專利名稱：二硫橋連雙鏈形式的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)的制作方法
二硫橋連雙鏈形式的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)
本發(fā)明的一個方面涉及通過在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)產(chǎn)生雙鏈 形式的蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及雙鏈生物學(xué)活性形式的蛋白 質(zhì)或多肽，其可通過前述的方法產(chǎn)生。
它們與相應(yīng)的不呈現(xiàn)本發(fā)明特征的重組蛋白質(zhì)/多肽相比，重要的優(yōu)勢在 于不必為了定向切割多肽鏈而用特異性蛋白酶處理，因而產(chǎn)生方法得以顯著
簡化。本發(fā)明的其它方面為編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)的核酸；含有這 樣的核酸或核酸序列的載體；含有前述載體的宿主細(xì)胞；和最后含有雙鏈和 生物學(xué)活性蛋白質(zhì)/多肽的藥物制劑。
梭菌神經(jīng)毒素是神經(jīng)細(xì)胞中釣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)的分泌的強抑制劑。在通 過口腔攝入肉毒桿菌毒素(BoNT)(例如通過腐敗的食物)之后，將出現(xiàn)被稱作 肉毒中毒的臨床現(xiàn)象，其特征在于多種肌肉的麻瘠。呼吸肌的麻痹最終可導(dǎo) 致患者的死亡。在這種情況中，從神經(jīng)到肌肉的信號轉(zhuǎn)移在肌感受器 (myoceptor)處被中斷，因為運動神經(jīng)元不再能夠分泌乙酰膽堿。肉毒桿菌神 經(jīng)毒素通過蛋白水解切割參與該分泌過程的蛋白質(zhì)，即所謂SNARE蛋白， 來產(chǎn)生它們的抑制作用。在這里，不同血清型的神經(jīng)毒素在SNARE蛋白和 各自氨基酸序列的切割位點方面具有不同的特異性。BoNT(A)和BoNT(E)切 割SNARE蛋白SNAP-25,而BoNT(C)將SNAP-25以及突觸融合蛋白-1識別 為底物。同樣，血清型B、D、F和G的毒素以及破傷風(fēng)毒素(TeNT)切割VAMP-2 (synaprobrevin-2) (Schiavo et al" 1997)。
梭菌神經(jīng)毒素是已知的最強的毒藥。例如，導(dǎo)致劑量組所有小鼠的一半 死于肉毒中毒的靜脈給藥致死劑量僅為5 pg。大多數(shù)血清型的毒素當(dāng)口服時 也是有毒的，這是由于它們被包埋在復(fù)合蛋白質(zhì)中，因此在通過胃腸道時免 遭消化酶分解。人們還認(rèn)為它們在通過小腸上皮細(xì)胞再吸收毒素中起作用 (Fujinaga， 1997)。
在過去的幾十年中，血清型A和B的肉毒桿菌毒素已經(jīng)在治療中得到了 應(yīng)用。例如，通過定位注射僅最小劑量即可能松弛個體慢性痙攣的肌肉。一 個特別的優(yōu)點是長效，例如，BoNT(A)和BoNT(B)的效力多于三到六個月。
最先的適應(yīng)證包括張力失常，例如斜頸(torticollia)、瞼痙攣和斜-見；又增加了 更多的適應(yīng)證，例如多汗或用于平滑皺紋的美容治療。肉毒桿菌作為治療劑 的市場增長迅速，相當(dāng)重要的原因是發(fā)展了更多的適應(yīng)證，而且在已有的用 途中有了更加廣泛的使用。在這樣的背景下，人們嘗試了對神經(jīng)毒素在活性 持續(xù)時間、效力和抗原潛力方面的性質(zhì)加以改進(jìn)。測試顯示商業(yè)上可獲得的 制劑(可獲自Allergen的BOTOX和可獲自Ipsen-Beaufort的Dysport,均為 BoNT(A)制劑；以及可獲自Elan的Myobloc/Neurobloc,為BoNT(B)制劑)中 含有的復(fù)合蛋白質(zhì)對活性持續(xù)時間和效力不具積極影響，但是由于蛋白質(zhì)量 比具有相同活性的純神經(jīng)毒素制劑更高，可導(dǎo)致患者免疫反應(yīng)的觸發(fā)，使進(jìn) 一步的注射變得無效。
由于復(fù)合蛋白質(zhì)在活性成分制劑中不是必需的，甚至是不利的，并且某 些用于改進(jìn)特性的修飾只能通過基因技術(shù)完成，因此人們對通過重組表達(dá)產(chǎn) 生神經(jīng)毒素存在強烈的需求，例如，通過在大腸桿菌中的表達(dá)(以這種方式產(chǎn) 生的神經(jīng)毒素不含前述的復(fù)合蛋白質(zhì))。此外由于肉毒桿菌毒素將被賦予不同 的細(xì)胞特異性，將發(fā)展新的適應(yīng)證。這里，通過重組毒素或毒素衍生物的途 徑同樣是優(yōu)選的。
肉毒桿菌毒素以及破傷風(fēng)毒素在它們的氨基酸序列上具有高同源性，并 且特別是在其域結(jié)構(gòu)方面是相似的。它們由受體結(jié)合域(Hc)、易位域(Hn)和催 化亞基(L)組成，其導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞中相應(yīng)SNARE蛋白的切割。Hc負(fù)責(zé)神經(jīng)毒 素特異性結(jié)合到肌感受器，而易位域保證L能夠通過核內(nèi)體進(jìn)入神經(jīng)元的細(xì) 胞質(zhì)。Hn(N末端)和Hc(C末端)形成100kDa的重鏈，而L是輕鏈，形成50 kDa的催化亞基。兩種多肽鏈彼此通過二硫鍵相連。在參與的半胱氨酸殘基 之間有接頭區(qū)或環(huán)區(qū)(還同義地稱為接頭序列或環(huán)序列，或更簡單的，稱為接 頭或環(huán))，其長度在各種血清型的肉毒桿菌毒素之間變化很大。最遲在細(xì)胞溶 胞過程中從梭菌釋放毒素時，該環(huán)被至今還未定性的梭菌內(nèi)肽酶切割，其中 切割和未切割的種類的比率在血清型之間有所不同。對于神經(jīng)毒素的活性而 言，將環(huán)切割成雙鏈毒素是關(guān)鍵的(Schiavoetal., 1997)。例如，在肉毒桿菌神 經(jīng)毒素A的情況下，從環(huán)中，即環(huán)序列VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL中， 切出一個十肽，其在N末端以及C末端有半胱氨酸殘基直接相鄰，不僅一個 肽鍵被切割，而且發(fā)生兩個蛋白酶切割作用。在這種情況下，生物活性的肉 毒桿菌神經(jīng)毒素A的分子量天然地低于原本在梭菌中翻譯的毒素的分子量。
因為其他宿主生物體例如大腸桿菌中不存在梭菌蛋白酶，重組肉毒桿菌 毒素和它們的片段或衍生物在其中作為單鏈肽表達(dá)。對于任何其它作為雙鏈 蛋白發(fā)揮其正常生物/生化活性的蛋白質(zhì)而言也是如此 一般而言，這種蛋白
質(zhì)通過重組DNA技術(shù)作為單鏈蛋白獲得，它們天然作為雙鏈蛋白發(fā)揮的生物 /生化活性因此幾乎不存在或完全不存在。
在過去，為了產(chǎn)生活性的蛋白質(zhì)，尤其是活性的肉毒桿菌毒素，必須插 入序列特異性蛋白酶(例如凝血酶、因子Xa AA或genenase)的識別序列，使 得在純化之后，能夠通過添加內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行切割并由此進(jìn)行活化。這種內(nèi) 切蛋白酶的使用主要有兩種的缺點 一方面，不能在任何情況下排除這樣的 可能，即除了通過基因.技術(shù)方法添加的切割位點之外，氨基酸序列中還存在 其它添加的切割位點。即使當(dāng)這些次要切割位點的切割效率顯著較低時，在 蛋白酶處理之后，毒素的不同切割變體的混合物可導(dǎo)致分離上的困難。另一 方面，在藥物制劑的情況下，由于制藥法律(受規(guī)章限制的考慮因素)的原因， 后續(xù)添加蛋白質(zhì)或讓制劑接觸其它蛋白質(zhì)是非常不利的，因為必須證明該蛋 白質(zhì)和其可能存在的污染物在進(jìn)一步的處理中得以完全去除；這通常需要相
當(dāng)?shù)幕ㄙM。
對于其它細(xì)菌毒素(例如假單胞菌外毒素或白喉毒素)，也需要通過蛋白水 解切割成雙鏈二硫橋連多肽的活化來使酶域發(fā)揮毒性作用(例如，通過ADP 核糖基化延伸因子并且由此抑制蛋白質(zhì)合成)。這些毒素用于產(chǎn)生所謂的免疫 毒素，特別是用于腫瘤治療。為了這種目的，將毒素的細(xì)胞結(jié)合域換成對腫 瘤特異表面蛋白(分化抗原或腫瘤相關(guān)抗原)具有高結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)域。在 經(jīng)典的免疫毒素中這些蛋白質(zhì)域由單克隆抗體或其片段組成，但也可以利用 下述蛋白質(zhì)來賦予針對某些腫瘤細(xì)胞的特異性，僅舉數(shù)例細(xì)胞因子、生長 因子以及affilin、錨蛋白重復(fù)蛋白或經(jīng)過突變和選擇的anticalin家族蛋白質(zhì) 等。在這種融合蛋白的重組表達(dá).中，獲得單鏈多肽。然而，例如，除了蓖麻 (i /c/m commww'力的蛋白酶以外，蓖麻毒蛋白沒有蛋白酶加工位點，而必須 插入這種位點，白喉毒素片段和假單胞菌外毒素片段作為免疫毒素的組成部 分能夠在內(nèi)在化于內(nèi)體區(qū)室中之后被目標(biāo)細(xì)胞的蛋白酶所切割。這在形成二 硫鍵的半胱氨酸殘基之間的環(huán)區(qū)域中發(fā)生。然而，僅僅最小部分而非全部內(nèi) 在化的免疫毒素分子以這種方式被加工(Ogata et al., 1990)。
為了以足夠的數(shù)量和可溶的形式獲得重組蛋白，尤其是較小的多肽，在
許多情況下必須將它們作為融合蛋白或雜合蛋白，例如與谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶
或麥芽糖結(jié)合蛋白融合或雜合的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)。此外，市場上有許
多借助用于親和純化的N-末端或C-末端標(biāo)簽(例如His標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽或 FLAG標(biāo)簽)來表達(dá)所需多肽的表達(dá)系統(tǒng)。許多情況下，表達(dá)質(zhì)粒中在插入所 需蛋白的編碼DNA序列的多克隆位點和融合配偶體(ftision partner)或親和標(biāo) 記物的編碼序列之間存在蛋白酶識別序列。該序列被這樣設(shè)計，使得在表達(dá) 和純化融合蛋白之后，通過添加合適的序列特異內(nèi)切蛋白酶(例如，凝血酶、 因子Xa或genenase)，能夠?qū)⑺璧鞍讖念~外的肽區(qū)域分離出來。如果兩種 融合配偶體通過二硫鍵而非肽鍵彼此共價結(jié)合，則在純化之后借助含巰基物 質(zhì)例如P-巰基乙醇、DTT或還原谷胱甘肽的簡單還原作用將其彼此分離是可 能的。例如，可使用前述還原劑將所需的蛋白質(zhì)從親和基質(zhì)(例如Ni-NTA瓊 脂糖或StrepTactin瓊脂糖)洗脫，而親和標(biāo)簽保持與基質(zhì)結(jié)合。這樣就可以免 去分離親和標(biāo)簽的進(jìn)一步純化步驟或添加內(nèi)切蛋白酶。
因此，最好提供一種方法，用來重組表達(dá)各種蛋白質(zhì)/多肽，尤其是神經(jīng) 毒素和所述神經(jīng)毒素的片段和衍生物以及融合蛋白或雜合蛋白，特別是用來 重組表達(dá)這樣的免疫毒素其在宿主細(xì)胞裂解之后已經(jīng)以其生物活性的雙鏈 結(jié)構(gòu)存在，其中所述兩條鏈?zhǔn)嵌驑蜻B的。本文所述的發(fā)明提供了這種用于
