Miltenberger抗體檢測免疫熒光層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種Miltenberger血型抗體檢測免疫熒光層析試紙條，該試紙條由依次在襯板上相互搭接的樣品墊、反應膜和吸收墊組成，所述樣品墊兩端分別設置有第一加樣點和第二加樣點，所述反應膜固定有一條內(nèi)部質控帶和至少一條抗體檢測帶。通過上述方式，本實用新型能夠解決我國乃至世界上目前缺乏簡便實用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測技術和試劑的難題，輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應等疾病的診斷，保障臨床安全、有效、科學輸血。
【專利說明】Mi Itenberger抗體檢測免疫熒光層析試紙條
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及醫(yī)學檢測領域,特別是涉及一種Miltenberger抗體檢測免疫突光層析試紙條。
【背景技術】
[0002]麗S血型系統(tǒng)是繼ABO之后發(fā)現(xiàn)的第二個血型系統(tǒng)，其抗原的多態(tài)性數(shù)目僅次于Rh血型系統(tǒng)。MNS血型系統(tǒng)中有一類特殊的Miltenberger亞血型系統(tǒng),其血型抗原是以人血清免疫抗體所鑒定的一系列低頻率抗原組合的紅細胞表型。該亞系統(tǒng)中Mur、Mil等幾個抗原的發(fā)生頻率在歐洲白人中低于千分之一，而在中國人和其他亞洲人群中為39TlO%。一項針對844名廣西侗族人群的調(diào)查顯示，Mur稀有血型抗原陽性率為15.4%。而林瑪利等人在1990年針對臺灣各種族的調(diào)查顯示，高山原居民的阿美族的Mur血型陽性率則高達88.4%。
[0003]抗-Mur發(fā)生率在東南亞地區(qū)很高，特別是在我國臺灣、香港人群中抗-Mur的發(fā)生頻率甚至僅次于抗-A/抗-B。臨床報告證實抗-Mur抗體會導致同種異型免疫性疾病，如輸血不良反應、新生兒溶血病等。伴隨全球化進程，各種族和各國人口在全世界的流動加快，使得Mur抗原在世界各國的臨床意義日益重要。血液免疫學理論和臨床實際都明確提出，在亞洲各國應用的血型抗體篩查紅細胞組和血型抗體鑒定的譜細胞中應該有Mur抗原陽性紅細胞。由于缺少相關試劑，多數(shù)醫(yī)療機構使用的抗體篩查細胞中并沒有包含Miltenberger血型抗原，常規(guī)檢測無法鑒定抗體的特異性，導致對存在該抗體的患者漏檢。由于新鮮紅細胞保存時間很短(最多3個月)，Miltenberger抗原陽性紅細胞來源非常有限，Miltenberger血型篩查及其抗體的檢測受到極大地限制。目前Miltenberger血型抗體檢測中面臨的幾個主要問題是:1)由于臨床檢測譜細胞中未使用相應篩選紅細胞，不規(guī)則抗體經(jīng)常漏檢；2)含有稀有抗原的篩選紅細胞的穩(wěn)定供應得不到長期保證；3)新鮮紅細胞保存時間極短。
[0004]由于至今也無商品化供應的抗Miltenberger血型抗原的單克隆抗體,人源血型試劑(人紅細胞試劑和人血清抗體試劑)的固有缺點以及沒有合適的試驗方法，世界各國目前臨床上不能夠常規(guī)開展Miltenbergerr血型相容性試驗,只在少數(shù)的大型血液中心和血型參比試驗室對一些疑難的血型不相容疾病病人進行相關的檢驗工作。至今，臨床上不能常規(guī)開展Miltenberger血型相容性實驗的具體障礙和問題是:Miltenberger抗原試劑和抗體試劑都短缺，紅細胞血球試劑和人血清抗體試劑的固有缺點，以及目前應用的免疫血清學試驗技術方法的缺點等。我國臨床對于Miltenberger血型抗原抗體的重要性及檢測方法的相關研究也很少，目前僅限個案報道。
[0005]澳大利亞CSL公司利用Kode?技術，將合成的多肽抗原連接到紅細胞上，制備得到篩檢抗-Mur抗體及抗-MUT抗體的紅細胞。這種技術是將紅細胞與含有功能(表位)基團-連接鏈-脂肪基團(function-epitope-spacer lipid, FSL)的液體混合一段時間，攜帶有特殊抗原表位的FSL可以模擬糖脂結構結合于紅細胞表面，從而改變紅細胞的血型。但這種技術只能增加抗原，而不能封閉原有的紅細胞抗原。這一篩查紅細胞已經(jīng)被用來進行大規(guī)模的抗體篩檢。但CSL公司利用Kode?技術所制備的仍然是基于存活紅細胞的血型抗原試齊U，上述提到的幾個根本問題并沒有得到解決，存在于存活的紅細胞膜上的血型抗原，由于紅細胞容易溶血，抗原性也隨之消亡。
實用新型內(nèi)容
