一方面提供一種預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型肝炎病毒感染者肝臟炎癥程度的方法，其特征在于，包括：

檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶正?；蜉p度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者血清中乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量；

根據(jù)所述乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量，計算Inf-index1；

其中，所述Inf-index1為炎癥指數(shù)。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫吸附法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的乙肝核心抗體含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用酶速率法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

特別是，本發(fā)明優(yōu)選采用溴甲酚綠法對谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量進(jìn)行檢測。

尤其是，其他現(xiàn)有的檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中的白蛋白含量的方法、試劑和/或試劑盒和/或儀器均適用于本發(fā)明。

其中，所述Inf-index1經(jīng)由以下公式計算得到：

Inf-index1＝A1×log₁₀Anti-HBc+A2×AST-A3×Albumin-A4；

其中，所述Anti-HBc為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中乙肝核心抗體含量，單位為log₁₀IU/mL。

特別是，所述AST為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，單位為IU/L。

尤其是，所述Albumin為谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者血清中白蛋白含量，單位為g/L。

其中，所述A1、A2、A3、A4為系數(shù)；A1＝1.251(±10％)；A2＝0.03(±10％)；A3＝0.061(±10％)；A4＝3.845(±10％)。

其中，根據(jù)所述Inf-index1預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶正常或輕度升高的慢性乙型肝炎病毒感染者的肝臟炎癥程度包括：

根據(jù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型肝炎病毒感染人群的肝臟炎癥程度統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，確定需要進(jìn)行乙肝治療的臨界值；

將所述Inf-index1與所述臨界值進(jìn)行比較處理；

當(dāng)比較結(jié)果為Inf-index1大于所述臨界值時，預(yù)測所述谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者的肝臟炎癥程度達(dá)到了需要進(jìn)行治療的程度。

特別是，所述臨界值為0.21，如果所述檢測對象的Inf-index1界值≥0.21時，預(yù)測該檢測對象為明顯肝臟炎癥患者，其肝臟炎癥程度達(dá)到了需要進(jìn)行治療的程度；如果所述檢測對象的Inf-index1界值＜0.21時，預(yù)測該檢測對象為無明顯肝臟炎癥患者。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益技術(shù)效果如下：

本發(fā)明以乙肝核心抗體含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量和白蛋白含量作為變量建立的用于預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型肝炎患者的肝臟炎癥程度的系統(tǒng)對包括ALT小于二倍正常上限(≤2ULN)的慢性乙型肝炎患者的肝臟炎癥程度具有較好的診斷價值。對222例谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型肝炎患者曲線下面積分析結(jié)果顯示,在ALT≤2倍正常上限患者中Inf-index1診斷明顯肝臟炎癥程度(HAI>4)的曲線下面積(area under the curve，AUC)面積為0.779(95％CI:0.717-0.841)；當(dāng)Inf-index1≥0.21為界值診斷明顯肝臟炎癥程度以上時(HAI≥5)，其敏感性為62.7％，特異性為82.0％，陰性診斷率72.5％，陽性診斷率74.4％，準(zhǔn)確率73.2％；交叉驗證顯示：Inf-index1能正確診斷出73.2％的患者。另對221例HAI≥4的受試者曲線下面積(ROC)的分析結(jié)果顯示，應(yīng)用Inf-index1炎癥評價模型及確定的cutoff值，其診斷明顯炎癥程度以上(HAI≥5)的敏感性為49.5％，特異性為86.6％，陰性診斷率66.5％，陽性診斷率76.1％，準(zhǔn)確率70.1％；與驗證隊列診斷評價指標(biāo)相當(dāng)。

附圖說明

圖1為乙肝核心抗體含量與慢乙肝患者肝臟炎癥活動度相關(guān)性分析圖；

圖2為建模隊列組(圖2a.)及驗證隊列組(圖2b.)中肝臟炎癥模型Inf-index1用于診斷ALT≤2倍正常上限的慢乙肝患者中肝臟明顯炎癥(HAI>4)受試者曲線下面積分析圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，需要說明的是，本發(fā)明的實施例僅僅是為了闡述本發(fā)明，而并非為了限制本發(fā)明的范圍。

用于預(yù)測谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟炎癥程度的系統(tǒng)的建立及其預(yù)測效果

1、研究對象

(1)病例來源：2013年10月至2015年12月，來自全國24家教學(xué)醫(yī)院的443例谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型病毒性肝炎患者；