產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)和多肽的方法。
令人驚訝的是，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BoNT(A)的LHn片段或完整的神徑毒 素A——二者通過重組表達(dá)作為單鏈獲得，但均以雙鏈二硫橋連形式發(fā)揮它 們正常的生物/生化活性——被施以至少一個特定的修飾,優(yōu)選核酸水平的修 飾時，可通過重組表達(dá)以雙鏈形式獲得LHN片段和完整的毒素。發(fā)明者進(jìn)行 的后續(xù)測試已證明，對于任何其他蛋白質(zhì)/多肽也是如此，如果它們依照常規(guī) 重組方法作為單鏈獲得但以雙鏈二硫鍵形式發(fā)揮其生物活性的話。
前述"至少一個修飾"在BoNT(A)的情況下或在BoNT(A)的LHn片段的 情況下，涉及一種五肽序列的插入，該五肽序列在本文中稱為PRS(蛋白酶識 別位點)。對于蛋白質(zhì)/多肽的一般情況，可以對存在于待修飾(優(yōu)選在核酸水 平)的蛋白質(zhì)/多肽中的五肽序列進(jìn)行這樣的修飾(例如，通過替換至少一個氨 基酸殘基或通過插入PRS的少數(shù)氨基酸殘基或通過缺失氨基酸殘基)，使得其 與插入到已經(jīng)存在的序列中的五肽序列PRS —致。以相同的方式可插入六/ 七/八(等)肽序列插入，需要或不需要缺失一個或兩個或三個或數(shù)個氨基酸殘
基。依照本發(fā)明，有利無害的是最終表達(dá)的多肽在其環(huán)區(qū)域具有PRS(五肽) 序列，其中所述"環(huán)區(qū)域"根據(jù)本發(fā)明定義為位于兩個參與二硫一建的半胱氨
酸殘基之間的氨基酸序列。當(dāng)該PRS序列存在于環(huán)區(qū)域時將產(chǎn)生這樣的結(jié)果， 即在切斷多肽序列PRS相鄰的單鏈多肽后(在氨基酸水平)，天然存在于兩條 不同鏈中的序列也被分到兩條不同的鏈上。在肉毒桿菌神經(jīng)毒素A (BoNT(A)) 的情況下，該PRS序列優(yōu)選地通過缺失BoNT(A)的五肽Asp443 - Asp447而插 入到環(huán)中(參見圖3-1)。在其它蛋白質(zhì)/多肽中(例如，在BoNT(B)、 BoNT(Cl)、 BoNT(D)、 BoNT(E)的情況下，在蓖麻毒蛋白的情況下，在假單胞菌外毒素 PE40的情況下或在白喉毒素(DT)的情況下)，則優(yōu)選將經(jīng)》務(wù)飾的BoNT(A)的 環(huán)插入到環(huán)序列中(參見圖3-2至3-5)，其中可缺失掉或不缺失掉天然環(huán)序列 的氨基酸殘基。圖3-2至3-5中修飾的環(huán)序列是不具有兩個末端Cys殘基的 那些序列，其中PRS序列的中央氨基酸不但可以是R、 Y、 H或Q,還可以 是任何其它天然存在的氨基酸。在前述其他蛋白質(zhì)/多肽的情況下，特別優(yōu)選 插入僅僅 一 部分經(jīng)修飾的 BoNT(A)的環(huán)，尤其是序列 GIITSKTKSLVPXGSKALNDL (X-天然存在的氨基酸)，其中可以缺失掉或不 缺失掉天然環(huán)序列的氨基酸殘基。圖3-2至3-5中的^奮飾的環(huán)序列是那些不具 有兩個末端Cys殘基的序列。
因此，對于BoNT(A)的LHN片段或?qū)τ谕暾闹亟M毒素，這意味著序列 修飾是L和HN之間的環(huán)區(qū)域中的改變，并且這種改變?yōu)镻RS序列的存在作 了準(zhǔn)備。根據(jù)本發(fā)明，PRS序列，不只對于BoNT(A)，是五肽序列 Val-Pro-Xaa-Gly-Ser。 Xaa代表任何天然存在的氨基酸。與Xaa是Arg還是任 何其它天然存在的氨基酸無關(guān)，在任何情況下均將五肽序列 Val-Pro-Xaa-Gly-Ser稱作五肽序列。然而當(dāng)PRS序列的另外四個氨基酸殘基 之一被替換時一一這在本發(fā)明的背景下確實是可能的一一特別是替換為相應(yīng) 的親水/疏水或極性單極殘基時，將此情況下和下文中，將把該序列稱為PRS 五肽序列的變體。例如，當(dāng)Val被Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Pro或Gly取代時即 出現(xiàn)變體。此外，(還或僅)當(dāng)PRS從N末端數(shù)起第二位的脯氨酸由Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Val或Gly取代時出現(xiàn)變體。同樣，PRS的第四位的甘氨酸可以， 例如，^皮Leu、 Ile、 Ala、 Pro、 Phe或Val取代；這導(dǎo)致其它的變體。并且當(dāng) PRS的第五位的絲氨酸被例如，Tyr、 Trp、 Thr,及任選地Cys或Met取代時， 將出現(xiàn)另外類型的變體。根據(jù)本發(fā)明，將至少在PRS序列的位置1、 2、 4和
5之一含有不同于Val-l、 Pro-2、 Gly-4和/或Ser-5氨基酸殘基的那些序列稱 為五肽序列的變體。
當(dāng)BoNT(A)的LHN片段(或完整的毒素)或任何其它蛋白質(zhì)/多肽一一其通 常由重組表達(dá)作為單鏈蛋白質(zhì)/多肽獲得但(僅)在雙鏈形式是生物/生化活性 的——含有五肽序列Val-Pro-Xaa-Gly-Ser (其中Xaa是20種天然存在的氨基 酸中的任一種，且其中四個其它氨基酸可根據(jù)上段的含義加以取代)時，其將 以雙鏈形式存在于大腸桿菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌K12,尤其是菌抹 M15[pREP4]、 XL1-BLUE或UT5600的大腸桿菌K12宿主細(xì)胞)的裂解物中， 其中在BoNT(A)的情況下，輕鏈通過二硫鍵共價結(jié)合至Hw或完整的重鏈(圖 7)。多肽鏈的切割在細(xì)胞裂解之后立即實現(xiàn)，或在溫育細(xì)胞裂解物幾小時后 基本上完成。通過毒素或毒素片段的蛋白酶域活性的自我蛋白酶解是可以排 除的，因為相應(yīng)修飾了環(huán)區(qū)域的蛋白酶失活突變體在表達(dá)和大腸桿菌宿主細(xì) 胞解體之后仍以雙鏈結(jié)構(gòu)存在。顯而易見，負(fù)責(zé)切割PRS五肽序列的是大腸 桿菌宿主菌抹的蛋白酶。
根據(jù)四段之前以"令人驚訝的是，發(fā)明者們……"開始的那一段(在第4 頁)，另一個優(yōu)選的修飾位于PRS序列N末端間隔l-20個氨基酸殘基處(N末 端方向上緊鄰五肽PRS序列的纈氨酸殘基的氨基酸一一在圖3-2至3-5的情 況下是亮氨酸殘基——與PRS序列的間隔是1個氨基酸殘基)，尤其是間隔 3-15個氨基酸殘基處，特別是間隔3-10個氨基酸殘基處，更加優(yōu)選間隔3-8 個氨基酸殘基處，更加優(yōu)選在間隔3個氨基酸殘基處存在堿性氨基酸殘基， 優(yōu)選賴氨酸殘基或精氨酸殘基，其中大腸桿菌宿主細(xì)胞蛋白酶在它的C末端 切割環(huán)序列。切斷之后即獲得多肽，該多肽，例如，從PRS序列的纈氨酸殘 基的N末端起具有兩個氨基酸殘基(當(dāng)以上定義的間隔是3氨基酸殘基時)。 在目前的情況下，"f務(wù)飾，，不一定意味著發(fā)生真正意義上的修飾，即氨基酸殘 基的插入或取代，而使得PRS序列的N末端在前面定義的間隔1-20個氨基 酸殘基處存在堿性氨基酸殘基(例如，賴氨酸殘基)。唯一重要的是與PRS序 列N末端具有上述間隔的地方存在堿性氨基酸殘基(例如賴氨酸殘基或精氨 酸殘基)。
依照五段之前"令人驚訝的是，發(fā)明者們……"的那一段，另一種同樣 非必需但優(yōu)選的修飾在于，被大腸桿菌宿主細(xì)胞蛋白酶切割的環(huán)序列長度為 至少9個氨基酸殘基。環(huán)序列優(yōu)選的長度是至少12、至少15、至少18、至
少20和至少23個氨基酸殘基。環(huán)序列特別優(yōu)選的長度是15-22，尤其是18-22 個氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的方法在非常一般的意義上，是一種以大腸桿菌宿主細(xì)胞中 的重組表達(dá)為手段來產(chǎn)生雙鏈形式的蛋白質(zhì)/多肽的方法，其中所述兩條鏈?zhǔn)?二硫橋連的，其中(i)所述蛋白質(zhì)/多肽作為雙鏈二硫橋連的蛋白質(zhì)/多肽發(fā)揮其 生物活性；(ii)第一鏈的C末端氨基酸殘基是Arg殘基或Lys殘基；(iii)蛋白 質(zhì)/多肽的第二鏈在一個半胱氨酸殘基的N端方向具有l(wèi)-20氨基酸殘基作為N 末端，并且具有命名為PRS五肽序列VPXGS,其中X是任何天然存在的氨 基酸，其中V是Val、 Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Pro或Gly,其中P是Pro、 Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Val或Gly，其中G是Gly、 Leu、 Ile、 Ala、 Pro、 Phe或Val, 并且其中S是Ser、 Tyr、 Trp或Thr;以及(iv)所述方法包括以下步驟(a)在 核酸水平上修飾蛋白質(zhì)/多肽，使得修飾形式的該蛋白質(zhì)/多肽在其環(huán)區(qū)域之內(nèi) 具有前述五肽序列(VPXGS); (b)在核酸水平上插入修飾的構(gòu)建體到大腸桿菌 細(xì)胞中；(c)培養(yǎng)并且隨后裂解宿主細(xì)胞；和(d)分離雙鏈蛋白質(zhì)/多肽。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)/多肽的第一鏈優(yōu)選是由相應(yīng)DNA的N末端編碼的 鏈，而蛋白質(zhì)/多肽的第二鏈因而是由相應(yīng)的DNA的C末端編碼的鏈。因為 5'-DNA-3'的表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生N-多肽-C,在前述的本發(fā)明優(yōu)選的情況下，這 意味著所述表達(dá)可如下表示5'DNA-3'表達(dá)成為N-第一多肽鏈-C-環(huán)-N-第二 多肽鏈-C。根據(jù)本發(fā)明，所述環(huán)已凈皮原位切割，因而最終本發(fā)明的多肽/蛋白 質(zhì)N-第一多肽鏈-C-N-第二多肽鏈-C以雙鏈結(jié)構(gòu)被獲得。
短語"蛋白質(zhì)/多肽的第二鏈在一個半胱氨酸殘基的N端方向具有1-20 氣基酸殘基作為N末端，并且具有命名為PRS五肽序列VPXGS"的意思是 N末端不是由例如五肽序列VPXGS的纈氨酸殘基形成，而是由其它(任何) 氨基酸殘基形成的。在后者和PRS的纈氨酸殘基之間，還可存在1-19個氨基 酸殘基，但N末端氨基酸殘基可通過肽鍵與例如所述纈氨酸殘基直接結(jié)合， 即，可以緊鄰PRS的纈氨酸殘基。
可以以它們的(生物)活性雙鏈結(jié)構(gòu)被分離的本發(fā)明的蛋白質(zhì)/多肽是這樣 的蛋白質(zhì)，其第一鏈的C末端具有;威性氨基酸殘基，尤其是Arg殘基或Lys 殘基，并且其第二鏈N末端具有1-20個氨基酸殘基以及稱為PRS的五肽序 歹'JVPXGS,其中X、 V、 P、 G和S是如上所定義。
根據(jù)本發(fā)明，例如，在基于重組蓖麻毒蛋白的免疫毒素的情況下，序列
特異蛋白酶(例如凝血酶或因子Xa)的處理對于活化而言是不必要的。例如，
在基于白喉毒素或假單胞菌毒素的免疫毒素的情況下，預(yù)期可以獲得，事實 上也獲得了顯著增加的效率，因為不再需要靶細(xì)胞蛋白酶的加工一一毒素的 酶域易位至細(xì)胞質(zhì)中的限速步驟了。已經(jīng)作為雙鏈二硫橋連的多肽存在的免 疫毒素，可以小劑量施用并且仍然提供相同的細(xì)胞毒作用。這一方面降低了 治療成本，另一方面減少了形成可能使進(jìn)一步施用該免疫毒素?zé)o效的抗體的 危險。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生雙鏈二硫橋連并由此活化免疫毒素的方法。
