專利名稱：產(chǎn)生具有正確的折疊和二硫鍵鍵合的igf－i和igfbp－3的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及產(chǎn)生有活性的，適當折疊的蛋白質(zhì)的領(lǐng)域，更具體地說涉及類胰島素生長因子-I(IGF-I)和類胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3多肽的再折疊。
背景技術(shù)：
生長因子是多肽，該多肽在靶細胞的限定種群中刺激產(chǎn)生廣泛多樣的生物反應(如DNA合成，細胞分裂，特定基因的表達，等等)。多種生長因子已經(jīng)被人們鑒別，其中包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子-I(IGF-I)和IGF-II。
IGF-I和IGF-II在氨基酸順序和結(jié)構(gòu)上有聯(lián)系，每個多肽具有大約7.5千道爾頓(Kd)的分子量。IGF-I調(diào)節(jié)生長激素的主要作用，因此是出生之后生長的初級調(diào)節(jié)物。在其它各種生長因子的作用中也已經(jīng)牽涉了IGF-I，因為用這些生長因子對細胞的處理導致IGF-I產(chǎn)量的增加。相反，人們相信FGF-II在胎生長中是一種主要角色。兩者IGF-I和IGF-II都具有類胰島素活性(并因此得名)，對于在神經(jīng)組織、肌肉、繁殖組織、骨胳組織和其它廣泛的多種組織中的細胞來說，還是促細胞分裂的(刺激細胞分裂)。
與大多數(shù)生長因子不同，IGF在循環(huán)中大量存在，但這種IGF只有很小的一部分在循環(huán)中或其他體液中是游離的。多數(shù)循環(huán)的IGF與IGF結(jié)合蛋白-3結(jié)合。人們可以通過在血清中對IGF-I測量來診斷不正常的與生長有關(guān)的病癥，例如，腦垂體肥大癥、頂端肥大癥、侏儒癥和各種生長激素缺乏癥。雖然許多組織都產(chǎn)生IGF-I，但人們相信大多數(shù)循環(huán)的IGF-I是在肝臟中合成的。
幾乎所有的IGF都循環(huán)在非共價鍵聯(lián)系的由IGF-I或者IGF-II，IGFBP-3組成的三重復合物中，并且其中一個較大的蛋白質(zhì)亞單位被稱為酸不穩(wěn)定亞單位(ALS)。這個三重復合物是由三種等摩爾量的組分組成的。ALS沒有直接的IGF-結(jié)合活性并且表現(xiàn)為只與IGF-I或IGFBP-3雙重復合物結(jié)合。IGF-I+IGFBP-3+ALS的三重復合物具有的分子量約為150Kd。這個三重復合物被認為是在循環(huán)中起的功能是“作為IGF-I和IGF-II的儲藏器和緩沖帶，從而避免游離IGF的濃度的快速變化”(Blum等(1991)“血漿IGFBP-3水平作為臨床指示物”，類胰島素生長因子的現(xiàn)代概念，381-393頁，(E.M.Spencer，ed.，Elsevier，紐約)。
多數(shù)循環(huán)的IGF-I，IGF-II，和IGFBP-3以復合物的形式存在，因此，人們可以探測到的游離IGF是很少的。而且，血液中高水平的游離IGF是不合乎需要的。高的血液IGF水平會由于IGF的類胰島素活性導致嚴重的低血糖。與IGF和IGFBP-3相比，在血漿中有一個充足的游離ALS庫，從而保證了進入循環(huán)的IGF或IGFBP-3復合物立即形成三元復合物。
當IGFBP-3是循環(huán)中最豐富的IGF結(jié)合蛋白時，人們已經(jīng)在各種組織和體液中鑒定了至少五個其它性質(zhì)截然不同的IGF結(jié)合蛋白(IGFBPs)。雖然這些蛋白質(zhì)結(jié)合IGF，它們每一個都起源于不同的基因，并具有截然不同的氨基酸序列。因此，結(jié)合蛋白不只是一個共有前體的類似物或者衍生物。不同于IGFBP-3，除IGFBP-3以外的其它的循環(huán)IGFBP不以IGFs飽和。除IGFBP-3以外，沒有IGFBP能形式150Kd的三元復合物。
IGF-I和IGFBP-3可以通過從天然來源純化或重組方法產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的如，從人類血清中的IGF-I的純化(Rinderknecht等，(1976)美國科學院學報，732365-2369)。在EP 0,128,733中展示了產(chǎn)生IGF-I的重組過程(在1984年十二月出版)。IGFBP-3可以從天然來源純化，通過用一種方法諸如Baxter等中顯示的((1986)“人類血漿中的生長激素-依賴性類胰島素生長因子(IGF)結(jié)合蛋白不同于其它人類IGF結(jié)合蛋白，”生物化學及生物物理研究通訊。1391256-1261)。IGFBP-3可以通過如在Sommer等中(同上，715-728頁)討論的由重組有機體合成。重組體IGFBP-3以1比1的摩爾比率結(jié)合IGF-I。
對大鼠和豬的創(chuàng)傷局部施用IGF-I/IGFBP-3復合物顯著的比單獨施用IGF-I更有效(Sommer等，同上)。對切除垂體的、切除卵巢的，和正常的大鼠皮下施用IGF-I/IGFBP-3復合物，以及對獼猴(cynomologous monkeys)的靜脈施用，從根本上阻止了單獨施用IGF-I時的低血糖作用。
當單個測量時，IGF-I和IGFBP-3都具有二硫化物異構(gòu)酶活性。然而，兩種蛋白質(zhì)的混合物本質(zhì)上抑制了這一活性(Koedam和Leo vanden Brande(1994)“類胰島素生長因子(IGFs)和IGF結(jié)合蛋白-3均表現(xiàn)二硫化物異構(gòu)酶活性”生物化學及生物物理研究通訊，1981225-1231)。
通過運用重組表達系統(tǒng)，特別是在原核生物(如大腸桿菌)中表達，基因工程已經(jīng)使產(chǎn)生大量的由克隆的DNA編碼的多肽成為可能。表達的異源肽(其根本不被宿主細胞產(chǎn)生或只以有限的量產(chǎn)生)可以構(gòu)成宿主的整個細胞多肽的顯著比例。
