本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對分析方法。

背景技術(shù)：

二硫鍵即S-S鍵，是2個巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價鍵，是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個半胱氨酸，在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、保持正確的空間構(gòu)象、調(diào)節(jié)生物學活性方面起著非常重要的作用。二硫鍵正確配對利于肽鏈迅速折疊并形成緊密的、穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成局部疏水中心，能阻止水分子進入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，形成穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)區(qū)域。

二硫鍵只具有相對的穩(wěn)定性，其共價鍵容易被還原而斷裂，當二硫鍵被斷開還原為巰基基團時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象必然發(fā)生改變，可能完全或部分喪失原有的生物學功能，巰基含量較高的抗體具有較低的生物活性和較低的熱穩(wěn)定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibody stability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正確的二硫鍵配對方對抗體蛋白藥物生物學活性至關(guān)重要，錯配或不能完全形成二硫鍵往往意味活性的降低(Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1molecule.Analytical Biochemistry 2010；397:37-47)。在細胞株篩選、純化工藝確認、制劑配方篩選、產(chǎn)品穩(wěn)定性確認過程中，監(jiān)控二硫鍵配對可以判斷抗體蛋白工藝開發(fā)?，F(xiàn)有技術(shù)對二硫鍵配對的確認，可以采用多種酶切方式結(jié)合MS/MS模式確認5對二硫鍵配對(K·J·萊斯特等人，組合物和用于生產(chǎn)組合物的方法，中國專利公開號：CN101448852)，但該方法存在酶切種類相對較多，且碎片離子不豐富等缺點。

rhCTLA4-Ig是將人細胞毒性T-淋巴細胞-聯(lián)合抗原4(CTLA-4)的細胞外功能 域連接到人免疫球蛋白G1(IgG1)的修飾Fc(鉸合部，CH2和CH3功能域)上而成的一種融合蛋白，BMS公司已將其開發(fā)用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病(通用名abatacept，商品名)，目前對rhCTLA4-Ig等融合蛋白的二硫鍵配分析方法往往需通過多種酶切才能確認，非常不方便。

因此，一種簡單、有效的融合蛋白(如rhCTLA4-Ig)二硫鍵配對分析方法仍是目前急需的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白二硫鍵配對分析方法，該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中融合蛋白的N-糖對特異性酶酶解蛋白時的空間位阻作用以及肽段離子化效率的抑制，減少了酶切方式，能準確確認及定位二硫鍵肽段。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種融合蛋白二硫鍵配對分析方法，包括如下步驟：1、去除融合蛋白的N-糖(N-Glycosylations)；2、對除去N-糖的融合蛋白進行變性處理；3、非還原條件下特異性酶酶解融合蛋白；4、酶解后分成兩份樣品，對一份樣品進行還原，對另一份樣品不進行還原，終止酶解；5、對終止酶解后的樣品的二硫鍵肽段進行質(zhì)量肽譜圖分析。

較佳的，所述融合蛋白為含N-糖鏈的融合蛋白，最優(yōu)為rhCTLA4-Ig。

較佳的，步驟1中使用肽N-糖苷酶F(PNGase F)去除所述融合蛋白的N-糖；優(yōu)選溶液pH值為7.0～8.0。

在一具體實施方式中，所述融合蛋白的N-糖去除通過以下方法實現(xiàn)：取融合蛋白樣品，加入溶液如1％FA(體積濃度)或1％NH₃.H₂O(體積濃度)，調(diào)節(jié)pH值至7.0～8.0，加入肽N-糖苷酶F，混勻后，37℃孵育24小時。

較佳的，步驟2中使用高濃度鹽酸胍溶液對去除了N-糖的融合蛋白進行變性處理；優(yōu)選鹽酸胍的(GuHCl)濃度為6M；更優(yōu)選使用8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3對融合蛋白進行變性處理。

較佳的，步驟3中所述特異性酶包括胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶；優(yōu)選胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)；優(yōu)選胰凝乳蛋白酶的用量為1﹕50(wt/wt，酶/蛋白)。

較佳的，步驟3中所述特異性酶酶解融合蛋白孵育溫度為37℃，孵育時間為 2～4小時，優(yōu)選孵育時間為4小時。

在另一具體實施方式中，所述胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)，胰凝乳蛋白酶用量為1﹕50(wt/wt，酶/蛋白)。

較佳的，步驟4中使用DTT對所述一份樣品進行還原；優(yōu)選DTT的濃度為60mM。

較佳的，步驟4中加入甲酸(FA)終止酶解；優(yōu)選加入所述甲酸至終體積濃度0.1％。

較佳的，步驟5中使用ESI-Q-TOF MS方法進行分析，所得數(shù)據(jù)采用BiopharmaLynx軟件進行處理分析。

在另一具體實例中，所述ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法實現(xiàn)：將融合蛋白用50mM NH₄HCO₃(pH8.0)溶液稀釋至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白濃度計)；然后Waters Acquity UPLC BEH300 C18 1.7μm 2.1×150mm色譜柱分離，進行Q-TOF質(zhì)譜分析。

本發(fā)明融合蛋白rhCTLA4-Ig單鏈共有9個半胱氨酸Cys，分別為Cys21、Cys48、Cys 66、Cys 92、Cys120、Cys171、Cys231、Cys277、Cys335，從N-末端開始到C-末端分別標示為1C～9C，理論配對為單鏈鏈內(nèi)二硫鍵：1C/4C、2C/3C、6C/7C、8C/9C，鏈間二硫鍵5C/5C。