用本發(fā)明提供的方法還可能制備融合蛋白或雜合蛋白，即，帶有用于親 和純化的肽標(biāo)簽的雙鏈形式的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的兩條多肽鏈通過二硫鍵 共價結(jié)合，并且在親和層析或其它純化方法之后，可以用含巰基物質(zhì)(例如p-
巰基乙醇、DTT或還原谷胱甘肽)通過簡單還原作用來分離。
在大腸桿菌表達(dá)菌抹例如M15[pREP4]或BL21(DE3)中重組表達(dá)梭菌神 經(jīng)毒素和其片段(例如，梭菌神經(jīng)毒素的LHn片段或衍生物，例如具有修飾的 細(xì)胞特異性)，產(chǎn)生單鏈多肽。通過用胰島素處理這些多肽，在蛋白酶域到易 位域的過渡區(qū)域的環(huán)序列區(qū)域中發(fā)生切割。因為胰島素不是序列特異蛋白酶， 在多肽的其它區(qū)域可能發(fā)生切割(通常是不希望的)。例如，BoNT(A)被胰島素 額外地在Hn和Hc之間切割，因而產(chǎn)生雙鏈LHN片段和Hc片段。為了保證 大多數(shù)情況下理想的、發(fā)生在環(huán)區(qū)域中的選擇性切割，特異性內(nèi)切蛋白酶的 識別序列的存在(可選地，在發(fā)生插入之后)是必需的。
利用序列特異內(nèi)切蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、 genenase等切割重組融 合蛋白/雜合蛋白，屬于公知的各種方法的范圍。純化之后，可分離融合配偶 體，其賦予重組蛋白/多肽更好的可溶性和/或更好的表達(dá)，或充當(dāng)用于親和純 化的肽標(biāo)簽。為了這種目的，將蛋白質(zhì)溶液與合適的可溶形式或在基質(zhì)上固 定形式的內(nèi)切蛋白酶一起溫育。
這種技術(shù)也可以用于表達(dá)前述重組蛋白/多肽，它們作為雙鏈蛋白質(zhì)/多肽 發(fā)揮它們的正常生物/生化活性，但利用重組DNA技術(shù)獲得它們時是無活性 的單鏈蛋白質(zhì)/多肽(例如，表達(dá)梭菌神經(jīng)毒素、梭菌神經(jīng)毒素的片段例如LHn 片段、或梭菌神經(jīng)毒素的衍生物，例如細(xì)胞特異性被修飾的衍生物)將內(nèi)切 蛋白酶的識別序列克隆到多肽中，優(yōu)選在核酸水平克隆，例如克隆到L和Hn 之間的環(huán)區(qū)域中；此外，將另一個相同或另外的內(nèi)切蛋白酶的識別序列克隆 至N末端或C末端，使其兩側(cè)與用于親和純化的肽標(biāo)簽鄰接。隨后用相應(yīng)的
內(nèi)切蛋白酶處理或多種內(nèi)切蛋白酶同時或連續(xù)地處理被表達(dá)的單鏈蛋白質(zhì)/ 多肽，在環(huán)區(qū)域的L和HN之間切割來加以活化，并去除肽標(biāo)簽。
這樣的內(nèi)切蛋白酶除了使用的成本和由此所需的額外工作步驟的成本之 外，由于制藥法律(受規(guī)章限制的)方面的原因，它們在藥物制劑(例如，使用 重組肉毒桿菌毒素或其衍生物)中的使用問題重重。 一方面，所使用的內(nèi)切蛋 白酶的純度必需是經(jīng)實驗證實的，而另一方面，完全的去除以及制劑的無病
毒性在進(jìn)一步純化流程期間必需得到證明；這通常需要巨大的分析費用。由
于將來肉毒桿菌毒素(例如具有性質(zhì)改良的或細(xì)胞特異性被修飾的肉毒桿菌 毒素)同樣將由重組表達(dá)產(chǎn)生，因此人們非常需要這樣的表達(dá)方法，可以提供
前文所述的、作為雙鏈蛋白質(zhì)/多肽發(fā)揮正常生物/生化活性，但通過重組DNA 技術(shù)獲取時以無活性的單鏈蛋白質(zhì)/多肽形式存在的重組蛋白質(zhì)/多肽，特別 地，該方法可提供這樣的肉毒桿菌毒素或其衍生物，它們是雙鏈二硫橋連的、 因此具有生物活性的多肽/蛋白質(zhì)，而不必要使用內(nèi)切蛋白酶。
在下文中將更具體地解釋本發(fā)明，因而最廣義地提供一種方法，使用該 方法能夠通過在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)例如梭菌神經(jīng)毒 素以及其片段和衍生物，并且能夠以它們的雙鏈二疏橋連的并且因此是生物 活性的形式分離，它們的活化不需要添加內(nèi)切蛋白酶。
在本發(fā)明的第一個優(yōu)選實施方案中，BoNT(A)半胱氨酸殘基430和454 之間的環(huán)區(qū)域的氨基酸序列(參見圖3-1至3-5)已被修飾，因而在大腸桿菌宿 主細(xì)胞的裂解物中表達(dá)的毒素或其片萃i/衍生物已作為雙鏈多肽存在。所述兩 條鏈由半胱氨酸殘基430和454參與形成二硫鍵而彼此共價結(jié)合。在本發(fā)明 特別優(yōu)選的實施方案中，如圖3所說明的，五肽Asp443 -Asri447 (DKGYN)可以 用Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS)來取代。在本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施方案中， 該五肽Asp443 - Asn447 (DKGYN)還可以用Val-Pro陽Tyr-Gly-Ser (VPYGS)、 Val-Pro-His-Gly-Ser (VPHGS)或Val-Pro-Gln-Gly-Ser (VPQGS)來取代。在這里， 同樣地，不僅中央氨基酸殘基可以是任何天然存在的氨基酸，另外四個氨基 酸殘基也可以被替換，如在前文中詳細(xì)說明的(當(dāng)替換這些殘基的至少一個 時，即出現(xiàn)本發(fā)明意義上的PRS序列變體)。此外，對該實施方案以及所有其 它在下文中將解釋的優(yōu)選實施方案而言仍然優(yōu)選的是，環(huán)序列在PRS的N端 方向間隔1-28個氨基酸處具有堿性氨基酸殘基，特別是賴氨酸或精氨酸殘基。
對于本領(lǐng)域^技術(shù)人員顯而易見的是，替換其它的單個或幾個氨基酸殘基，
或在上面描述的BoNT(A)環(huán)區(qū)域中插入或缺失另外的氨基酸殘基，同樣會導(dǎo)
致被表達(dá)的本發(fā)明的毒素或源自它們的片段/衍生物在裂解物中作為雙鏈多 肽存在。這些可能的變體同樣被本發(fā)明所涵蓋。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣顯而易見的是，存在于野生型BoNT(A)中的五 肽Asp443 - Asn447 (DKGYN)可以用六肽，七肽、八肽等取代，只要在被表達(dá)和 單鏈翻譯的多肽/蛋白質(zhì)中，該PRS五肽序列或其可能的變體之一存在于環(huán)區(qū) 域之內(nèi)。如上文中已說明的，優(yōu)選該五肽的N末端存在堿性氨基酸殘基(優(yōu)選 賴氨酸)。
此外對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，PRS五肽(Val-Pro-Arg-Gly-Ser) 的優(yōu)選實施方案是蛋白酶凝血酶可能的識別序列的一部分，凝血酶在凝血級 聯(lián)中扮演重要角色并且具有高度的序列特異性。需要明確地指出，首先，不 管是在肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型中還是在其它多肽中，凝血酶切割均不是為了 獲得所需雙鏈二硫橋連形式必需的，其次，凝血酶識別序列本身，即其未修 飾形式，對于借助大腸桿菌裂解物蛋白酶活性的切割是有益的，但完全不是 必需的。這樣的PRS五肽序列的實施方案一一PRS五肽序列插入到或產(chǎn)生在 相應(yīng)的多肽中(更佳在它們的環(huán)中)，而該多肽不含C末端能被凝血酶切割 的精氨酸殘基(而是存在另一種天然存在的氨基酸)一一也導(dǎo)致在環(huán)中發(fā)生切 割，如上文說明的。如上所述，優(yōu)選在五肽的N端方向、環(huán)中的賴氨酸殘基 處實現(xiàn)切割(同樣參見實施例2;圖3)。
由于肉毒桿菌毒素的其它血清型，例如作為長效神經(jīng)毒素的BoNT(B)和 BoNT(Cl)和作為短效神經(jīng)毒素的BoNT(E)可用于治療，而且完全不同的、可 作為單鏈重組表達(dá)但僅作為雙鏈發(fā)揮其生物活性的多肽/蛋白質(zhì)也可在治療 上使用，因此，理想地，這些神經(jīng)毒素以及它們的片段或衍生物(以及其它多 肽/蛋白質(zhì))也能夠作為雙鏈二硫鍵多肽/蛋白質(zhì)從大腸桿菌裂解物獲得。特別 地，在BoNT(B)的情況下，在大腸桿菌裂解物中完全切割重組毒素成為雙鏈 多肽/蛋白質(zhì)，與肉毒梭菌(C7o^nWww 60^//"ww)分泌的天然神經(jīng)毒素相比有 顯著的優(yōu)勢；該天然神經(jīng)毒素通常有至少40%作為單鏈存在且因此是失活的 多肽，并且不能與活性的雙鏈形式分離。同樣顯而易見的是，血清型B、 Cl 和E神經(jīng)毒素中參與二硫鍵的半胱氨酸殘基之間的環(huán)區(qū)域，相對于BoNT(A) 的環(huán)而言顯著較短(圖3和4)。在BoNT(A)中存在23個氨基酸殘基(Valm -Leu粉),而在BoNT(B)中僅8個(Lys438 -Ile445)，在BoNT(Cl)中15個(His"8-
Asp452)，在BoNT(E)中有13個氨基酸殘基(Lys4n-Ile425)存在于該區(qū)域中。盡 管如此，發(fā)現(xiàn)除BoNT(B)之外，當(dāng)這些相對縮短的區(qū)域具有根據(jù)本發(fā)明的PRS 序列時，它們的長度足以使鏈的切割和二硫鍵形成成為可能。盡管BoNT(B) 環(huán)中的五肽被替換為PRS五肽序列時(這樣環(huán)序列的全長僅8個氨基酸殘基)， BoNT(B)被切割成符合本發(fā)明含義的兩條鏈(輕的和重的)，但是，當(dāng)環(huán)是至少 9個、至少15個、至少20個或甚至至少22個氨基酸殘基時，獲得了更好的 結(jié)果，也就是說依照本發(fā)明這是優(yōu)選的。最后提到的實施方案之一中，所述 環(huán)具有22個氨基酸殘基，圖4-1和4-2的序列或二者之間的比較，對該實施 方案作了示例性的說明。
還通過實驗證實，對于將神經(jīng)毒素切割成二硫橋連的雙鏈多肽/蛋白質(zhì)而 言，優(yōu)選將亞型B、 Cl等等中的環(huán)區(qū)域或它們的有效部分替換為BoNT(A) 的環(huán)區(qū)域或它們的有效部分，尤其是當(dāng)以這種方式環(huán)被延伸到至少9個、優(yōu) 選15個殘基時，和/或當(dāng)PRS的N末端插入了堿性氨基酸殘基時(例如且優(yōu)選 Lys殘基)(如果先前無N末端堿性或Lys殘基存在的話)。特別優(yōu)選的是圖4 所示的變化(其中圖4中的PRS序列是VPRGS,但同時并且優(yōu)選也是序列 VPYGS、 VPHGS、 VPQGS、 VPKGS、 VPIGS和VPAGS)。
在本發(fā)明的其它實施方案中，將血清型B、 Cl、 D、 E、 F和G肉毒桿菌 毒素以及破傷風(fēng)毒素中環(huán)區(qū)域的氨基酸序列和編碼基因部分在參與L和HN 之間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間修飾，使得大腸桿菌宿主細(xì)胞裂解物中表達(dá) 的毒素或源自它們的片段/衍生物已經(jīng)作為雙鏈多肽存在，該雙鏈多肽中兩條 鏈通過二硫鍵共價結(jié)合(對任何通過重組表達(dá)作為單鏈產(chǎn)生但僅以雙鏈形式