當克隆的DNA在重組表達系統(tǒng)中以高水平表達時，有幾個問題人們會經(jīng)常碰到。在宿主細胞的細胞質(zhì)中超量表達的多肽經(jīng)常聚集成不能溶解的“包含體”或“折射體”，特別是當細菌作為宿主細胞時(Williams等(1982)科學215687-689；Schoner等(1985)生物技術(shù)3151-154。當然，內(nèi)含體的形成不限于細菌表達系統(tǒng)。例如，當在昆蟲細胞中利用桿狀病毒表達系統(tǒng)產(chǎn)生時，果蠅屬的Kruppel基因產(chǎn)物能形成包含體。多肽聚集形成“包含體”或“折射體”對生物和生化測定相對來說是沒有用的。把這種不能溶解的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為有活性的，可溶性的多肽需要緩慢的和困難的溶解和再折疊方案，這些增加多肽的生產(chǎn)成本并且經(jīng)常大大地減少具有生物活性的多肽的凈產(chǎn)量。
甚至當異源多肽在宿主細胞的細胞質(zhì)中以可溶性形式表達時，因為不正確的折疊，它們還可能沒有生物活性。不正確的折疊發(fā)生在宿主細胞的細胞質(zhì)之中或在分離過程中。
從重組表達系統(tǒng)獲得有生物活性的重組蛋白質(zhì)內(nèi)在的困難是增加包含半胱氨酸殘基的多肽(如IGF-I)。IGF-I包含六種半胱氨酸殘基，所有這些形成被人們認為是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性構(gòu)造的分子內(nèi)二硫鍵。IGF-I中的半胱氨酸殘基能形成不正確的二硫鍵，即，在天然IGF-I中尚未發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸殘基之間所形成的二硫鍵。包含不正確的二硫鍵的IGF-I分子已經(jīng)減少了生物活性(Raschdorf等(1988)Biomed.Env.Mass Spectros.163-8)。
人們發(fā)現(xiàn)如果發(fā)酵溫度降低于30℃，可溶性的多肽的量就可以在大腸桿菌重組體表達中增加。這種方法作為使多肽從包含體的復性的一種選擇是有用的，但是需要能在30℃下有效地運行的表達系統(tǒng)。當然，這種方法可能不會是在商業(yè)上切實可行的，因為發(fā)酵溫度的降低增加了所用時間，因此發(fā)酵的成本伴隨著培養(yǎng)受到污染的風險也增加。
在本領(lǐng)域已知的再折疊蛋白質(zhì)的方法。例如，美國專利4,511,502、4,511,503和4,512,922描述的被認為是對從包含體回收的蛋白質(zhì)的再折疊通用的方法(僅需稍加修改)。這些方法通常尋求打破不正確折疊的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，然后允許弱的分子內(nèi)力，即，氫鍵，疏水相互作用，和離子鍵，使蛋白質(zhì)折疊到適當?shù)男问剑浜笸ㄟ^氧化形成正確的二硫鍵。
在一種這樣的方法中，被折疊的蛋白質(zhì)是一定條件下純化的，該條件是在整個純化過程中加入還原劑使蛋白質(zhì)的半胱氨酸部分作為游離的硫氫基團。這允許在沒有不正確的分子內(nèi)二硫鍵下，在純化過程中對蛋白質(zhì)折疊。將還原劑稀釋以使折疊的蛋白質(zhì)在空氣或其它一些氧化劑存在時形成二硫鍵。這種方法能被容易的結(jié)合到大多數(shù)純化過程中，對具有相對不復雜的三級結(jié)構(gòu)的重組蛋白質(zhì)有理想的作用。
另一種方法是在硫氫化合物的還原形式(R-SH)和氧化形式(R-S-S-R)存在下折疊蛋白質(zhì)。這允許二硫鍵通過純化方法形成，破裂，和重新形成。被提供到緩沖液中的硫氫化合物的還原的和氧化形式具有足夠的變性能力使所有的蛋白質(zhì)的中間形態(tài)在再折疊方期間保持可溶性。人們建議尿素作為一種適合的變性劑，這是由于其中間變性能力允許蛋白質(zhì)得到其正確的構(gòu)造，同時也保持折疊的中間產(chǎn)物的溶解性。當時蛋白質(zhì)折疊成具有一種不太復雜的折疊模式時，這方法最有效。
可用于更困難的再折疊情況的一種替代的方法是破壞任何可以在蛋白質(zhì)的合成或分離期間形成的二硫鍵，從而衍生出蛋白質(zhì)的游離硫氫基。游離的硫氫基是磺酸鹽衍生的，從而阻止二硫鍵的形成。將蛋白質(zhì)在弱變性劑中折疊，然后脫磺化，從而允許正確的二硫鍵形成。脫磺化作用在硫氫化合物的存在下發(fā)生。少量的化合物相應氧化的形式將保證適合的二硫鍵仍然完整。pH值改變，即，增加到這樣的值以使硫氫化合物至少部分電離，提高磺酸鹽的親核置換。
這些折疊方法，盡管由于通用性而實際，對IGF-I還沒有顯示出特別的有效性，同時執(zhí)行起來可能是有困難的或累贅的。
針對IGF-I的再折疊方法已經(jīng)公開。PCT出版物WO 91/02807、WO 93/11240和WO 93/19084分別公開了用于再折疊重組表達的IGF-I蛋白質(zhì)的方法。
WO 91/02807公開了IGF-I融合蛋白，其中帶正電的氨基酸序列融合到IGF-I的氨基末端。氨基末端添加有助于再折疊，達到了幾乎50％正確地折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。這種方法需要氨基末端融合肽的分隔和純化的額外的步驟，以生產(chǎn)天然的IGF-I。
WO 93/11240公開了一種用于在包含有離液劑、有機溶劑，和在堿性pH值下的還原劑的單一溶液中折疊IGF-I蛋白質(zhì)的方法，這樣得到多至85％的正確折疊的蛋白質(zhì)。
WO 93/19084公開了一種用三個步驟的折疊方案來再折疊重組產(chǎn)生的IGF-I的方法。把不適當折疊的met-IGF-I，即，具有氨基端甲硫氨酸的IGF(必須把這一甲硫氨酸殘基除去以形成成熟的IGF-I)，溶解到變性溶液中。然后將氧化劑加入以形式“氧化還原”溶液。將另外的還原劑加入以增加二硫化物的交換，同時對溶液進行隔夜培養(yǎng)。這種方法結(jié)果生產(chǎn)出大約30％的正確折疊的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)必須經(jīng)進一步加工以除去氨基端甲硫氨酸殘基。