[0006]本實用新型主要解決的技術問題是提供一種Miltenberger抗體檢測免疫熒光層析試紙條，免疫熒光層析技術操作快速簡便，結合檢測儀器能夠實現(xiàn)半定量或定量檢測；該技術能夠解決我國乃至世界上目前缺乏簡便實用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測技術和試劑的難題，輔助臨床因MiItenberger血型抗體弓丨起的新生JL溶血病、輸血不良反應等疾病的診斷，以及進行輸血前相容性實驗檢測，保障臨床安全、有效、科學輸血。
[0007]為解決上述技術問題，本實用新型采用的一個技術方案是:提供一種Miltenberger抗體檢測免疫突光層析試紙條,包括反應膜、樣品墊、吸收墊和襯板，所述反應膜位于所述底板上，所述反應膜上固定有檢測帶和質控帶，所述樣品墊和所述吸收墊分別與所述反應膜的兩側部分重疊，并位于所述反應膜和所述底板上，所述樣品墊上包括第一加樣點和第二加樣點，所述第一加樣點設置在遠離所述樣品墊與所述反應膜重疊的一偵U，所述第二加樣點設置在接近所述樣品墊與所述反應膜重疊的一側。
[0008]在本實用新型一個較佳實施例中，所述樣品墊或所述吸收墊與所述反應膜的兩側重疊部分的長度為0.5 mm。
[0009]在本實用新型一個較佳實施例中，所述反應膜的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。
[0010]在本實用新型一個較佳實施例中，所述質控帶上固定有人IgG和人IgM，所述檢測帶為至少一條，所述檢測帶上固定有鏈霉親和素。
[0011]本實用新型的有益效果是:免疫熒光層析技術操作快速簡便，結合檢測儀器能夠實現(xiàn)半定量或定量檢測；該技術能夠解決我國乃至世界上目前缺乏簡便實用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測技術和試劑的難題,輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應等疾病的診斷，以及進行輸血前相容性實驗檢測，保障臨床安全、有效、科學輸血。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]為了更清楚地說明本實用新型實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實用新型的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
[0013]圖1是本實用新型Miltenberger抗體檢測免疫突光層析試紙條一較佳實施例的結構示意圖；
[0014]附圖中各部件的標記如下:1、第一加樣點，2、樣品墊，3、第二加樣點，4、檢測帶，5、反應膜，6、質控帶,7、吸收墊,8、襯板?！揪唧w實施方式】
[0015]下面將對本實用新型實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本實用新型的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒緦嵱眯滦椭械膶嵤├绢I域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本實用新型保護的范圍。
[0016]實施例一:
[0017]請參閱圖1，一種Miltenberger抗體檢測免疫突光層析試紙條,包括反應膜5、樣品墊2、吸收墊7和襯板8，所述反應膜5位于所述襯板8上，所述反應膜5上固定有檢測帶4和質控帶6，所述樣品墊2和所述吸收墊7分別與所述反應膜5的兩側部分重疊，并位于所述反應膜5和所述襯板8上，所述樣品墊2上包括第一加樣點I和第二加樣點3，所述第一加樣點I設置在遠離所述樣品墊2與所述反應膜5重疊的一側，所述第二加樣點3設置在接近所述樣品墊2與所述反應膜5重疊的一側。
[0018]優(yōu)選的，所述反應膜5的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。所述質控帶6上固定有人IgG和人IgM。所述檢測帶4為至少一條，所述檢測帶4上固定有鏈霉親和素。
[0019]實施例二:
[0020]提供一種實施例一所述試紙條用于Miltenberger血型抗體篩檢的檢測方法:
[0021](I)試紙條的制備:
[0022]I)選取Millipore HF 180帶背襯膜作為反應膜，將其裁成30X 1.8 cm大小備用，將人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)其濃度為0.5 mg/mL，加入體積分數(shù)為1%的Tween-20，使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為質控帶，劃膜量為0.5 μ L/cm。將鏈霉親和素應用0.15 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)至濃度為0.1 mg/mL,使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為檢測帶，每條線間隔為5 _，劃膜結束后立即放入37°C烘箱中干燥過夜，室溫保存?zhèn)溆茫?br> [0023]2)試紙條的組裝
[0024]選取國產(chǎn)優(yōu)質玻璃纖維膜BT100作為樣品墊的材料，將其剪成30X1.8 cm大小備用，選取國產(chǎn)優(yōu)質吸水紙CH37K作為吸收墊的材料，并將其剪裁成30 X 1.8 cm大小備用，在規(guī)格為30 X 6 cm的PVC襯板上首先黏貼反應膜，然后將樣品墊與吸收墊采取搭接的方法黏貼于襯板上，搭接的長度為0.5 mm，以便于反應液的擴散，組裝好后，將其切成4 mm寬的試紙條，并封裝于塑料外殼中，放于鋁箔袋中，4°C密封保存。
[0025]3)熒光反應液的制備
[0026]將抗人IgG或抗人IgM抗體溶液磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至濃度為2 mg/mL, pH為7.5至8.0，取I mL抗體溶液，緩慢加入100 μ L濃度為I mg/mL的Cy5熒光染料，在4°C緩慢攪拌3 h后在室溫反應I h，再用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進行透析，去除未反應的Cy5染料。透析液完成后回收偶聯(lián)好的熒光抗體，測定偶聯(lián)效率與抗體濃度后，在4°C下避光保存。
[0027](2)檢測樣本的制備
[0028]I)待檢病人血清
[0029]抽取待檢患者靜脈血分離血清；[0030]2)待檢血清與多肽抗原孵育
[0031]將對應Miltenberger 亞血型系統(tǒng)中 Mia (MNS7)、Mur (MNS10)、Hil (MNS20)以及MUT (麗S35)血型抗原氨基酸序列的多肽以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50μ L多肽抗原與50 μ L待檢血清混勻后,室溫孵育I h備用。
[0032](3)檢測步驟
[0033]I)將試紙條和反應液平衡至室溫(18-250C )；
[0034]2)加入10 μ L待檢血清與多肽抗原的混合液至樣品墊中；
[0035]3)加入10 μ L含有體積分數(shù)為0.5%的Tween-20的pH為7.2的0.15M PBS至
樣品塾中；
[0036]4)重復步驟3)3次；
[0037]5)加入5 μ L Cy5-抗人IgG和/或抗人IgM至樣品墊中；
[0038]6)重復步驟3)3次；
[0039]7)將試紙條置于熒光信號讀取儀器中，讀取熒光信號進行測定。
[0040]實施例三:
[0041]提供一種實施例一所述試紙條用于Miltenberger血型抗體特異性鑒定的檢測方法:
[0042](I)試紙條的制備:
[0043]I)選取Millipore HF 180帶背襯膜作為反應膜，將其裁成30X 1.8 cm大小備用，將人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)其濃度為0.5 mg/mL,加入體積分數(shù)為1%的Tween-20，使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為質控帶6，劃膜量為0.5 μ L/cm。將鏈霉親和素應用0.15 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)至濃度為0.1 mg/mL,使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為檢測帶，每條線間隔為5 _，劃膜結束后立即放入37°C烘箱中干燥過夜，室溫保存?zhèn)溆茫?br> [0044]2)試紙條的組裝
[0045]選取國產(chǎn)優(yōu)質玻璃纖維膜BT100作為樣品墊的材料，將其剪成30X1.8 cm大小備用，選取國產(chǎn)優(yōu)質吸水紙CH37K作為吸收墊的材料，并將其剪裁成30 X 1.8 cm大小備用，在規(guī)格為30 X 6 cm的PVC襯板上首先黏貼反應膜，然后將樣品墊與吸收墊采取搭接的方法黏貼于襯板上，搭接的長度為0.5 mm，以便于反應液的擴散，組裝好后，將其切成4 mm寬的試紙條，并封裝于塑料外殼中，放于鋁箔袋中，4°C密封保存。