展現(xiàn)生物活性的其它多肽/蛋白質(zhì)也是如此)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，神 經(jīng)毒素的完整環(huán)區(qū)域(或其部分)，或源自它們的毒素片段/衍生物，可以替換 為BoNT(A)的完整環(huán)區(qū)域，如圖3所示，或替換為BoNT(A)環(huán)區(qū)域的部分， 其中優(yōu)選將五肽Asp443 - Asn447替換為Val-Pro-Arg-Gly-Ser (VPRGS)。在本發(fā) 明另外的優(yōu)選實施方案中，還可以將五肽Asp443 - Asri447替換為Val-Pro Tyr-Gly-Ser、 Val-Pro-His-Gly-Ser或Val-Pro-Gln-Gly-Ser。在本發(fā)明的特別優(yōu) 選實施方案中，前述神經(jīng)毒素的環(huán)區(qū)域或環(huán)區(qū)域的部分，以及源自它們的片 段/衍生物，可以被替換為寡肽Arg/Ser-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro畫Arg畫Gly-Ser-Lys-Ala(18聚體R/SGIITSKTKSLVPRGSKA)。如果 在上述環(huán)序列的區(qū)域中進(jìn)一步替換、插入或缺失單個或幾個氨基酸殘基，如
圖4所示，也導(dǎo)致在大腸桿菌(例如，在大腸桿菌K12宿主細(xì)胞或其衍生物)
中表達(dá)之后，被表達(dá)的神經(jīng)毒素或其片段/衍生物成為二硫橋連的雙鏈多肽/ 蛋白質(zhì)，這樣的替換、插入或缺失明確地包含于本發(fā)明中(對任何能夠通過重
如此)。
如上文中反復(fù)重申的，用根據(jù)本發(fā)明的方法或根據(jù)本發(fā)明另外的實施方
案的方法，還可以產(chǎn)生融合蛋白或雜合蛋白，其具有，例如，以下成分A、 B 和C:
-效應(yīng)物域，通過其酶活性，能夠例如抑制靶細(xì)胞中的分泌或殺死它們
(A);
-環(huán)序列，其被根據(jù)本發(fā)明如上的說明修飾，且具有如上定義的PRS五 肽序列VPXGS (例如，如圖3所示的BoNT(A)的^f'務(wù)飾環(huán)序列或其變體)，并且 可具有N末端和/或C末端附著的半胱氨酸殘基(B);以及
-細(xì)胞結(jié)合域，其賦予融合蛋白或雜合蛋白以細(xì)胞特異性(C)。 成分B (環(huán)序列)在前兩個實施方案中也同樣可優(yōu)選為(i)如圖4所示的 修飾的環(huán)序列，(ii)在PRS的中央殘基可以是任何天然存在氨基酸的殘基的 范圍內(nèi)，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的變體(變體的定義見上)。在圖4
一或兩個氨基酸殘基以外的部分，并且缺失的氨基酸殘基被BoNT(A)的修飾 環(huán)序列的17聚體GIITSKTKSLVPRGSKA (圖4-2和4-6)或18聚體 RGIITSKTKSLVPRGSKA(圖4-4)所取代。
除了前述的成分A、 B和C，融合/雜合蛋白可具有翻譯域(在肉毒桿菌神 經(jīng)毒素中位于環(huán)序列和細(xì)胞結(jié)合域之間)。這種額外的域協(xié)助效應(yīng)物域插入靶 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這種融合蛋白在大腸桿菌(例如，大腸桿菌K12或其衍生菌林) 中的表達(dá)產(chǎn)生這樣的雙鏈多肽/蛋白質(zhì)，其中一個域在一條鏈上，而其它兩個 域在第二條鏈上(在肉毒桿菌毒素中，效應(yīng)物域在輕鏈上，其通過二硫鍵與在 重鏈上的其它兩個域共價結(jié)合)。
這些本發(fā)明的融合或雜合蛋白可以是所謂的免疫毒素，它們尤其在腫瘤 治療中有用處。在這種背景下，通過使細(xì)胞結(jié)合域附著于毒素，而賦予毒素 對于某種細(xì)胞類型(通常為腫瘤細(xì)胞)的特異性。作為毒素結(jié)合域，主要使用白 喉毒素、假單胞菌毒素和蓖麻毒蛋白的酶域。這些毒素屬于雙鏈AB毒素，
其中提供酶活性的A鏈通過二硫鍵共價結(jié)合于兼有易位活性和細(xì)胞結(jié)合活性 的B鏈。然而，在靶細(xì)胞中產(chǎn)生期望的作用(例如，腫瘤細(xì)胞的殺滅)的范圍 內(nèi)，免疫毒素中其它的毒素或毒素片段是可以想到的。第一代免疫毒素是將 毒素域(例如蓖麻毒蛋白的A鏈)與單克隆抗體化學(xué)偶聯(lián)而產(chǎn)生的，第二代免
疫毒素是通過重組表達(dá)(主要是在大腸桿菌中)作為Fab毒素、單鏈Fv毒素 (scFv毒素)或二石危鍵穩(wěn)定化Fv (dsFv毒素)，以及作為與生長因子或細(xì)胞因子 的融合蛋白產(chǎn)生的(Reiter,2001)。在將來各代免疫毒素中，還可以由經(jīng)過選擇 的修飾多肽來賦予細(xì)胞特異性，該多肽是根據(jù)，例如，與胂瘤特異表面蛋白(如 affilins 、錨蛋白重復(fù)蛋白或anticalins蛋白家族的蛋白)的高親和力結(jié)合而選擇 的。
在免疫毒素所有可以想到的變體中，必須保證酶性毒素域能夠進(jìn)入靶細(xì) 胞的細(xì)胞質(zhì)以在其中發(fā)生毒性作用。因為在大腸桿菌中免疫毒素作為單鏈多 肽表達(dá)，蛋白水解切割以及二硫鍵的還原對于將酶性毒素域與易位單位和細(xì) 胞結(jié)合域分離(對于鏈而言)是必需的。在重組白喉毒素片段和重組假單胞菌外 毒素片段的情況下，切割于內(nèi)在化之后在靶細(xì)胞的內(nèi)體區(qū)室中通過細(xì)胞蛋白 酶例如弗林蛋白酶發(fā)生(Williamsetal., 1990)。另一方面，蓖麻毒蛋白不具有 這樣的加工位點，因此，為了作為已經(jīng)雙鏈二硫橋連的免疫毒素施用，其需 要人工插入的蛋白酶識別序列。然而，在基于白喉毒素和假單胞菌外毒素的 免疫毒素的情況下，內(nèi)在化融合蛋白只有最小一部分被切割，因而同樣只有 最小一部分酶域能夠到達(dá)細(xì)胞質(zhì)(Ogata et al., 1990)。下述本發(fā)明的優(yōu)選實施 方案描述了多種方法和構(gòu)建體，依靠這些方法，通過在大腸桿菌宿主細(xì)胞中 重組表達(dá)產(chǎn)生如前面段落中所述的免疫毒素的變體，并且這些變體能夠以它 們的雙鏈二硫橋連的從而具有生物(斷足)活性的形式被分離，它們的活化不需 要細(xì)胞內(nèi)切蛋白酶或體外添加內(nèi)切蛋白酶。這些免疫毒素能夠?qū)⒚感远舅赜?以具有易位能力(translocation competent)的形式轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞中，因而不需要 細(xì)胞蛋白酶的切割，并且為了達(dá)到期望的細(xì)胞毒性效應(yīng)而使用的免疫毒素劑 量可以顯著降低。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施方案進(jìn)一步包含融合蛋白和雜合蛋白， 其具有以下成分A、 B和C:
畫毒素域或其片段/衍生物(A);
畫環(huán)序列，其根據(jù)本發(fā)明如上所述被修飾，并具有如上定義的PRS五肽
序列VPXGS(例如，示于圖3的BoNT(A)的修飾的環(huán)序列或其變體之一)，并 且可能已于N末端和/或C末端附著有半胱氨酸殘基(B);以及
-細(xì)胞結(jié)合域，其可以取自下列蛋白家族中的代表單克隆抗體蛋白、 它們的片段、affilins、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalins、生長因子(例如，TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1)或細(xì)胞因子(例如，IL2、 IL4或IL6) (C)。
依照最后的這種優(yōu)選實施方案，成分B(環(huán)序列)同樣可以是(i)圖4所示的 修飾的環(huán)序列之一，(ii)在PRS的中央殘基可以是任何天然存在氨基酸的殘基 的范圍內(nèi)，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的變體(變體的定義見上)。
毒素域可以是蓖麻毒蛋白的A鏈、假單胞菌外毒素的片段例如PE40或 PE38(域II和in,具有或不具有域Ib;圖2)或白喉毒素的片段。前述效應(yīng)物 域或毒素域和細(xì)胞結(jié)合域應(yīng)僅僅理解為示例。本發(fā)明涵蓋所有如下所述的蛋 白質(zhì)或蛋白片段 一方面，其賦予融合蛋白/雜合蛋白對靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞) 表面抗原的特異性結(jié)合活性，另一方面，其在靶細(xì)胞中內(nèi)在化之后發(fā)揮某種 作用，例如殺死該細(xì)胞，其中在大腸桿菌中表達(dá)這種根據(jù)本發(fā)明的融合/雜合 蛋白產(chǎn)生雙鏈多肽/蛋白質(zhì)，在這些雙鏈多肽/蛋白質(zhì)中毒素域或它們的衍生物 通過二硫鍵共價結(jié)合于細(xì)胞結(jié)合域。
為了改善基于假單胞菌外毒素的免疫毒素的效率和特異性，曾經(jīng)選擇過 不同的方法。例如，曾將受體結(jié)合域(域Ia氨基酸殘基l-152)替換為單克隆抗 體的片段，并且同時將易位域(域II)中半胱氨酸殘基13和35(相對于域n編 號)之間的環(huán)區(qū)域(圖2和5)修飾，使得后者對普遍存在的細(xì)胞蛋白酶——福 林蛋白酶的切割不再敏感，但對僅被某種腫瘤細(xì)胞以較強的程度表達(dá)并部分 分泌的特殊蛋白酶的切割敏感(美國專利6，426，075)。設(shè)計這種修飾的蛋白酶 敏感性，是為了在替換的受體結(jié)合域之外進(jìn)一步賦予免疫毒素增加的細(xì)胞特 異性。然而，不應(yīng)期望利用其它細(xì)胞蛋白酶可導(dǎo)致環(huán)切割的增加并因此提高 酶域III的易位效率。
根據(jù)另一種用于免疫毒素的方法，將受體結(jié)合域和易位域的N末端區(qū)域 去除，直到環(huán)區(qū)域中的精氨酸殘基27為止。通過下述手段提供這種免疫毒素 中所需的細(xì)胞特異性例如，通過在域II和III之間的Ib域處，插入以二硫 鍵相互結(jié)合的單克隆抗體Vh域和Vl域；或通過附加域III的C末端(美國專 利5,980,895)。在這種構(gòu)建體中，通過蛋白酶的活化不再是必需的； 一方面， 這將導(dǎo)致轉(zhuǎn)運效率顯著增加。然而，另一方面可以預(yù)期，依靠位于酶域m的
N末端或C末端的受體結(jié)合域(如單克隆抗體或TGF-alpha的Vh域)的易位將 被阻礙。因為這些受體結(jié)合域未與酶域分離，可以預(yù)期會影響酶活性，從而 影響靶細(xì)胞中的毒性。下面兩種情況下，基于假單胞菌外毒素的免疫毒素產(chǎn) 生相對最大程度的細(xì)胞毒素活性 一方面，半胱氨酸殘基13和35之間的環(huán) 已經(jīng)以被切割的二硫橋連形式存在，從而不再需要細(xì)胞蛋白酶的活化；另一 方面，受體結(jié)合域取代外毒素的域I而融合于易位域的N末端，使得在細(xì)胞 質(zhì)中還原之后其與毒素域分離，從而不阻礙域III的酶活性。