最近，Hober等(1994)在“類胰島素生長因子的折疊受類胰島素結(jié)合蛋白控制”(生物化學336758-6761)中描述用天然IGFBP-3來再折疊IGF-I的方法。加入天然的IGFBP-3以在氧化還原條件下減少IGF多肽，從而使天然IGF-I的產(chǎn)量達到89％。IGFBP-3的用途沒有公開，未折疊的IGFBP的用途沒有公開。
就本領(lǐng)域所知的再折疊方法產(chǎn)生的正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著少于100％。這些方法產(chǎn)生的異源混合物必須進一步純化，而純化過程費時和(或)費工。
人們在本領(lǐng)域中需要一種簡單、迅速、高效的方法用于再折疊IGF和IGFBP-3，使它們由正確的二硫鍵形成正確的構(gòu)造。
因此，本發(fā)明的一個目標是提供一種通過共折疊(cofolding)兩個多肽進行的，迅速高效的再折疊IGF-I和IGFBP-3的方法，從而達到正確折疊的蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種簡單、高效的，用于產(chǎn)生純化的天然1GF和IGFBP-3的復合物的方法。
在本文中，整個公開中所引用的專利，專利申請和出版物一并以全部進行參考。
發(fā)明概述在一方面本發(fā)明提供一種迅速、高效的用于再折疊IGF-I和IGFBP-3的有效方法，另外提供用于獲得天然IGF-I/IGFBP-3復合物的有效方法。本發(fā)明還提供了從天然IGF-I/IGFBP-3復合物中純化天然IGF-I和天然IGFBP-3的方法。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種迅速的用于再折疊IGF-I，使天然的IGF-I產(chǎn)量很高的高效的方法。
還有另一個方面，本發(fā)明提供一種迅速的用于再折疊IGFBP-3，使天然的IGFBP-3產(chǎn)量很高的高效的方法。
附圖簡要描述

圖1顯示了人類IGF-I的氨基酸順序圖2顯示了編碼人類IGF-I的核苷酸序列圖3和圖4顯示了IGFBP-3的可替換的兩個氨基酸序列。圖5、6和7顯示編碼人類IGFBP-3三個核苷酸序列。圖8顯示編碼酵母泛素水解酶(YUH)的核苷酸序列。圖9和圖10顯示了IGF-I和IGFBP-3共折疊的結(jié)果。實心菱形分別代表IGF-I或IGFBP-3單獨再折疊，而空心菱形代表共折疊的結(jié)果。
發(fā)明的說明因為不正確的折疊和不正確的二硫鍵結(jié)構(gòu)，在重組表達系統(tǒng)中以高水平表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常地表現(xiàn)出低的或不可檢測的生物活性。本發(fā)明提供了一種新的方法用于迅速的極高效地再折疊重組產(chǎn)生的IGF-I和IGFBP-3，產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3。在意外的結(jié)果中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)經(jīng)變性和還原的IGF-I和IGFBP-3的混合物的氧化，即，共折疊[在變性和還原的條件下，未折疊的或不正確折疊的IGF-I與未折疊的或不正確折疊的IGFBP-3組合，隨后氧化]對兩種蛋白質(zhì)在再折疊效率上產(chǎn)生協(xié)同增加，產(chǎn)生近100％天然的IGF-I和很高比例的天然IGFBP-3。本發(fā)明發(fā)明人也意外的發(fā)現(xiàn)再折疊的動力學過程從根本上改變，特別是IGFBP-3的折疊方面，使得再折疊所需時間大大減少。這些結(jié)果是特別驚人的，因為人們知道添加等摩爾量的IGFBP-3(Koedam和Leo van den Brande同上)對IGF-I的二硫化物異構(gòu)酶活性(一種酶促活性，使二硫鍵的破裂和重新形成的，同時有助于蛋白質(zhì)的再折疊)有抑制。本發(fā)明也提供了從重組表達系統(tǒng)產(chǎn)生天然IGF，天然IGFBP-3和天然IGF或IGFBP-3復合物的有效方法。直接根據(jù)本發(fā)明的IGF-I和IGFBP-3的共折疊形成IGF-I/IGFBP-3復合物。通過用那些本領(lǐng)域中已知而簡單的方法可以容易地將這些復合物與在折疊反應中不正確折疊的蛋白質(zhì)中分離開來。如果需要，可用那些本領(lǐng)域已知的方法容易的進一步對IGF-I和IGFBP-3分別進行分離和純化。
定義“類胰島素生長因子”或者“IGF”由一族因子構(gòu)成，包括但不限于，IGF-I和IGF-II。IGF是大約7.5Kd的分子量的多肽。IGF包括天然產(chǎn)生的IGF-I或者IGF-II，類似物或者其變體，以及IGF-I或者IGF-II之間和其它氨基酸序列之間的融合體。IGF可從天然來源得到或由重組方法制備。
本文中所用的“胰島素類生長因子結(jié)合蛋白-3”或“IGFBP-3”是胰島素生長因子結(jié)合蛋白的家族中的一員，它包括但不限于，IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6。IGFBP-3可以從天然的來源或重組方法制備。IGFBP-3與IGF-I形成復合物，第三個分子已知是ALS。
本文中所用的“天然IGF-I”指這樣的IGF-I，其包括天然產(chǎn)生的IGF-I、類似物，及其變體，其是正確折疊的且只包含正確的二硫鍵。正確的二硫鍵是在氨基酸殘基C6-C48、C47-52，和C18-C61，或IGF-I的類似物和變體中的那些氨基酸殘基的同源物之間形成的。天然的IGF-I有生物活性。
“不可溶的IGF-I”是指沉淀的或者聚合的IGF-I，其包含在宿主細胞中，或以其它方式與宿主細胞相聯(lián)系，并假設(shè)其具有不正確或不成形的二硫鍵從而是生物無活性的結(jié)構(gòu)。不可溶的IGF-I可能在包含體或折射體中，即，相差顯微鏡下是可見或不可見的。