[0046]3)熒光反應液的制備
[0047]將抗人IgG或抗人IgM抗體溶液磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至濃度為2 mg/mL, pH為7.5至8.0，取I mL抗體溶液，緩慢加入100 μ L濃度為I mg/mL的Cy5熒光染料，在4°C緩慢攪拌3 h后在室溫反應I h，再用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進行透析，去除未反應的Cy5染料。透析液完成后回收偶聯(lián)好的熒光抗體，測定偶聯(lián)效率與抗體濃度后，在4°C下避光保存。
[0048](2)檢測樣本的制備
[0049]I)待檢病人血清
[0050]抽取待檢患者靜脈血分離血清；
[0051]2)待檢血清與多肽抗原孵育[0052]將對應Miltenberger 亞血型系統(tǒng)中 Mia (MNS7)、Mur (MNS10)、Hil (MNS20)以及MUT (麗S35)血型抗原氨基酸序列的多肽分別以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50 μ L多肽抗原與50 μ L待檢血清混勻后，室溫孵育I h備用。
[0053](3)檢測步驟
[0054]I)將試紙條和反應液平衡至室溫(18-250C )；
[0055]2)加入10 μ L待檢血清與多肽抗原的混合液至樣品墊中；
[0056]3)加入10 μ L含有體積分數(shù)為0.5%的Tween-20的pH為7.2的0.15M PBS至
樣品塾中；
[0057]4)重復步驟3)3次；
[0058]5)加入5 μ L Cy5_抗人IgG和/或抗人IgM至樣品墊中；
[0059]6)重復步驟3)3次；
[0060]7)將試紙條置于熒光信號讀取儀器中，讀取熒光信號進行測定。
[0061]本實用新型Miltenberger血型抗體檢測免疫突光層析試紙條的有益效果是:免疫熒光層析技術操作快速簡便，結合檢測儀器能夠實現(xiàn)半定量或定量檢測；該技術能夠解決我國乃至世界上目前缺乏簡便實用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測技術和試劑的難題，輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應等疾病的診斷，以及進行輸血前相容性實驗檢測，保障臨床安全、有效、科學輸血。
[0062]以上所述僅為本實用新型的實施例，并非因此限制本實用新型的專利范圍，凡是利用本實用新型說明書內(nèi)容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關的【技術領域】，均同理包括在本實用新型的專利保護范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.一種Miltenberger抗體檢測免疫突光層析試紙條,其特征在于,包括反應膜、樣品墊、吸收墊和襯板，所述反應膜位于所述底板上，所述反應膜上固定有檢測帶和質控帶，所述樣品墊和所述吸收墊分別與所述反應膜的兩側部分重疊，并位于所述反應膜和所述底板上，所述樣品墊上包括第一加樣點和第二加樣點，所述第一加樣點設置在遠離所述樣品墊與所述反應膜重疊的一側，所述第二加樣點設置在接近所述樣品墊與所述反應膜重疊的一側。
2.根據(jù)權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述樣品墊或所述吸收墊與所述反應膜的兩側重疊部分的長度為0.5 mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述反應膜的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。
4.根據(jù)權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述質控帶上固定有人IgG和人IgM，所述檢測帶為至少一條，所述檢測帶上固定有鏈霉親和素。
【文檔編號】G01N33/80GK203490226SQ201320431392
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權日:2013年7月19日
【發(fā)明者】丁少華, 李勇, 尹煥才, 段生寶, 王紅梅, 田晶晶, 陳曄洲, 李冬 申請人:中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所