因此，本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案包括一種融合/雜合蛋白，其包含 細(xì)胞結(jié)合域，該細(xì)胞結(jié)合域可取自以下蛋白家族的代表單克隆抗體、它們 的片段、affilins、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalins、生長因子(例如，TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1)或細(xì)胞因子(例如，IL2、 IL4和IL6),細(xì)胞結(jié)合域的C 末端融合修飾的PE38片段或其變體，該片段能夠在C終端攜帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留 信號Lys-Asp-Gly-Leu。 PE38片段的修飾包含將半胱氨酸殘基13和35之間 的完整環(huán)序列(或僅其部分)替換為PRS五肽序列VPXGS,優(yōu)選替換為圖3所 示的BoNT(A)的修飾的環(huán)序列或其變體，特別是替換為肽序列Arg-Gly-Ile-Ile-Thr腸Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val畫Pro畫Arg-Gly-Ser-Lys-Ala (圖5)(變體的定義 見上)。優(yōu)選的，在這個實施方案中，還保證有堿性氨基酸位于PRS的N端 方向間隔l-20個氨基酸處，如圖5的序列中所示。如此修飾的PE38片段以 及含有這種修飾片段的融合/雜合蛋白以雙鏈二硫橋連形式存在于大腸桿菌 宿主細(xì)胞(例如，Ml 5 [pREP4])的裂解物中。
和假單胞菌外毒素相反，白喉毒素的酶域一一A鏈存在于N末端。在C 末端的B鏈上有易位域和受體結(jié)合域。兩條鏈均通過環(huán)序列連接，當(dāng)被白喉 棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)的細(xì)月包分泌時，在所述環(huán)序列中精氨酸殘 基193處由蛋白酶進(jìn)行蛋白水解切割(Collier, 2001)。切割后，兩條鏈通過半 胱氨酸殘基186和201之間的二硫鍵保持彼此共價結(jié)合。在這點上，白喉毒 素在其域結(jié)構(gòu)上與肉毒桿菌毒素和破傷風(fēng)毒素相似。
為了產(chǎn)生重組免疫毒素，將受體結(jié)合域或其部分替換為例如VEGF或IL2 (Arora e al.， 1999; Williams et al.， 1990)以賦予融合蛋白新的細(xì)胞特異性。為了 使A鏈到達(dá)靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)， 一方面，在大腸桿菌中作為單鏈表達(dá)的免疫毒 素的多肽鏈必須在A鏈和B鏈的環(huán)區(qū)域之間切割，而另一方面，必須將二硫 鍵還原。雖然后者在易位過程中發(fā)生，但細(xì)胞蛋白酶的蛋白水解切割是不完
全的，因而僅有最小部分的A鏈的能夠釋放至細(xì)胞質(zhì)中(Williams etal.， 1990)。 如果免疫毒素在施用時已經(jīng)以雙鏈二硫橋連的形式存在，則可望顯著地增加 功效，因為所有A鏈都可成為具有易位能力的形式以供^f吏用。
因此，本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選實施方案包含這樣的融合或雜合蛋白， 其包含細(xì)胞結(jié)合域，該細(xì)胞結(jié)合域可取自以下的蛋白家族的代表單克隆抗 體、它們的片段、affilins、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalins、生長因子(例如， TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1)或細(xì)胞因子(例如，IL2、 IL4和IL6);所述 細(xì)胞結(jié)合域的N末端融合了修飾的白喉毒素片段。此毒素片段可包含A鏈以 及B鏈的至少一個易位域(Gly！ -Phe鄉(xiāng)或Glyi - Asru86)。.白喉毒素片段的修飾 在于半胱氨酸殘基186和201之間的完整環(huán)序列(或僅其部分)被替換為圖3 所示的修飾的環(huán)序列或其變體，尤其是替換為肽序列Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr誦Lys-Ser-Leu-Val-Pro國Arg-Gly-Ser匿Lys-Ala(圖5)(變體的定義見上)。這 樣修飾的白喉毒素片段，以及含有這種修飾片段的融合蛋白，均以雙鏈二硫 橋連的形式存在于大腸桿菌宿主細(xì)胞(例如M15[pREP4])的裂解物中。
第一代基于蓖麻毒蛋白的免疫毒素是通過連接蓖麻毒蛋白的A鏈和單克 隆抗體而產(chǎn)生。過去這是通過具有化學(xué)接頭分子的抗體衍生化完成的，其中 所述接頭分子與位于A鏈C末端的半胱氨酸殘基的巰基官能團形成二硫鍵。 由于抗體的非定向衍生化，這種偶聯(lián)物是不均一的?？鼓[瘤效率不足，很重 要的原因是偶聯(lián)物的大小，以及缺乏位于B鏈的易位域。當(dāng)還存在天然形式 的B鏈作為免疫毒素的成分時，毒性將顯著增加，但是由于B鏈的凝集素樣 細(xì)胞結(jié)合性，被靶細(xì)胞之外的細(xì)胞非特異性地攝入也是有可能發(fā)生的。人們 使用了這樣一種策略來應(yīng)對這種靶標(biāo)沖突(target conflict):根據(jù)該策略，對B 鏈進(jìn)行修飾，使得易位活性保持完整而對細(xì)胞表面糖結(jié)構(gòu)的結(jié)合親和性卻顯 著降低(專利申請WO 89/04839)。然而，含有這種修飾的B鏈的重組表達(dá)免 疫毒素具有單鏈結(jié)構(gòu)，因此，由于A鏈和B鏈之間的接頭肽中缺乏細(xì)胞蛋白 酶識別序列，在免疫毒素被攝入靶細(xì)胞后A鏈的釋放和易位完全不可能發(fā)生， 或僅可能以極低的效率發(fā)生。美國專利6,593,132中顯示，這種天然接頭肽是 不同細(xì)胞特異蛋白酶的識別序列。如果能以蛋白水解方式切割修飾的接頭肽 的蛋白酶僅在期望的靶細(xì)胞中以顯著高于其它細(xì)胞類型的量表達(dá)，具有這種 修飾的蓖麻毒蛋白變體可具有相應(yīng)的細(xì)胞特異性。然而，必需假設(shè)切割僅在 一部分內(nèi)在化的毒素分子中發(fā)生，并且因此僅相應(yīng)的最小量的A鏈易位到細(xì)
胞質(zhì)中。理想的基于蓖麻毒蛋白的雙鏈免疫毒素是這樣的其中，A鏈通過 二硫鍵與修飾的B鏈連接，B鏈中易位活性保持完整，但非特異性凝集素樣 細(xì)胞結(jié)合性被抑制；并且在它們的C末端與特異細(xì)胞結(jié)合域融合。這種免疫 毒素將兼具細(xì)胞特異性和高毒性。
因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案包含這樣的融合蛋白，其具有以下 成分A、 B和C:
-蓖麻毒蛋白的A鏈(A);
畫環(huán)序列，其根據(jù)本發(fā)明如上所述被修飾，并且具有如上定義的PRS五 肽序列VPXGS (例如，示于圖3的BoNT(a)的環(huán)序列或其變體之一)，并且在 N末端和/或C末端可能附著有半胱氨酸殘基(B);以及
-細(xì)胞結(jié)合域，其可取自以下蛋白家族的代表單克隆抗體、它們的片 段、affilins、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalins、生長因子(例如，TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1)或細(xì)胞因子(例如，IL2、 IL4和IL6) (C)。
才艮據(jù)最后的優(yōu)選實施方案的成分B也可以是(i)圖4所示f務(wù)飾的環(huán)序列之 一，(ii)在PRS的中央殘基能夠是任何天然存在氨基酸的殘基的范圍內(nèi)，任 何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的變體(變體的定義見上)。
具體而言，環(huán)序列可含有肽序列Ala-Pro-Pro-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys扁Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Asp-Val (圖5誦6)，即，修飾 的蓖麻毒蛋白A鏈的環(huán)。優(yōu)選在環(huán)序列的C末端具有半胱氨酸殘基。但在其 中所含的Val-Pro-Arg-Gly-Ser的PRS序歹'j中，Arg可以是任何其它天然存在 的氨基酸Xaa。環(huán)序列還可以被更多的氨基酸殘基(例如，甘氨酸和絲氨酸殘 基)所擴展。此外，蓖麻毒蛋白的A鏈可以通過環(huán)序列與完整的B鏈或其部 分或變體連接，該環(huán)序列取代蓖麻毒蛋白原野生型序列半胱氨酸殘基259和 283之間的全部或部分氨基酸殘基，并且至少包含圖3所述的修飾的BoNT(A) 的環(huán)或其變體。在此情況下，半胱氨酸殘基259和283 (相對于蓖麻毒蛋白原 (proricin))形成二硫鍵。B鏈的C末端融合了細(xì)胞結(jié)合域，該細(xì)胞結(jié)合域取自 上述多肽家族。相應(yīng)的融合/雜合蛋白以雙鏈二硫橋連的形式存在于大腸桿菌 宿主細(xì)胞(例如菌抹M15[pREP4]的細(xì)胞)的裂解物中。
本發(fā)明的另 一個實施方案涉及重組融合蛋白，其具有以下成分A、B和C:
-蛋白質(zhì)或寡肽，其賦予融合蛋白更好的可溶性，實現(xiàn)較高的表達(dá)率和/ 或使親和純化成為可能，(例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白
(MBP)、 His標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽(A)。
畫環(huán)序列，其根據(jù)本發(fā)明如上所述被修飾，該環(huán)序列包含如上定義的PRS 五肽序列VPXGS (例如，如圖3所示的BoNT(A)修飾的環(huán)序列或其變體)，并 且可能具有附著于N末端和/或C末端的半胱氨酸殘基，以及
-任何類型的多肽(C)。
依照此最后優(yōu)選序列的成分B (環(huán)序列)同樣可以是(i)如圖4所示修飾的 環(huán)序列之一，(ii)在PRS的中央殘基可以是任何天然存在的氨基酸殘基的范 圍內(nèi)，任何源自(i)的序列，或(iii)(i)或(ii)的變體(變體的定義如上所示)。
具體而言，環(huán)可以具有肽序列Val-Arg-Gly-Ile-Ile-Thr-Ser-Lys-Thr-Lys-Ser-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Lys-Ala-Leu-Asn-Asp-Leu,其中在PRS中央的Arg 仍然可以是Xaa。其在兩端均可被更多的氨基酸殘基(例如，甘氨酸和絲氨酸 殘基)延伸。這種融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生雙鏈多肽/蛋白質(zhì)，這些多 肽/蛋白質(zhì)的兩條鏈通過二疏鍵共價結(jié)合，并且在完全純化之后，可以在不添 加蛋白酶的條件下，直接由含巰基物質(zhì)(例如J3-巰基乙醇、DTT或還原谷胱甘 肽)還原后彼此分離。這種表達(dá)系統(tǒng)尤其適合于這樣的蛋白其要在兩個末端 之一提供半胱氨酸殘基，以便在純化和分離帶有反應(yīng)性巰基基團的融合配偶 體之后，提供用來例如與巰基反應(yīng)性接頭分子偶聯(lián)反應(yīng)或供例如聚乙二醇修 飾的位點。
此外本發(fā)明包含編碼根據(jù)本發(fā)明前面部分所述多肽的所有核酸，并考慮 到密碼子使用的不同可能性。此外，本發(fā)明包含商業(yè)上可以獲得的或單獨構(gòu) 建的克隆和表達(dá)質(zhì)粒，其含有根據(jù)本發(fā)明的各種多肽的編碼DNA序列；以及 合適的大腸桿菌克隆和表達(dá)菌抹，其用相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并且能夠以其雙 鏈二疏橋連形式表達(dá)各種根據(jù)本發(fā)明的多肽。這種表達(dá)系統(tǒng)的一個實例是 pQE系列的表達(dá)質(zhì)粒和大腸桿菌宿主菌林M15[pREP4]的組合。