“不正確折疊的IGF-I”指IGF-I，其具有不正確或不成形的二硫鍵從而是生物無活性的結(jié)構(gòu)。不正確折疊的IGF-I可能是，但不一定是不可溶的。
“不可溶的IGFBP-3”指沉淀的或者聚合的IGFBP-3，其包含在宿主細胞中，或以其它方式與宿主細胞相聯(lián)系，并假設(shè)其具有不正確或不成形的二硫鍵從而是生物無活性的結(jié)構(gòu)。不可溶的IGFBP-3可能在包含體或折射體中，即，相差顯微鏡下是可見或不可見的。
“不正確折疊的IGFBP-3”指IGFBP-3，其具有不正確或不成形的二硫鍵從而是生物無活性的結(jié)構(gòu)。不正確折疊的IGF-I可能是，但不一定是不可溶的。
本文所用的“天然的IGFBP-3”指這樣的IGFBP-3，其包括天然產(chǎn)生的IGFBP-3、類似物，及其變體，其是正確折疊的且只包含正確的二硫鍵。天然的IGFBP-3有生物活性。
本文所用的“天然IGF-I/IGFBP-3復合物”指天然IGF-I和天然IGFBP-3以非共價鍵結(jié)合的復合物。
本文所用的“還原劑”指在還原態(tài)中保持硫氫基團和還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵的任何化合物或物質(zhì)?？山邮艿倪€原劑包括但不限于二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原的谷胱甘肽。
本文所用的“氧化劑”指能從被氧化的化合物中移去一個電子的化合物或物質(zhì)?？山邮艿难趸瘎┌ǖ幌抻谘趸墓入赘孰摹㈦装彼?、胱胺、氧化的二硫蘇糖醇、氧化的赤蘚醇和氧氣。
本文所用的“變性劑”或“變性物”指能造成蛋白質(zhì)的可逆展開的化合物或物質(zhì)。變性劑或變性物的潛能是由變性劑或變性物的性質(zhì)和濃度決定的。可接受的變性劑或變性物可能是離液劑、除垢劑、有機溶劑、水溶性溶劑、磷脂或兩個或多個這樣藥劑的組合?？山邮艿碾x液劑包括但不限于尿素、胍和硫氰酸鈉。有用的除垢劑可以包括但不限于強除垢劑如十二烷基硫酸鈉或聚氧化乙烯醚(例如，Tween或Triton除垢劑)，溫和的非離子除垢劑(如毛地黃皂苷)，溫和陽離子除垢劑如N-[2，3-(二油基氧)-丙基]-N，N，N-三甲基銨，溫和的離子除垢劑(如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)或兩性離子除垢劑包括但不限于磺基甜菜堿(兩性離子劑)，3-(3-chlolamidopropyl)二甲氨基-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-chlolamidopropyl)二甲氨基2-烴基-1-丙烷-磺酸鹽(CHAPSO)。有機溶劑，水溶性溶劑如吲哚乙腈，更低的鏈烷醇(特別是C2-C4鏈烷醇如乙醇或異丙醇)，或更低的鏈烷二醇(特別是C2-C4鏈烷二醇，如乙烯-乙二醇)可以作為變性劑。在本發(fā)明中有用的磷脂可能是天然產(chǎn)生的磷脂如磷脂酰乙醇胺，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇，或合成的磷脂衍生物或者變體如二己酰基磷脂酰膽堿或二庚?；字Ｄ憠A。
本文所用的“再折疊”描述了設(shè)計為轉(zhuǎn)化多肽(使其從不正確的折疊或展開狀態(tài)變成其天然的正確折疊結(jié)構(gòu))的任何過程或方法。
本文中所用的“共折疊”指再折疊過程、反應或方法，其中涉及至少兩個相互作用多肽，其結(jié)果是從展開或不正確的折疊的狀態(tài)的多肽向天然的正確折疊結(jié)構(gòu)的多肽的轉(zhuǎn)化。
優(yōu)選的實施方案的描述本發(fā)明涉及IGF-I和IGFBP-3的共折疊，結(jié)果形成兩種蛋白質(zhì)的迅速高效的再折疊，從而產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3，本發(fā)明還涉及用于天然IGF-I、IGFBP-3和IGF-I或IGFBP-3純化的簡化方法。本發(fā)明可按如下步驟進行a)將IGF-I和IGFBP-3以1比3到3比1的摩爾比率組合，然后使其變性并用還原劑還原，或者將IGF-I和IGFBP-3單個變性并還原，然后以1比3到3比1的摩爾比率組合，形成IGF-I/IGFBP-3復合物；b)把氧化劑添加至步驟(a)的IGF-I/IGFBP-3的混合物中；c)(此步可有可無)可以從IGF-I/IGFBP-3共折疊混合物中純化IGF-I/IGFBP-3復合物；和d)(此步可有可無)IGF-I和IGFBP-3可單個從復合物中純化。
利用各種宿主細胞，包括但不限于細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞系，依據(jù)本發(fā)明的用于共折疊的IGF-I和IGFBP-3可在各種高表達的系統(tǒng)中產(chǎn)生。在細菌宿主細胞中產(chǎn)生IGF-I和IGFBP-3是優(yōu)選地。在大腸桿菌宿主細胞中產(chǎn)生IGF-I和IGFBP-3是更為優(yōu)選地，包括但是不限于大腸桿菌菌株W3110DE3。
宿主細胞是由包含編碼IGF-I或IGFBP-3的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化的。宿主細胞可以由本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)轉(zhuǎn)化，例如但不限于CaCl2用于細菌或酵母宿主細胞，CaPO4用于昆蟲或哺乳動物宿主細胞，或電泳用于任何類型的宿主細胞。用于宿主細胞轉(zhuǎn)化的方法可以在Sambrook等(1989)分子克隆實驗手冊(冷泉港出版社，冷泉港)和Ausubel(1987)分子生物學現(xiàn)代方案(John Wiley父子公司，紐約)中找到。