(2)入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18-65歲；抗甲型肝炎病毒M免疫球蛋白(抗-HAV-IgM)、抗丙型肝炎病毒(抗-HCV)、抗戊型肝炎病毒M/G免疫球蛋白(抗-HEV-IgM/IgG)、抗EB病毒M球蛋白(抗-EBV-IgM)、抗巨細(xì)胞病毒M免疫球蛋白(抗-CMV-IgM)均為陰性；并除外酒精、藥物、自身免疫等其他原因所致慢性肝損傷；且：

a.慢性HBV攜帶者診斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg、HBeAg、HBV DNA定量陽性，1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次以上均顯示血清ALT在10-40IU/L的正常范圍內(nèi)，AST在10-40IU/L的正常范圍內(nèi)；

b.非活動性HBsAg攜帶者診斷標(biāo)準(zhǔn)：血清HBsAg陽性、HBeAg陰性、HBV DNA定量低于檢測下限，1年內(nèi)連續(xù)隨訪3次以上，ALT均在10-40IU/L的正常范圍內(nèi)；

c.慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBV DNA仍為陽性者，ALT持續(xù)或反復(fù)升高；

d.代償期乙肝肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個月，現(xiàn)HBsAg和(或)HBV DNA仍為陽性者；影像學(xué)、生化學(xué)、血液學(xué)或內(nèi)窺鏡檢查提示門靜脈高壓癥(如脾功能亢進(jìn)及食管胃底靜脈曲張)證據(jù)，但無食管胃底靜脈曲張破裂出血、腹水或肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥。

2、肝臟穿刺組織病理學(xué)檢查

入組病例均在彩色多普勒引導(dǎo)下按照標(biāo)準(zhǔn)的肝臟穿刺進(jìn)行肝臟穿刺活檢，采用粗針穿刺(16G)，所取肝臟組織檢查標(biāo)本長度在2.0cm以上，包含至少11個完整的匯管區(qū)。肝臟組織穿刺標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，進(jìn)行常規(guī)作HE染色，特殊染色(包括網(wǎng)狀纖維染色、Masson三色染色)，免疫組化染色(HBsAg、HBAg及CK7)。然后病理標(biāo)本經(jīng)由三位病理醫(yī)師組成的專家組采用Ishak評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法閱片。

肝臟炎癥及纖維判讀分期參照Ishak標(biāo)準(zhǔn)，即：沒有或輕度炎癥(肝臟活動指數(shù)(hepatic activity index，HAI)0-4分)，中度炎癥(HAI5-6分)，重度炎癥(HAI≥7分)；沒有或輕度纖維化(F＝0-1)，中度纖維化(F＝2)，明顯纖維化(F＝3)，重度纖維化(F≥7)。

3、實驗室檢測

(1)血液學(xué)及生化檢查均以各單位在病人肝穿4周內(nèi)的結(jié)果為準(zhǔn)。

(2)血清乙肝表面抗原(HBSAg)的含量檢測采用美國羅氏公司試劑盒(RocheHBsAg II assay)，乙型肝炎病毒DNA水平采用美國羅氏公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan進(jìn)行分析(檢測范圍：2.0×101–1.7×108IU/mL)，乙型肝炎e抗原及e抗體測定采用美國Rocheassays進(jìn)行定性分析。

(3)Anti-HBc檢測

采用雙抗原夾心法ELISA檢測試劑盒(萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)檢測Anti-HBc；檢測儀器：酶聯(lián)檢測儀(Bio-Rad Model 650Microplate Reader)。

將CHB患者的血清標(biāo)本按照下列步驟進(jìn)行anti-HBc的定量檢測。鑒于CHB患者血清anti-HBc水平通常較高，通常將血清標(biāo)本以含20％牛胎血清的PBS溶液稀釋成1：500、1：2500、1:12500和1：62500共4個稀釋度進(jìn)行定量ELISA檢測。

樣品反應(yīng)：取已包被的酶標(biāo)板，每孔加入90μL樣品稀釋液，每孔再加入10μL標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻后，置于37℃溫箱反應(yīng)30分鐘。

酶標(biāo)記物反應(yīng)：將酶標(biāo)板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.l％Tween20)洗滌5遍，每孔加入100μL酶標(biāo)記物反應(yīng)液，置于37℃溫箱反應(yīng)30分鐘。

顯色反應(yīng)：將酶標(biāo)板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.l％Tween20)洗滌5遍，每孔加入TMB顯色劑(由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供)各50μL，置于37℃溫箱反應(yīng)15分鐘。

終止反應(yīng)及讀值檢測：待反應(yīng)完后將酶標(biāo)板中每孔加入50μL終止液(由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供)，并于酶標(biāo)儀上檢測各孔的OD值。

繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：對定量標(biāo)準(zhǔn)品的測量值及其對應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

計算待測樣品的anti-HBc濃度：將待測血清標(biāo)本測量的OD值利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)本稀釋倍數(shù)獲得anti-HBc的具體濃度。

(4)AST檢測

采用AST檢測試劑盒(速率法)在全自動生化分析儀(AU-400,Olympus,日本)上測定AST。

(5)Albumin檢測

采用白蛋白測定試劑盒(溴甲酚綠法)在全自動生化分析儀(AU-400,Olympus,日本)上測定Albumin。

4、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U-tests進(jìn)行分析；分類資料采用Chi-squared test進(jìn)行分析二元logistic回歸用于確定獨立影響因素。變量對炎癥纖維化的診斷性能用ROC分析進(jìn)行評價，表示為曲線下面積(area under the curve，AUC)，敏感性，特異性，陽性診斷率，陰性診斷率和準(zhǔn)確率。

