本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗體二硫鍵配對分析方法。

背景技術(shù)：

二硫鍵即S-S鍵，是2個巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價鍵，是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個半胱氨酸，在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、保持正確的空間構(gòu)象、調(diào)節(jié)生物學(xué)活性方面起著非常重要的作用。二硫鍵正確配對利于肽鏈迅速折疊并形成緊密的、穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成局部疏水中心，能阻止水分子進入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，形成穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)區(qū)域。

二硫鍵只具有相對的穩(wěn)定性，其共價鍵容易被還原而斷裂，當(dāng)二硫鍵被斷開還原為巰基基團時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象必然發(fā)生改變，可能完全或部分喪失原有的生物學(xué)功能，巰基含量較高的抗體具有較低的生物活性和較低的熱穩(wěn)定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibody stability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正確的二硫鍵配對方對單克隆抗體藥物生物學(xué)活性至關(guān)重要，錯配或不能完全形成二硫鍵往往意味活性的降低(Ouellette D,Alessandri L,Chin A,Grinnell C,Tarcsa E,Radziejewski C,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1molecule.Analytical Biochemistry 2010；397:37-47)。在細(xì)胞株克隆篩選、純化工藝確認(rèn)、制劑配方篩選、產(chǎn)品穩(wěn)定性確認(rèn)等研發(fā)周期過程中，監(jiān)控二硫鍵配對可以判斷單克隆抗體工藝開發(fā)。現(xiàn)有的技術(shù)方法多是采用幾種特異性酶進行聯(lián)合酶解來確認(rèn)單克隆抗體的二硫鍵配對形式。

Golimumab(戈利木單抗，參見WO 02/12502)是由Centocor公司開發(fā)的一 種全人抗TNF-a的IgG1κ單克隆抗體，目前已被美國、日本等多國批準(zhǔn)用于治療中至重度活動型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、中度至重度潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎及強直性脊柱炎等多種疾病。目前Golimumab的二硫鍵配對分析，多是采用幾種特異性酶進行聯(lián)合酶解方法來進行分析確認(rèn)，非常不方便。

因此，一種簡單、有效的蛋白質(zhì)(如Golimumab單克隆抗體)二硫鍵配對分析方法仍是目前所需的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)(如Golimumab單克隆抗體)二硫鍵配對分析方法，該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中需要使用多種特異性酶切方式進行分析帶來的不便，其僅需使用一兩種酶切方式即能準(zhǔn)確確認(rèn)及定位二硫鍵肽段。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案：

一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對分析方法，包括如下步驟：1、對蛋白質(zhì)進行變性處理；2、在非還原條件下使用特異性酶酶解蛋白質(zhì)；3、將酶解后的蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對其中一份樣品進行還原，對另一份樣品不進行還原，兩份樣品均終止酶解；4、對終止酶解后的樣品進行質(zhì)量肽譜圖分析。

較佳的，所述蛋白質(zhì)為單克隆抗體；進一步的，所述單克隆抗體為戈利木單抗(Golimumab)。

較佳的，步驟1中使用鹽酸胍(GuHCl)對所述蛋白質(zhì)進行變性處理；優(yōu)選變性樣品體系中鹽酸胍濃度為5M～7.6M。

較佳的，步驟2中所述特異性酶為胰蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶(Lys-C)；優(yōu)選胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)；優(yōu)選Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。

在一具體實例中，所述胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)，Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。

較佳的，步驟3中使用DTT對所述其中一份樣品進行還原；優(yōu)選樣品體系中DTT濃度為60mM。

較佳的，步驟3中加入甲酸FA終止酶解；優(yōu)選FA終體積濃度為0.1％。

在另一具體實例中，對步驟3中所述其中一份樣品加入0.1M DTT，于37℃水浴孵育30min；兩份樣品均分別加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反 應(yīng)。

較佳的，步驟5中，所述蛋白質(zhì)的二硫鍵配對確認(rèn)是通過ESI-Q-TOF MS方法進行分析，所得數(shù)據(jù)采用BiopharmaLynx軟件進行處理分析。

在另一具體實例中，ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法實現(xiàn)：將蛋白質(zhì)用50mM NH₄HCO₃(pH8.0)溶液稀釋至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白濃度計)；然后Waters Acquity UPLC BEH300C181.7μm 2.1×150mm色譜柱分離；進行Q-TOF質(zhì)譜分析。

本發(fā)明單克隆抗體戈利木單抗輕鏈含有5個半胱氨酸Cys，分別為Cys23、Cys88、Cys135、Cys 195、Cys215，重鏈含11個半胱氨酸Cys，分別為Cys22、Cys96、Cys153、Cys 209、Cys229、Cys235、Cys238、Cys270、Cys330、Cys376、Cys434，從輕鏈N-末端開始到C-末端分別標(biāo)示為1C～5C，從重鏈N-末端開始到C-末端分別標(biāo)示為6C～16C，理論配對鏈內(nèi)二硫鍵為1C/2C、3C/4C、6C/7C、8C/9C、13C/14C、15C/16C，鏈間二硫鍵為5C/10C，鉸鏈區(qū)二硫鍵為11C+12C/11C+12C。