包含編碼IGF-I或IGFBP-3的DNA的表達載體可通過本領(lǐng)域已知的標準方法構(gòu)建。編碼IGF-I或IGFBP-3的DNA可來源于天然來源，如基因組或cDNA文庫，或通過化學合成。另外IGF-I或IGFBP-3的變體可用本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生，其中包括定點基因突變。生產(chǎn)變體的方法可在Sambrook，同上和Ausubel，同上中找到。
轉(zhuǎn)化的微生物宿主菌株是在液態(tài)培養(yǎng)基(含有可同化的碳源、氮源和無機鹽)中，用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化的昆蟲哺乳動物細胞，是在含有本領(lǐng)域已知的可吸收的碳源、氮源和無機鹽和可有可無的維生素、氨基酸、生長因子和其他蛋白質(zhì)培養(yǎng)添加物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基可包含抗生素或抗真菌劑以阻止不受歡迎的微生物和(或)化合物，包括但不限于篩選包含表達載體的宿主細胞的抗生素。
IGF-I和IGFBP-3可通過本領(lǐng)域已知的各種方法從宿主細胞中純化。正常情況下，在細菌宿主細胞中產(chǎn)生的IGF-I或IGFBP-3是難溶的或不溶的(以包含體形式存在)。對不能溶的蛋白質(zhì)，可通過離心從宿主溶胞產(chǎn)物中收集。對難溶性蛋白質(zhì)，可以加入化合物(包括但不限于聚乙烯亞胺(PEI))以引起有部分溶解性的蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)沉淀可由離心方便地收集。
可以利用為本領(lǐng)域已知的一些藥劑的任何一種，使不能溶解的或沉淀的IGF-I和IGFBP-3可溶。其中優(yōu)選地是，用尿素或胍鹽酸硫胺素的IGF-I或IGFBP-3是可溶的。
當IGF-I和IGFBP-3作為融合蛋白生產(chǎn)出來時，融合序列可以選擇性地除去。融合序列的除去可以由酶促或者化學斷裂完成，優(yōu)選地是酶促斷裂。利用本領(lǐng)域已知的方法完成酶促除去融合序列。為融合序列的除去所選擇的酶將按融合的特性決定，同時反應條件將通過酶的選擇加以確定，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這是明顯的。切開的IGF-I或IGFBP-3可以進一步用已知方法從所切開的融合序列進行純化。這些方法將由融合序列的特性和性質(zhì)決定，而這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。用于純化的方法可以包括但不限于篩析色譜、疏水相互作用色譜、離子交換色譜或透析。
優(yōu)選地是進一步純化IGF-I或IGFBP-3，從蛋白質(zhì)溶液除去DNA。DNA可用任何本領(lǐng)域已知的幾種方法除去，如沉淀或離子交換色譜，但是由魚精蛋白硫酸鹽沉淀除去是優(yōu)選地。IGF-I或IGFBP-3可以通過包括離心或過濾在內(nèi)的方法從沉淀的DNA分離。
依據(jù)本發(fā)明的用于共折疊的IGF-I或IGFBP-3可以在DNA除去后直接使用，或利用本領(lǐng)域已知方法進一步純化和(或)濃縮。相對不純(粗)的IGF-I和IGFBP-3的共折疊的好處是增加產(chǎn)量并且簡化天然IGF-I/IGFBP-3復合物的純化。共折疊復合物的純化只需要一個純化方案(與此相對的是兩個，即當對兩個多肽在共折疊前分開純化時)，并允許純化方案利用天然IGF-I/IGFBP-3復合物的性質(zhì)。
如果需要，可對IGF-I和IGFBP-3進一步純化。IGF-I和IGFBP-3的純化可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法完成，包括疏水相互作用色譜、篩析色譜、離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等。另外的純化也可以包括對純化的蛋白質(zhì)的干燥或沉淀的步驟。當IGF-I和IGFBP-3被干燥或沉淀時，蛋白質(zhì)可以在在變性物中再溶解前組合，或單個再溶解并組合來用于共折疊。
IGF-I和IGFBP-3的變性可由各種變性劑完成，包括但不限于，尿素或胍。尿素為變性劑是優(yōu)選的。變性可在一步中完成，其中IGF-I和IGFBP-3由濃的用于共折疊的變性劑溶液變性，或在兩步中完成，其中IGF-I和IGFBP-3用高濃度的變性劑變性，隨后稀釋，產(chǎn)生含有一定濃度的變性劑的在共折疊中有用的溶液。在一步變性過程中，變性劑(這里變性劑是尿素)濃度優(yōu)選地為大約1至2M。在兩步變性過程中，變性劑的濃度(這里變性劑是尿素)優(yōu)選地為大約5至7M，優(yōu)選地是稀釋成為大約1至2M以進行共折疊過程。
IGF-I和IGFBP-3的還原可以和變性同時完成，或者是在變性之后完成。IGF-I和IGFBP-3的還原可以通過各種還原劑完成，包括但不限于，二硫蘇糖醇(DTT)，2-巰基乙醇，半胱氨酸，半胱胺(2-氨基乙硫醇)，或還原的谷胱甘肽。優(yōu)選地還原劑是二硫蘇糖醇。如變性中所討論的，IGF-I和IGFBP-3的還原可以是一步或兩步，其中多肽由在共折疊過程中有用的一定濃度的還原劑還原，或者其中的多肽由高濃度的還原劑還原，隨后將還原劑稀釋到對共折疊有用的濃度。當還原劑是二硫蘇糖醇時，還原劑的高濃度最好在大約30至50mM，用于共折疊的濃度最好大約5至15mM。
然后將變性的和還原的IGF-I和IGFBP-3溶液氧化形成二硫鍵?？山邮艿难趸瘎┌ǖ幌抻冢入赘孰?，胱氨酸，和胱胺。氧化劑優(yōu)選地是胱胺。
共折疊可以無限的繼續(xù)。然而，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IGF-I和IGFBP-3的共折疊實質(zhì)上加速了共折疊的動力學過程。因此，這個反應可以繼續(xù)更短的時間，短到1到2個小時。理想的是共折疊反應持續(xù)4個小時，更理想的是共折疊反應進行1到3個小時。