對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員，尤其是從事藥用多肽/蛋白質(zhì)開發(fā)的技術(shù)人員 而言，這些多肽/蛋白質(zhì)的活化不必添加內(nèi)切蛋白酶的優(yōu)勢是顯而易見的。前 面部分描述的根據(jù)本發(fā)明多肽/蛋白質(zhì)大多是特別以藥用為目標(biāo)的。因此本發(fā) 明還包含藥物制劑，其包含本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)之一或本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì) 的混合物作為有效成分，以及賦予該制劑足夠穩(wěn)定性的有用添加劑；并且其 組成與其期望的施用形式相匹配。
所附的附圖和序列表序列如下所述


圖1顯示從肉毒桿菌或大腸桿菌K12釋放具有野生型環(huán)或4艮據(jù)本發(fā)明的
修飾環(huán)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型的示意圖。A:在肉毒桿菌細(xì)胞的裂解中， 神經(jīng)毒素在輕鏈(L)和重鏈(H)之間的環(huán)區(qū)域中被梭菌內(nèi)切蛋白酶切割。兩條鏈 均通過二硫鍵彼此相連。B:具有野生型環(huán)的重組神經(jīng)毒素在大腸桿菌中表達(dá) 并裂解細(xì)胞之后，其以單鏈形式存在。C:當(dāng)具有根據(jù)本發(fā)明修飾的環(huán)的重組 神經(jīng)毒素從大腸桿菌細(xì)胞釋放時，內(nèi)切蛋白酶在環(huán)區(qū)域中切割。
毒素從大腸桿菌細(xì)胞釋放之后的示意圖。A:肉毒桿菌神經(jīng)毒素；B:假單胞 菌外毒素；C:白喉毒素。
圖示為核香酸序列和衍生的氨基酸序列，其包含輕鏈和重鏈的限定性半胱氨 酸殘基。箭頭標(biāo)注大腸桿菌裂解物中內(nèi)切蛋白酶的切割位點。
圖4分別顯示肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型B、 Cl和E的野生型環(huán)和才艮據(jù)本 發(fā)明修飾的示例環(huán)序列的比較。圖示為核苷酸序列和衍生的氨基酸序列，其 包含輕鏈和重鏈的限定性半胱氨酸殘基。箭頭標(biāo)注大腸桿菌裂解物中內(nèi)切蛋 白酶的切割位點。
圖5分別顯示假單胞菌外毒素片段PE40、白喉毒素(DT)和蓖麻毒蛋白的 野生型環(huán)和根據(jù)本發(fā)明修飾的示例環(huán)序列的比較。圖示為核苷酸序列和衍生 的氨基酸序列，其包含限定性半胱氨酸殘基。箭頭標(biāo)注大腸桿菌裂解物中內(nèi) 切蛋白酶的切割位置。
圖6顯示用于克隆重組毒素和毒素片段的寡核苷酸的組合。限制性內(nèi)切 酶的識別序列以下劃線標(biāo)記。
圖7顯示具有根據(jù)本發(fā)明修飾的環(huán)序列的BoNT(A)重組LHN片段在SDS 聚丙烯酰胺凝膠上的分析。LHN片段的表達(dá)在M15[pREP4]細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì) 胞被質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm州HN轉(zhuǎn)化。泳道2和5:在Ni-NTA瓊脂糖上純化 的LHn片段；泳道1和4:同凝血酶一起溫育之后的LHN片段；泳道3:分 子量標(biāo)記。上樣在還原條件(泳道1和2)和非還原條件下(泳道4和5)。
圖8顯示具有根據(jù)本發(fā)明修飾的環(huán)序列的BoNT(B)重組LHN片段在SDS 聚丙烯酰胺凝膠上的分析。LHN片段的表達(dá)在M15[pREP4]細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì) 胞^C^粒pQE-BoNT(B)-Lm。d,HN轉(zhuǎn)化。泳道1和4:在Ni-NTA瓊脂糖上純化 的片段LHn;泳道2:分子量標(biāo)記；泳道3:無上樣。上樣在還原條件(泳道
l)和非還原條件下(泳道4)。
圖9顯示具有4艮據(jù)本發(fā)明修飾的環(huán)序列的重組BoNT(Cl)在SDS聚丙烯 酰胺凝膠上的分析。該毒素的表達(dá)在M15[pREP4]細(xì)胞中完成，該細(xì)胞^皮質(zhì)粒 pQE-BoNT(Cl)-Lm。cnHNHc轉(zhuǎn)化。泳道1和4:在Ni-NTA瓊脂糖上純化的毒 素；泳道2:分子量標(biāo)記；泳道3:無上樣。上樣在還原條件(泳道l)或非還 原條件下(泳道4)。
SEO ID NO. 1是編碼具有根據(jù)本發(fā)明修飾的環(huán)序列和C末端六組氨酸標(biāo) 簽的重組肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型(rBoTN(A)-modl)的核酸(DNA)的實例。
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對應(yīng)于SEQIDNO. 8的序列，其中缺失了氨基酸殘基875-1305。
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實施例
修飾的環(huán)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型LHN片段
為了克隆輕鏈以及易位域的DNA序列，將染色體DNA從肉毒梭菌A 型(菌抹ATCC 350"的培養(yǎng)物中分離。通過用引物# 1和# 2 (圖6)的PCR擴增， 獲得編碼具有修飾的環(huán)序列和C末端His標(biāo)簽的BoNT(A)輕鏈的基因片段。 借助Wco 1和Sa/1的限制位點將PCR擴增產(chǎn)物克隆到表達(dá)質(zhì)粒pQE-60中， 從而產(chǎn)生質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm。d"通過用引物#3和#4(圖6)的PCR擴增， 產(chǎn)生編碼BoNT(A)的易位域的基因片段。借助&w I和屈o I的限制位點將該 片段克隆到pQE-BoNT(A)-Lm。dl中的環(huán)序列和His標(biāo)簽的序列之間(質(zhì)粒 pQE-BoNT(A)-LmodlHN;序列# 2,圖3, No.2)。將大腸桿菌表達(dá)菌抹 M15[pREP4] (Qiagen)用質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm。cnHN轉(zhuǎn)化。修飾的LHn片段的 表達(dá)通過用500 一終濃度的IPTG于25攝氏度過夜分步誘導(dǎo)進(jìn)行。在具有 300 mMNaCl的50 mMpH 8.0磷酸緩沖液中通過溶菌酶處理和超聲波處理將 細(xì)胞裂解。將經(jīng)過離心的裂解物在Ni-NTA瓊脂糖柱上層析。在SDS聚丙烯 酰胺凝膠上的分析顯示，在還原條件下兩條大約50 kDA的帶以及一條100 kDA的帶被考馬斯染色，而在非還原條件下僅觀察到所述100 kDA的帶(圖 7)。這樣就清楚地證明，有多于75%的LHN片段是作為雙鏈多肽從細(xì)菌中釋 放的，其中兩條鏈通過二硫鍵彼此共價結(jié)合。后續(xù)的凝血酶處理一方面導(dǎo)致 單鏈形式的切割，另一方面導(dǎo)致雙鏈多肽中易位域的縮短(圖7)。在純化LHn 片段之前將大腸桿菌裂解物溫育兩小時，導(dǎo)致雙鏈多肽的完全切割。
相應(yīng)被表達(dá)和純化的具有天然環(huán)序列的LHn片段(困3， No. l)在SDS聚 丙烯酰胺凝膠上于非還原以及還原條件下均呈現(xiàn)100 kDa的帶。僅在用胰蛋 白酶切割時才能將該單鏈多肽轉(zhuǎn)化成雙鏈二石危橋連的LHN片段。
實施例2克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型LHNHCN 片段和切割位點的鑒定
用引物# 3和# 5(圖6)通過PCR擴增產(chǎn)生HNHcN片段(具有BoNT(A)受體 結(jié)合域的N端一半的易位域)，并且借助&w I和I的限制性位點克隆到質(zhì) 粒pQE-BoNT(A)畫Lm。d!中(質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm。d!HNHcN;序列#3)。表達(dá)和 純化根據(jù)實施例1所述進(jìn)行。在SDS聚丙烯酰胺凝膠上的分析顯示，除了對 應(yīng)于單鏈多肽的弱帶和其它未定義的帶之外，有對應(yīng)于輕鏈和HNHCN片段的 50 kDa的帶以及一條75 kDa的帶。對HNHCN片段最先四個氨基酸殘基的N
末端測序提供了序列Ser-Leu-Val-Pro。在大腸桿菌裂解物中通過蛋白酶活性 的切割由此發(fā)生在Lys柳之后，從而在插入到環(huán)中的五肽Val-Pro-Arg-Gly-Ser 的N端方向上。
實施例3克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素B型LHN片段
為了克隆輕鏈以及易位域的DNA序列，從肉毒梭菌B型(菌抹Okra)的 培養(yǎng)物中分離染色體DNA。用引物# 6和# 7 (圖6)通過PCR擴增產(chǎn)生了編碼 具有BoNT(A)修飾的環(huán)序列的BoNT(B)輕鏈的基因片段。用引物# 8和# 9 (圖 6)了產(chǎn)生編碼BoNT(B)的易位域的基因片段?？寺〉奖磉_(dá)質(zhì)粒pQE-60中是這 樣實現(xiàn)的首先借助Wco/和&w/限制性位點，用BoNT(B)-U。cu擴增產(chǎn)物替 換pQE-BoNT(A)-Lm。cn中的BoNT(A)-L基因片段。接下來，借助&"I和屈o I限制性位點將BoNT(B)-HN擴增產(chǎn)物克隆在其后面，由此產(chǎn)生質(zhì)粒 pQE-BoNT(B)-Lm。dlHN (序列# 5)。以類似于實施例1的方式在宿主菌抹 M15[pREP4]中表達(dá)并純化LHN片段。SDS聚丙烯酰胺凝膠上的分析顯示在還 原條件下有大約50 kDa和55 kDa的兩條帶被考馬斯染色，而在非還原條件 下觀察到一條大約105 kDa的帶(圖8)。這些清楚地說明LHN片段基本上作為 雙鏈多肽從細(xì)菌中釋放，其中多于80%的兩條鏈通過二硫鍵彼此共價連接。
實施例4克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素Cl型LHN片段 和切割位點的鑒定
為了克隆輕鏈以及易位域的DNA序列，從肉毒梭菌Cl型(菌抹C205) 的培養(yǎng)物中制備染色體DNA。用引物# 10和# 11進(jìn)行PCR擴增(圖6)產(chǎn)生了 編碼具有BoNT(A)的修飾環(huán)序列的BoNT(Cl)輕鏈的基因片段。用引物# 12 和# 13 (圖6)，產(chǎn)生編碼BoNT(Cl)的易位域的基因片段?？寺〉奖磉_(dá)質(zhì)粒 pQE-60中是這樣實現(xiàn)的首先借助Wco /和/的限制性位點用 pQE-BoNT(Cl)-Lm。^擴增產(chǎn)物替換pQE-BoNT(A)-Lm。d,中的BoNT(A)-L基因 片段。接下來，借助5y"I和屈oI限制性位點將BoNT(Cl)-HN擴增產(chǎn)物克隆 在其后面，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pQE-BoNT(Cl)-Lm。d,HN(序列弁7)。以類似于實施例 1的方式在宿主菌抹M15[pREP4]中表達(dá)并純化LHN片段。SDS聚丙烯酰胺凝 膠上的分析顯示在還原條件下有大約50 kDa和55 kDa的兩條帶被考馬斯染 色，而在非還原條件下觀察到一條大約105 kDa的帶。這清楚地說明多于90。/。