5、結(jié)果分析

(1)本次共入組655例慢性乙型患者，其中轉(zhuǎn)氨酶水平≤2倍正常上限的患者為443例(67.63％)；將443例谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢乙肝患者隨機(jī)分為建模隊列組(222例)及驗證隊列組(221例)；建模隊列中,肝臟炎癥活動度為≥5的患者為102例(45.95％)；驗證隊列中肝臟炎癥活動度為≥5的患者為102例(46.15％)；各組患者特點描述見表1：

表1.ALT≤2倍正常上限的患者背景資料

(2)443例ALT≤2倍正常上限的慢性乙型肝炎患者肝臟炎癥活動度評分(HAI,histological activity index)與乙肝核心抗體含量的關(guān)系，結(jié)果如圖1所示；結(jié)果顯示在不同轉(zhuǎn)氨酶水平下，肝臟炎癥活動度與Anti-HBc水平有較好的相關(guān)性，即明顯肝臟炎癥程度(HAI>4)患者中anti-HBc水平明顯高于無或輕度肝臟炎癥(HAI≤4)患者。

(3)單因素及多因素分析建模隊列(222例)中ALT≤2倍正常上限患者中Anti-HBc水平與不同程度的肝臟炎癥活動度(HAI0-4，HAI>4)的相關(guān)性分析，見表2。單因素分析顯示，明顯肝臟炎癥(HAI>4)程度中體質(zhì)指數(shù)、HBV DNA、anti-HBc、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷酰轉(zhuǎn)肽酶、白蛋白、凝血酶原時間、凝血酶原活動度、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值及血小板明顯高于無或輕度炎癥程度(HAI≤4)患者。

表2.單因素及多因素分析

進(jìn)一步對建模隊列中222例ALT正?；駻LT≤2倍正常上限的患者進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示Anti-HBc(OR＝4.539,P<0.001)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(OR＝1.045,P＝0.024)，白蛋白(OR＝0.911,P＝0.033)為肝臟明顯炎癥程度的獨立影響因素。

根據(jù)慢性乙型肝炎病毒感染者血清中乙肝核心抗體的含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量及白蛋白的含量為指標(biāo)構(gòu)建了肝臟炎癥模型Inf-index1；其公式為：

Inf-index1＝1.251×log₁₀Anti-HBc+0.03×AST-0.061×Albumin-3.845

(3)建模隊列中乙肝核心抗體(Anti-HBc)聯(lián)合谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及白蛋白(Albumin)用于區(qū)分HAI<4,HAI≥4的受試者曲線下面積(ROC)的分析，見圖2。受試者曲線下面積分析結(jié)果顯示,在ALT≤2倍正常上限患者中Inf-index1診斷明顯肝臟炎癥程度(HAI>4)的曲線下面積(area under the curve，AUC)面積為0.779(95％CI:0.717-0.841)；當(dāng)Inf-index1≥0.21為界值診斷明顯肝臟炎癥程度以上時(HAI≥5)，其敏感性為62.7％，特異性為82.0％，陰性診斷率72.5％，陽性診斷率74.4％，準(zhǔn)確率73.2％(圖2a)；交叉驗證顯示：Inf-index1能正確診斷出73.2％的患者，即當(dāng)以谷丙轉(zhuǎn)氨酶小于二倍正常上限的慢性乙型肝炎患者為檢測對象時，根據(jù)上述結(jié)果，得到檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：如果所述檢測對象的Inf-index1界值≥0.21時，該檢測對象為明顯肝臟炎癥患者，如果所述檢測對象的Inf-index1界值＜0.21時，該檢測對象為無明顯肝臟炎癥患者。

6、預(yù)測效果

采用上述步驟建立的系統(tǒng)對驗證隊列中乙肝核心抗體(Anti-HBc)聯(lián)合谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及白蛋白(Albumin)用于區(qū)分HAI<4,HAI≥4的受試者曲線下面積(ROC)的分析，見圖2b。由驗證隊列ROC分析可知，應(yīng)用建模隊列中Inf-index1炎癥評價模型及確定的cutoff值，其診斷明顯炎癥程度以上(HAI≥5)的敏感性為49.5％，特異性為86.6％，陰性診斷率66.5％，陽性診斷率76.1％，準(zhǔn)確率70.1％(圖2b)；與驗證隊列診斷評價指標(biāo)相當(dāng)。根據(jù)上述結(jié)果，得到檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：如果所述檢測對象的Inf-index1界值≥0.21時，該檢測對象為明顯肝臟炎癥患者，如果所述檢測對象的Inf-index1界值＜0.21時，該檢測對象為無明顯肝臟炎癥患者；上述結(jié)果表明無創(chuàng)模型Inf-index1對包括ALT小于二倍正常上限(≤2ULN)的慢性乙型肝炎患者的肝臟炎癥程度具有較好的診斷價值。