在完成共折疊反應后，可對天然的IGF-I/IGFBP-3復合物純化。對天然的IGF-I/IGFBP-3復合物可用各種方法，包括但不限于，篩析、離子交換色譜、疏水相互作用色譜。優(yōu)選地，天然IGF-I/IGFBP-3復合物用硫代丙基衍生化的柱色譜基質(zhì)的陽離子交換色譜(如，SP-Sephadex，Pharmacia，Uppsala，瑞典)純化。另外天然的IGF-I和IGFBP-3可從復合物中用各種方法進行純化。通過解散復合物(最好是在酸性條件下)從復合物純化IGF-I和IGFBP-3是優(yōu)選的，隨后通過篩析色譜分析。純化的復合物或IGF-I或IGFBP-3可被交換到不同的緩沖液中和(或)通過本領(lǐng)域已知的各種方法濃縮。以下的實施例目的在于說明本發(fā)明。這些實施例無意以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1.用于IGF-I和IGFBP-3生產(chǎn)的包含IGF-I和IGFBP-3序列的表達載體用以生產(chǎn)IGF-I和IGFBP-3的表達構(gòu)建體類似于pJU1002和pJU1003(Squires等(同上)生物化學雜志26316297-16302)，除插入翻譯耦合器下游的基因是輔酶-IGF(pER10088)，和IGFBP-3(pDJ12833)。此外，pER10088和pDJ12833不同于pJU1003在于它們不含有在那個質(zhì)粒中的tet基因的5’末端的合成的16bp的銜接子序列；但是它們確實包含在pBR322-來源的骨架的單一PvulI位點的DNA插入物pER10088在那個位置包含接頭5’...CCTCGAGG...3’；pDJ12833包含一個攜帶pSC101的par座的385bp片段(Meacock和Cohen(1980)細胞20529-542)。
pER10088包含開放讀框(ORF)，該讀框包括(按順序，5’到3’)一個ATG三聯(lián)體(起始)，酵母泛素的76密碼子，成熟人類胰島素生長因子I的70合成密碼子和終止密碼子。
PDJ12833包含ORF，其包括一跟隨成熟人類的IGFBP-3的264密碼子的ATG三聯(lián)體。氨基-末端95密碼子是合成的；其余部分來源于這個基因的天然的cDNA。
在每種情況之下，ORF相對于翻譯偶合體的位置完全如Squires等(1988)對成纖維細胞生長因子的描述。
實施例2.IGF-I的重組產(chǎn)生IGF-I可以用如在實施例1中所描述的那些表達載體構(gòu)建體生產(chǎn)。利用氯化鈣轉(zhuǎn)染，將用于IGF-I融合蛋白(PER10088)生產(chǎn)的表達構(gòu)建體引入大腸桿菌菌株W3110DE3(Sambrook，同上)。
將W3110DE3/PER10088在37℃下在100升液體中培養(yǎng)直到培養(yǎng)物在600納米的光密度(OD600)達到至少大約25。添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)到0.4mM誘導IGF-I表達。將誘導的細菌進一步培養(yǎng)，后經(jīng)離心收集。沉淀的細胞在具有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸鈉緩沖液(50mM，pH＝5.5)中再懸浮。用Microfluidizer(M-210-EH型，Microfiuidics公司)對細菌進行透析。因為并非所有在這些宿主細胞中所產(chǎn)生的IGF-I融合蛋白都是不能溶解的，將聚乙烯亞胺(PEI)加入至濃度為0.1％，以沉淀可溶性和部分可溶的IGF-I融合蛋白。
不可溶解的和沉淀的IGF-I融合蛋白通過離心收集，然后用2M尿素，50mM磷酸鉀，2mM二硫蘇糖醇(pH值5.8-5.9)洗滌一次，通過離心回收。然后用6M尿素，20mM三氨基甲烷，30mM二硫蘇糖醇，1mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)將IGF-I沉淀溶解。把魚精蛋白硫酸鹽添加到濃度為0.14％，使DNA從溶液中沉淀。沉淀的DNA通過離心除去，含有IGF-I融合蛋白的上清液在Q-Sepharose上通過離子交換色譜進一步純化。IGF-I融合蛋白以泛素水解酶消化，所述的水解酶來源于在大腸桿菌中表達pER1011(一個編碼酵母泛素水解酶的表達載體(編碼酵母泛素水解酶的序列如圖8所示))，隨后按照Liu等(1989)(生物化學雜志26420331-20338 PER1011與PJU1002類似，除了在PvuII位點存在5’...CCTCGAGG...3’接頭外)進行純化，產(chǎn)生成熟的IGF-I。
然后將IGF-I在2M尿素、10mM二硫蘇糖醇和20％乙醇中，在10mM胱胺的存在下變性和再折疊。用在SP-瓊脂糖凝膠上的陽離子交換色譜和用C18柱(Vydac)進行反相高性能液相色譜進一步純化IGF-I。
實施例3.IGFBP-3的重組產(chǎn)生IGFBP-3可以用如在實施例1中所描述的那些表達載體構(gòu)建體產(chǎn)生。利用本領(lǐng)域已知的方法(如在Sambrook，同上和Ausubel，同上中描述的)，將用于IGFBP-3 PDJ12833產(chǎn)生的表達構(gòu)建體引入大腸桿菌菌株W3110DE3中并且分離克隆。
將克隆W3110DE3/PDJ12833在37℃下在100升液體中培養(yǎng)直到培養(yǎng)物達到在600納米的光密度(OD600)為25。添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)到0.4mM誘導IGFBP-3的表達。將誘導的細菌進一步培養(yǎng)，后經(jīng)離心收集。沉淀的細胞在具有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸鈉緩沖液(50mM，pH＝5.5)中再懸浮。用Microfluidizer(M-210-EH型，Microfiuidics公司)對細菌進行透析。