的LHN片段作為雙鏈多肽從細(xì)菌中釋放，在所述雙鏈多肽中兩條鏈通過二硫 鍵彼此共價連接。對Hn片段最先四個氛基酸殘基的N末端測序結(jié)果為序列
Ser-Leu-Val-Pro。大腸桿菌裂解物中蛋白酶活性所致的切割發(fā)生在Lys44 之后， 因而在插入BoNT(A)環(huán)中的五肽Val-Pro-Arg-Gly-Ser的N端方向上。通過直 接誘變，將插入的五肽的精氨酸殘基替換為組氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺。溫 育大腸桿菌裂解物兩小時之后，以相同方式表達(dá)的誘變的LHn片段中多于 9 0 %以雙鏈二硫鍵化的形式存在，其中切割的效率稍低于含有用五肽 Val-Pro-Arg-Gly-Ser修飾的BoNT(A)環(huán)的LHN片段。
實施例5克隆和表達(dá)帶有修飾環(huán)的重組肉毒桿菌神經(jīng)毒素Cl型
使用肉毒梭菌C205菌抹的染色體DNA,用引物# 12和# 14 (圖6)擴增編 碼重鏈的基因片段。借助&w I和Wo I的限制性位點將其克隆到質(zhì)粒 BoNT(Cl)-Lm。dlHN中編碼輕鏈的序列^險和His標(biāo)簽的序列辜史之間(質(zhì)粒 pQE-BoNT(Cl)-Lm。dlHNHc;序列# 6)。用相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá) 菌抹M15[pREP4] (Qiagen)。以類似于實施例1的方式在宿主菌抹M15[pREP4] 中表達(dá)并純化。SDS聚丙烯酰胺凝膠上的分析顯示在還原條件下有大約50 kDa和105 kDa的兩條帶被考馬斯染色，而在非還原條件下觀察到一條大約 155 kDa的帶(圖9)。這樣清楚地證明，多于90%的重組神經(jīng)毒素作為雙鏈多 肽從細(xì)菌中釋放，在所述雙鏈多肽中兩條鏈通過二硫鍵彼此共價連接。偏側(cè) 膈鑒定(hemidiaphragm assay)中活性檢測的結(jié)果是其毒性可以與分離自肉毒 梭菌的天然神經(jīng)毒素Cl型的毒性相比較。因此輕鏈和易位域之間環(huán)區(qū)域的修 飾對毒性不產(chǎn)生影響。
實施例6克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的假單胞菌外毒素(Pe40)的重組片段
4吏用菌抹銅綠4叚單胞菌CP"wdomo"(zy aerwg/"osa) 103的染色體DNA ，使 用引物# 17和# 18 (圖6)通過PCR擴增了一個基因片段，其編碼域II中位于 半胱氨酸殘基13和36之間的環(huán)的C端的區(qū)域以及域III。借助Wco I和Mw I 將擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm。dl中，替換基因片段BoNT(A)-Lm。dl (質(zhì)粒pQE-PEI13 III)。通過寡核苷酸# 15和# 16 (圖6)的雜交并借助Wco I和
I限制性位點克隆，將環(huán)N端方向的域II區(qū)域的序列段插入質(zhì)粒pQE-PEI13 III中(質(zhì)粒pQE-PEIIm。d III;序列# 9)。用相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá) 菌株M15[pREP4] (Qiagen)。以類似于實施例1的方式在宿主菌抹M15[pREP4] 中表達(dá)和純化。SDS凝膠上還原條件下的分析產(chǎn)生一條較弱的40kDa的帶和 一條較強的37kDa的帶。然而在非還原條件下，僅觀察到一條40kDa的帶。 當(dāng)親和層析純化之前室溫溫育細(xì)胞裂解物至少兩小時時，在還原條件下不再 能夠檢測到40kDa的帶。用修飾的BoNT(A)環(huán)替換PE40片段的域II中半胱 氨酸殘基13和36之間的環(huán)區(qū)域，從而發(fā)生了多肽鏈的切割，其中前述半胱 氨酸殘基形成二硫鍵。在12。/。SDS凝膠中還原之后，不再能夠檢測到大約3 kDa的N末端片段。
實施例7克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的白喉毒素(Dt389)的重組片段
<吏用白喉才奉桿菌(Co7"e6a"en'wm ^p/^2en'a) NCTC 13129菌才朱的染色體 DNA，用引物# 19和# 20 (圖6)通過PCR擴增編碼白喉毒素A鏈的基因片段。 借助7Vco I和&m I的限制性位點將擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒pQE-BoNT(A)-Lm。d, 中(參見實施例1)(質(zhì)粒pQE-DT-Amodl)。以相同的方式，用引物#21和#22(圖 6)擴增編碼B鏈N末端片段的基因片段，并且將該基因片段借助I和Wo I的限制性位點克隆到pQE-DT-Am。cn中(質(zhì)粒pQE-DT3W-m。d,;序列# 10)。用 相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌抹M15[pREP4] (Qiagen)。以類似于實施 例1的方式在宿主菌抹M15[pREP4]中表達(dá)和純化。SDS聚丙烯酰胺凝膠上 的分析顯示，在還原條件下兩條大約22kDa的帶被考馬斯染色，而在非還原 條件下觀察到一條大約43kDa的帶。這清楚地說明，多于90%的重組白喉毒 素片段作為雙鏈多肽從細(xì)菌中釋放，在所述雙鏈多肽中兩條鏈通過二石克鍵彼 此共價連接。
實施例8克隆和表達(dá)具有修飾的環(huán)的重組蓖麻毒蛋白
使用蓖麻的種子mRNA，用引物#23和#24(圖6)通過RT-PCR擴增編碼 蓖麻毒蛋白A鏈的基因片段。借助臉o I和j^o I的限制性位點將其克隆到質(zhì) 粒pQE-BoNT(A)-Lmodl中(參見實施例1)(質(zhì)粒pQE-Ricin-A)。以相同的方式， 用引物# 25和# 26 (圖6)擴增編碼B鏈的基因片段，并借助《;w I和Wo I的 限制性位點克隆到pQE-Ricin-A中(質(zhì)粒pQE-Ricin-modl;序列# 11)。用相應(yīng) 的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌抹M15[pREP4](Qiagen)。以類似于實施例1 的方式在宿主菌抹M15[pREP4]中表達(dá)并純化所表達(dá)的蓖麻毒蛋白的可溶部
分。SDS聚丙烯酰胺凝膠上的分析顯示，在還原條件下有兩條大約19kDa和 42kDa的帶被考馬斯染色，而在非還原條件下觀察到大約62kDa的帶。這清 楚的說明多于90%的重組蓖麻毒蛋白的可溶部分以雙鏈多肽形式從細(xì)菌中釋 放，所述雙鏈多肽中兩條鏈通過二硫鍵彼此共價連接。
科學(xué)文獻(xiàn)
Arom et al. (1999)， Cancer Res. 59:183-8 Collier (2001), Toxicon 39 (11): 1793-803 Fujinaga (1997), Microbiology 143: 3841-47 Ogata et al. (1990), J. Biol. Chem 265(33): 20678-85 Reiter (2001)， Adv. Cancer Res. 81: 93-124
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專利文獻(xiàn)
Borgford,美國專利6,593,132 Brown and Jones, WO 89/04839 Fitzgerald et al.,美國專利6,426,075 Pastan et al.，美國專利5，980，89權(quán)利要求
1.通過在大腸桿菌宿主細(xì)胞中重組表達(dá)產(chǎn)生雙鏈形式的多肽或蛋白質(zhì)的方法，所述兩條鏈?zhǔn)嵌驑蜻B的，其中(i)所述多肽或蛋白質(zhì)作為雙鏈二硫鍵橋連的多肽或蛋白質(zhì)發(fā)揮其生物活性；(ii)第一鏈的C末端氨基酸殘基是Arg殘基或Lys殘基，(iii)所述蛋白質(zhì)/多肽的第二鏈在N末端具有1-20個氨基酸殘基和稱為PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中V是Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，其中P是Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，其中G是Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，并且其中S是Ser、Tyr、Trp或Thr；并且(iv)所述方法包含以下步驟(a)在核酸水平修飾多肽或蛋白質(zhì)，使得經(jīng)修飾形式的該多肽或蛋白質(zhì)在其環(huán)區(qū)域具有序列VPXGS，其中X、V、P、G和S如上所定義；(b)將核酸水平被修飾的構(gòu)建體導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞中；(c)培養(yǎng)并隨后裂解宿主細(xì)胞；和(d)分離所述雙鏈二硫橋連的肽或蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽/蛋白質(zhì)的第一鏈?zhǔn)窃摱嚯?蛋 白質(zhì)的較輕的鏈，而第二鏈?zhǔn)窃摱嚯?蛋白質(zhì)的較重的鏈。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多肽或蛋白質(zhì)是肉毒桿菌神經(jīng) 毒素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法，其中所述多肽或蛋白質(zhì)是血清型A的 肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT(A))。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多肽或蛋白質(zhì)是BoNT(A)的 LHw片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中將PRS序列VPXGS插入到BoNT(A) 的氨基酸Leu442和Lys448之間，該BoNT(A)缺失了氨基酸443-447。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中將PRS序列VPRGS、 VPYGS、 VPHGS 或VPQGS插入。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-3之一的方法，其中將PRS序列VPXGS插入缺失了 至少一個氨基酸的下列序列中BoNT(B)的八肽Lys438 - Ile445、 BoNT(Cl)的 15聚體His438 -Asp452、或BoNT(E)的13聚體Lys413 - Ile425。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中將PRS序列VPXGS以17聚體 GIITSKTKSLVPRGSKA或18聚體RGIITSKTKSLVPRGSKA的形式插入。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白質(zhì)是雜合蛋白。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述雜合蛋白具有以下成分A、 B和C:-效應(yīng)物域，該域通過其酶促活性，能夠抑制靶細(xì)胞中的分泌或殺死它們， 或毒素域(成分A);-環(huán)序列，其包含序列VPXGS (成分B);以及-細(xì)胞結(jié)合域，其賦予所述融合蛋白或雜合蛋白以細(xì)胞特異性(成分C)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述雜合蛋白還包含作為成分D的易 位域。