實驗結(jié)果表明，單一酶胰蛋白酶酶切時不能確認(rèn)5C/10C和11C+12C/11C+12C，單一酶Lys-C酶切時不能確認(rèn)1C/2C和6C/7C，而將兩種酶聯(lián)合起來可以確認(rèn)各自不能確認(rèn)的二硫鍵肽段，避免Lys-C酶切時造成的肽段較長碎片離子不豐富的缺點，也避免了胰蛋白酶酶切時專一性不夠易產(chǎn)生部分漏切導(dǎo)致肽段豐度較低的缺點。另外實驗結(jié)果表明，單克隆抗體戈利木單抗(Golimumab)鉸鏈區(qū)二硫鍵11C+12C/11C+12C由于氨基酸序列的特異性無法確認(rèn)具體配對方式。

總之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明通過胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切方式即可確認(rèn)戈利木單抗(Golimumab)全部二硫鍵配對，酶切方式相對較少，并且二硫鍵肽段碎片離子較為豐富。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(1C/2C)碎片離子圖；

圖2為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(3C/4C)碎片離子圖；

圖3為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(5C/10C)碎片離子圖；

圖4為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖；

圖5為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(8C/9C)碎片離子圖；

圖6為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(11C+12C/11C+12C)碎片離 子圖；

圖7為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(13C/14C)碎片離子圖；

圖8為本發(fā)明實施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(15C/16C)碎片離子圖；

圖9為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(1C)碎片離子圖；

圖10為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(2C)碎片離子圖；

圖11為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(3C)碎片離子圖；

圖12為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(4C)碎片離子圖；

圖13為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(5C)碎片離子圖；

圖14為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(6C)碎片離子圖；

圖15為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(7C)碎片離子圖；

圖16為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(8C)碎片離子圖；

圖17為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(9C)碎片離子圖；

圖18為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(11C+12C)碎片離子圖；

圖19為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(13C)碎片離子圖；

圖20為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(15C)碎片離子圖；

圖21為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(16C)碎片離子圖。

上述附圖中肽段中氨基酸之間的每一條虛線表示檢測到的該肽段的一個碎片離子(b離子或y離子)，y離子是從肽段羧基端開始，b離子是從肽段氨基端開始。一般碎片離子越多越豐富，即表明該肽段是理論肽段，碎片離子較少，則不一定是理論肽段，可能是具有相同分子量的其他肽段，碎片離子的多少與肽段的長度及碎裂模式有關(guān)，太短或太長的肽段在誘導(dǎo)碰撞電離碎裂模式下一般碎片離子都較少。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步闡述，不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均是按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進行實驗。

以下實施例中使用的單克隆抗體是戈利木單抗(上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司提供)。

實施例1：抗體二硫鍵配對分析(胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1﹕200加入Lys-C，聯(lián)合酶解單克隆抗體，37℃孵育4小時。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選如下：

表1：ESI-Q-TOF MS分析質(zhì)譜參數(shù)和液相條件

流動相A：0.1％FA-H2O，流動相B：0.1％FA-ACN，質(zhì)譜清洗液：50％CAN，質(zhì)譜IntelliStart閥清洗液：50％MeOH，柱溫：45℃，檢測波長：214nm，進樣體積：5μL或10μL，樣品室溫度：10℃，液相梯度洗脫條件：流動相B在80分鐘內(nèi)從1％到36％。

實驗結(jié)果見下表2-3，其中：表2是非還原條件單克隆抗體二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表，表3是單克隆抗體自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表：

表2：非還原條件單克隆抗體二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表

表3：單克隆抗體自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表

經(jīng)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析，二硫鍵肽段(1C/2C)碎片離子圖見附圖1，二硫鍵肽段(3C/4C)碎片離子圖見附圖2，二硫鍵肽段(5C/8C)碎片離子圖見附圖3，二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖見附圖4，二硫鍵肽段(9C/10C)碎片離子圖見附圖5，二硫鍵肽段(11C+12C/11C+12C)碎片離子圖見附圖6，二硫鍵肽段(13C/14C)碎片離子圖見附圖7，二硫鍵肽段(15C/16C)碎片離子圖見附圖8，自由巰基肽段(1C)碎片離子圖見附圖9，自由巰基肽段(2C)碎片離子圖見附圖10，自由巰基肽段(3C)碎片離子圖見附圖11，自由巰基肽段(4C)碎片離子圖見附圖12，自由巰基肽段(5C)碎片離子圖見附圖13，自由巰基肽段(6C)碎片離子圖見附圖14，自由巰基肽段(7C)碎片離子圖見附圖15，自由巰基肽段(8C)碎片離子圖見附圖16，自由巰基肽段(9C)碎片離子圖見附圖17，自由巰基肽段(11C+12C)碎片離子圖見附圖18，自由巰基肽段(13C)碎片離子圖見附圖19，自由巰基肽段(15C)碎片離子圖見附圖20，自由巰基肽段(16C)碎片離子圖見附圖21。

實施例2：單克隆抗體二硫鍵配對分析(胰蛋白酶酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶酶解單克隆抗體，37℃ 孵育4小時。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選與實施例1中相同。

實驗結(jié)果：能確認(rèn)除5C/10C和11C+12C/11C+12C以外的二硫鍵配對。

實施例3：單克隆抗體二硫鍵配對分析(Lys-C酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(1)中蛋白100μg，以1:200(wt/wt)加入Lys-C酶解單克隆抗體，37℃孵育4小時。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選與實施例1中相同。

實驗結(jié)果：能確認(rèn)除1C/2C和6C/7C以外的二硫鍵肽段。

綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切方式在非還原條件下，能直接確認(rèn)戈利木單抗(Golimumab)所有二硫鍵配對方式，可以排除單克隆抗體特殊氨基酸序列對酶解蛋白時的空間位阻作用，全部二硫鍵配對只通過較少的酶切方式即能確認(rèn)，方法簡單方便、有效可靠。