不可溶解的和沉淀的IGFBP-3通過離心收集，然后用2M尿素，50mM磷酸鉀，2mM二硫蘇糖醇(pH值5.8-5.9)洗滌一次，通過離心回收。然后用6M鹽酸胍，100mM三氨基甲烷，25mM二硫蘇糖醇，5mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)將IGFBP-3沉淀溶解。然后用100mM三氨基甲烷，5mM乙二胺四乙酸(pH值＝8.0)將含IGFBP-3的溶液稀釋。把魚精蛋白硫酸鹽添加到濃度為0.14％，使DNA從溶液中沉淀。沉淀的DNA通過離心除去，含有IGFBP-3的上清液通過50mM三氨基甲烷(pH＝10.6)進一步稀釋。IGFBP-3在將胱胺加到6mM后進行隔夜再折疊。
用超濾作用將IGFBP-3溶液濃縮，然后通過對2M尿素，20mM三氨基甲烷(pH＝7.0)滲濾進行溶劑交換。使IGFBP-3在Q-瓊脂糖凝膠，隨后在SP-瓊脂糖凝膠上進行離子交換色譜進行純化。用C18柱(Vydac)通過RP-HPLC進一步純化IGFBP-3。
實施例4.IGF-I和IGFBP-3的共折疊重組產(chǎn)生的IGF-I和IGFBP-3以等摩爾比率混合，然后由凍干法干燥。把干燥的蛋白質(zhì)混合物溶解到變性/還原緩沖液中(80mM三氨基甲烷，pH值＝8.3，1.5M尿素，1mM乙二胺四乙酸，10mMDTT)，到最后的濃度為1mg/ml。將胱胺氫氯化物添加至最后濃度為10mM胱胺。單獨地的IGF-I再折疊和單獨的IGFBP-3再折疊作為對照。共折疊和再折疊反應物在5℃下溫育。在加入胱胺以前立即取樣(0小時)，和在這之后1，2，3，和4小時取樣，對樣品進行RP-HPLC分析。對0小時點的分析表明IGF-I和IGFBP-3都完全被還原。用Waters 626-1 HPLC儀在Poros R2/H柱(直徑4.6mm，長為100mm)上用線梯度13.5％到54％的吲哚乙腈(帶0.1％三氟醋酸)進行RP-HPLC。
IGF-I和IGFBP-3單獨地再折疊給出低產(chǎn)率的天然蛋白質(zhì)。IGF-I單獨折疊只給出產(chǎn)量為13％，IGFBP-3單獨折疊產(chǎn)生45.1％天然蛋白質(zhì)。相對地，當共折疊時，實際上所有的IGF-I(99.6％)和大多數(shù)IGFBP-3(83％)都正確的折疊。這些結(jié)果表明IGF-I和IGFBP-3共折疊的結(jié)果在天然IGF-I和IGFBP-3的產(chǎn)量上有協(xié)同增加。
共折疊反應的分析還表明，除增加天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)量外，共折疊也改變再折疊的動力學。圖9和圖10顯示了IGF-I和IGFBP-3單獨的再折疊或共折疊的時間進程。共折疊方法增加了再折疊的初始速率和再折疊的最大速率以及再折疊的整個產(chǎn)量。
實施例5.共折疊的IGF-I和IGFBP-3的生物活性的測定這個實施例說明根據(jù)本發(fā)明的再折疊的IGF-I、IGFBP-3和IGF-I/IGFBP-3復合物有生物活性。
把人類骨肉瘤MG63細胞(5×105個細胞)平板接種在175培養(yǎng)瓶中，在細胞培養(yǎng)基(補充了10％胎牛血清、50單位/ml的青霉素，50μg/ml的鏈霉素，非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺的RPMI培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶放在37℃下潮濕的5％CO2/95％空氣中2-3天。在細胞的培養(yǎng)物變得匯合之前，將細胞從培養(yǎng)瓶取走，放在胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液中培養(yǎng)。加入培養(yǎng)基(6ml)以停止胰蛋白酶，將細胞轉(zhuǎn)移到離心管中。將細胞在800xg離心5-10分鐘，再在10ml的測試培養(yǎng)基(補充了50單位/ml的青霉素，50μg/ml鏈霉素，非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，2.5μg/ml牛纖連蛋白，5μg/ml的人類轉(zhuǎn)鐵蛋白，75μg/ml的卵清蛋白，3μM地塞米松的RPMI培養(yǎng)基)中懸浮。
將IGF-I參照標準和共折疊的IGF-I和IGFBP-3樣品在96-孔平板中用測定培養(yǎng)基系列稀釋。對通過共折疊方法再折疊的IGF-I/IGFBP-3復合物，IGF-I和IGFBP-3進行測試。每個孔包含標準或測試樣品50μl。IGF-I的參照標準的濃度范圍是0.244～500ng/ml。
將已經(jīng)在測定培養(yǎng)基上制備了的MG63人類骨肉瘤細胞，以5000/孔平板接種，容積為50μl/孔。在每個孔中總體積是100μl。將平板放在37℃下潮濕的5％CO2/95％空氣中4天。
在培養(yǎng)后期，通過測量磷酸酶活性來測定細胞生長，其與骨肉瘤的數(shù)量成比例的。將平板從培養(yǎng)箱中取出，并將培養(yǎng)基從孔中吸出。每個孔各用200μl的磷酸緩沖鹽水沖洗。在每個孔中加入100μl的10mM對-硝基苯基磷酸鹽，100mM醋酸鈉，1％Triton X-100(pH＝5.5)，將平板在37℃下培養(yǎng)2小時。在每孔中加入10μl的1.0N的氫氧化鈉來阻止磷酸對對-硝基苯基磷酸鹽的水解。將平板在室溫上培養(yǎng)最少10分鐘。測量在405nm處的吸收率，同時參考在490nm處的吸收率。
從每個孔的吸收率減去背景吸收率。將平均吸收率作為IGF-I濃度的函數(shù)作圖。ED50(IGF-I吸收率的值是最大吸收率的一半時的濃度)是從劑量-反應曲線就每種樣品和參考標準計算的。每種樣品的活性可表達為IGF-I參考標準的ED50與樣品的ED50的比率。
本文已經(jīng)通過直接描述和實施例對本發(fā)明進行了詳細描述。與本發(fā)明等同的和修飾的對本領(lǐng)域技術(shù)人員是很明顯的，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物的方法，該方法包括使所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物變性；使IGF-I和IGFBP-3的混合物還原，由此形成還原的和變性的IGF-I和IGFBP-3的溶液；向所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物加入氧化劑；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