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中所述毒素域(A)是白喉毒素、假 單胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述毒素域(A)是假單胞菌外毒素的 片段PE40 (域III、域II和域Ib)或片段PE38 (域m和域II)或蓖麻毒蛋白A鏈。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-14之一的方法，其中所述細(xì)胞結(jié)合域(C)是單克隆 抗體、a伍lin、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalin、生長因子例如TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1，或細(xì)胞因子例如IL2、 IL4或IL6。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述雜合蛋白具有以下成分A、 B和C:-蛋白質(zhì)或寡肽，其賦予融合蛋白較好的可溶性，實現(xiàn)較高的表達(dá)率和/ 或使其能夠被親和純化(成分A);-環(huán)序列，其包含序列VPXGS (成分B)，以及 -任何類型的多肽(成分C)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、 His標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述大腸桿菌細(xì)胞是大腸桿菌 K12細(xì)胞，尤其是菌抹M15[pREP4]、 XL1-BLUE或UT5600的大腸桿菌K12 細(xì)胞。
19. 多肽或蛋白質(zhì)，其中該多肽/蛋白質(zhì)作為雙鏈二硫橋連的多肽/蛋白質(zhì)存在，并且是生物活性的，其特征在于該多肽/蛋白質(zhì)的第一鏈C末端是Arg 殘基或Lys殘基，而該多肽/蛋白質(zhì)的第二鏈在N末端包含1-20個氨基酸殘 基和稱為PRS的五肽序列VPXGS，其中X是任何天然存在的氨基酸，其中 V是Val、 Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Pro或Gly，其中P是Pro、 Leu、 Ile、 Ala、 Phe、 Val或Gly,其中G是Gly、 Leu、 Ile、 Ala、 Pro、 Phe或Val,并且其中 S是Ser、 Tyr、 Trp或Thr。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述多肽/蛋白質(zhì)的第一鏈 是該多肽/蛋白質(zhì)的較輕的鏈，而第二鏈?zhǔn)窃摱嚯?蛋白質(zhì)的較重的鏈。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述第一鏈的C末端 是Lys殘基。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19-21之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述第二鏈在N末 端具有五肽序列VPXGS、六肽序列XVPXGS或七肽序列XXVPXGS。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19或22的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述多肽/蛋白質(zhì)是肉 毒桿菌神經(jīng)毒素、肉毒桿菌神經(jīng)毒素的衍生物或片段，尤其是LHn片段，或 所述多肽/蛋白質(zhì)具有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的生物活性。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19-23之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述多肽/蛋白質(zhì)是 血清型A的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT(A))或具有BoNT(A)的生物活性。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19-22之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述多肽或蛋白質(zhì) 是BoNT(A)的LHN片段或具有BoNT(A)的LHN片段的生物活性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求19-25之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述第二鏈在N末 端具有七肽序列SLVPXGS。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的多肽或蛋白質(zhì)，其中X是R、 Y、 H或Q。
28. 根據(jù)權(quán)利要求19-22、 26或27之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述蛋白 質(zhì)是雜合蛋白。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述雜合蛋白具有以下成分 A、 B和C:-效應(yīng)物域，該域通過其酶促活性能夠抑制靶細(xì)胞中的分泌或殺死它們， 或毒素域(成分A);-環(huán)序列，其包含序列VPXGS (成分B);以及-細(xì)胞結(jié)合域，其賦予融合蛋白或雜合蛋白以細(xì)胞特異性(成分C)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述雜合蛋白還具有易位域 作為成分D。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29或30的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述毒素域(A)是白喉 毒素、假單胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白的域。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述毒素域(A)是假單胞菌 外毒素的片段PE仰(域III、域II和域Ib)或片段PEM (域III和域II)或蓖麻毒 蛋白A鏈。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29-32之一的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述細(xì)胞結(jié)合域(C) 是單克隆抗體、a伍lin、錨蛋白重復(fù)蛋白、anticalin、生長因子例如TGF-alpha、 FGF、 VEGF或IGF-1，或細(xì)胞因子例如IL2、 IL4或IL6。
34. 根據(jù)權(quán)利要求28的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述雜合蛋白具有以下成分 A、 B和C:-蛋白質(zhì)或寡肽，其賦予融合蛋白較好的可溶性，實現(xiàn)較高的表達(dá)率和/ 或使其能夠被親和純化(成分A);-環(huán)序列，其包含序列VPXGS (成分B)，以及 -任何類型的多肽(成分C)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述成分A是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、 His標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。
36. 核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求19-35之一的多肽或蛋白質(zhì)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36的核酸，其是DNA。
38. 載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求36或37的核酸。
39. 宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求38的載體。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核的，尤其是 大腸桿菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌K12細(xì)胞。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39或40的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是Ml5[pREP4] 并且其中所述載體是pQE系列的質(zhì)粒。
42. 藥物制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求19-35之一的多肽或蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及以雙鏈形式產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)的方法，該方法通過在大腸桿菌中的重組表達(dá)，由此i)所述多肽或蛋白質(zhì)作為雙鏈多肽或蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能，ii)第一鏈的C末端氨基酸基團是Arg或Lys基團，iii)所述蛋白質(zhì)/多肽的第二鏈在其N末端具有1-20個氨基酸基團和稱為PRS的五肽序列VPXGS，其中X可以是任何天然存在的氨基酸，其中V代表Val、Leu、Ile、Ala、Phe、Pro或Gly，P代表Pro、Leu、Ile、Ala、Phe、Val或Gly，G代表Gly、Leu、Ile、Ala、Pro、Phe或Val，而S代表Ser、Tyr、Trp或Thr；以及iv)所述方法包含以下步驟a)在核酸水平修飾所述多肽或蛋白質(zhì)，使經(jīng)修飾形式的該多肽或蛋白質(zhì)在其環(huán)區(qū)域包含序列VPXGS，其中X、V、P、G和S如上所定義；b)引入所述在核酸水平修飾的構(gòu)建體到大腸桿菌細(xì)胞中；c)培養(yǎng)并且隨后裂解所述宿主細(xì)胞；以及d)分離雙鏈多肽或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所述多肽或蛋白質(zhì)是肉毒桿菌神經(jīng)毒素，特別是肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT(A))A型。
文檔編號A61K38/48GK101107361SQ200680002957
公開日2008年1月16日 申請日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日
發(fā)明者沃爾克·施佩希特 申請人:比奧泰康醫(yī)療有限責(zé)任公司