2.一種用于產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物的方法，該方法包括使IGF-I變性；使所說的IGF-I還原，由此產(chǎn)生還原的和變性的IGF-I；使IGFBP-3變性；使所說的IGFBP-3還原，由此產(chǎn)生還原的和變性的IGFBP-3；混合所說的還原的和變性的IGF-I與還原的和變性的IGFBP-3，從而形成還原的和變性的IGF-I和IGFBP-3的混合物；在還原的和變性的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化劑；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
3.一種用于產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物的方法，該方法包括使IGF-I變性，由此產(chǎn)生變性的IGF-I；使IGFBP-3變性，由此產(chǎn)生變性的IGFBP-3；混合所說的變性的IGF-I與變性的IGFBP-3，從而形成變性的IGF-I和IGFBP-3的混合物；使所說的變性的IGF-I和IGFBP-3的混合物還原，從而形成變性的和還原的IGF-I和IGFBP-3的混合物；在變性的和還原的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化劑；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
4.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括從所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物分離所說的天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
5.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括從所說的天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物分離天然的IGF-I。
6.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括從所說的天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物分離天然的IGFBP-3。
7.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括在添加所說的氧化劑之前稀釋所說的變性的和還原的IGF-I和IGFBP-3的混合物的步驟。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物的摩爾比率大約為1比3到3比1。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物的摩爾比率大約為1.5比1到1比1.5。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物由尿素或胍變性，所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物由二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺，或還原的谷胱甘肽還原，所說的氧化劑是胱氨酸、胱胺、氧氣、氧化的二硫蘇糖醇、氧化的二硫赤蘚糖醇，或氧化的谷胱甘肽。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物由尿素(濃度大約在1到2M)變性，所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物由二硫蘇糖醇(濃度大約在5至15mM)還原，所說的氧化劑濃度大約在5至15mM。
12.一種用于產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物方法，該方法包括使IGF-I變性；使所說的IGF-I還原；加入天然IGFBP-3，由此形成IGFBP-3與還原的和變性的IGF-I的溶液；在所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化劑；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
13.一種用于產(chǎn)生天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物方法，該方法包括使IGFBP-3變性；使所說的IGFBP-3還原；加入天然的IGF-I，由此形成IGF-I與還原的和變性的IGFBP-3的溶液；在所說的IGF-I和IGFBP-3的混合物中加入氧化劑；并且形成天然的IGF-I和IGFBP-3的復合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的用于再折疊類胰島素生長因子I(IGF－I)和類胰島素生長因子結(jié)合蛋白－3(IGFBP－3)的方法。該方法涉及在共折疊反應中混合IGF－I和IGFBP－3。本發(fā)明的共折疊方法的結(jié)果是使兩種分子的正確地折疊的蛋白質(zhì)實質(zhì)上有更高的產(chǎn)量,并且改變再折疊的動力學。該方法包括正確地折疊的IGF－I,IGFBP－3,和/或IGF－I/IGFBP3復合物。
文檔編號C07K1/113GK1214689SQ96195432
公開日1999年4月21日 申請日期1996年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者A·索莫, Y·奧加瓦, P·陶 申請人:塞爾特里克斯藥物公司