本發(fā)明中，所述變性是指在高濃度鹽等作用下，蛋白質(zhì)分子間氫鍵等次級鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散的伸展狀結(jié)構(gòu)，但其一級結(jié)構(gòu)并未改變。

本發(fā)明中，所述還原是指蛋白質(zhì)二硫鍵在還原試劑作用下斷開。

實驗結(jié)果表明，通過利用特異性脫糖酶去除融合蛋白N-糖后再進行蛋白變性后酶解，通過胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶切方式即可確認2C/3C這對含有N-糖位點二硫鍵肽段。不去除N-糖，只采用胰蛋白酶酶切只能確認Fc段6C/7C、8C/9C兩對二硫鍵，2C/3C這對含有N-糖位點二硫鍵肽段需要采用酶切位點較多特異性酶聯(lián)合胰蛋白酶以使得含2C和3C的二硫鍵肽段不含N-糖，從而排除N-糖對二硫鍵肽段離子化效率及酶切位阻的影響，最后才能確認2C/3C二硫鍵。實驗結(jié)果還表明，融合蛋白N-糖去除后2C/3C、6C/7C這兩對二硫鍵配對方式在胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的酶切條件下均能確認。

總之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明通過2種酶切 方式即可確認融合蛋白rhCTLA4-Ig全部二硫鍵配對，酶切方式相對較少，并且碎片離子較為豐富。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(1C/4C)碎片離子圖；

圖2為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(2C/3C)碎片離子圖；

圖3為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖；

圖4為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(8C/9C)碎片離子圖；

圖5為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(1C)碎片離子圖；

圖6為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(4C)碎片離子圖；

圖7為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(2C)碎片離子圖；

圖8為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(3C)碎片離子圖；

圖9為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(8C)碎片離子圖；

圖10為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(9C)碎片離子圖；

圖11為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(5C/5C)碎片離子圖；

圖12為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(2C/3C)碎片離子圖；

圖13為本發(fā)明實施例1融合蛋白二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖；

圖14為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(5C)碎片離子圖；

圖15為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(2C)碎片離子圖；

圖16為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(3C)碎片離子圖；

圖17為本發(fā)明實施例1自由巰基肽段(6C)碎片離子圖。

附圖中肽段中氨基酸之間的每一條虛線表示檢測到的該肽段的一個碎片離子(b離子或y離子)，y離子是從肽段羧基端開始，b離子是從肽段氨基端開始。一般碎片離子越多越豐富，即表明該肽段是理論肽段，碎片離子較少，則不一定是理論肽段，可能是具有相同分子量的其他肽段，碎片離子的多少與肽段的長度及碎裂模式有關(guān)，太短或太長的肽段在誘導碰撞電離碎裂模式下一般碎片離子都較少。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步闡述，不應理解為是對本發(fā)明的限制。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均是按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進行實驗。

以下實施例中所用融合蛋白為rhCTLA4-Ig(上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司提供)。

實施例1：融合蛋白二硫鍵配對分析(胰蛋白酶酶切)

融合蛋白二硫鍵配對分析步驟：

(1)N-糖(N-Glycosylations)去除

取1mg rhCTLA4-Ig融合蛋白樣品，加入50mM NH₄HCO₃(pH8.0)溶液至體積20～50μL，加入1μL肽N-糖苷酶PNGase F(NEB，500000u/mL)，混勻后，37℃孵育24小時。

(2)蛋白變性處理

取(1)中孵育好的蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(3)酶解

取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶酶解抗體蛋白，37℃孵育4小時。

(4)還原和終止酶解

待(3)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應，同時酸化肽段。

(5)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選如下：

表1：ESI-Q-TOF MS分析質(zhì)譜參數(shù)和液相條件

流動相A：0.1％FA-H₂O，流動相B：0.1％FA-ACN，質(zhì)譜清洗液：50％CAN，質(zhì)譜IntelliStart閥清洗液：50％MeOH，柱溫：45℃，檢測波長：214nm，進樣體積：5μL或10μL，樣品室溫度：10℃，液相梯度洗脫條件：流動相B在80分鐘內(nèi)從1％到36％。

實驗結(jié)果：實驗結(jié)果見下表2-3，其中：表2為本發(fā)明實施例1非還原條件融合蛋白二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表；表3為本發(fā)明實施例1非還原條件融合蛋白自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表。

表2：非還原條件融合蛋白二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表

表3：非還原條件融合蛋白自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表

經(jīng)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析，二硫鍵肽段(1C/4C)碎片離子圖見附圖1，二硫鍵肽段(2C/3C)碎片離子圖見附圖2，二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖見附圖3，二硫鍵肽段(8C/9C)碎片離子圖見附圖4，自由巰基肽段(1C)碎片離子圖見附圖5，自由巰基肽段(4C)碎片離子圖見附圖6，自由巰基肽段(2C+3C)碎片離子圖見附圖7，自由巰基肽段(6C)碎片離子圖見附圖8，自由巰基肽段(8C)碎片離子圖見附圖9，自由巰基肽段(9C)碎片離子圖見附圖10。

實施例2：融合蛋白完整分子量分析(胰蛋白酶聯(lián)合胰凝乳蛋白酶酶切)

融合蛋白二硫鍵配對分析步驟：

(1)N-糖(N-Glycosylations)去除

取1mg rhCTLA4-Ig融合蛋白樣品，加入50mM NH₄HCO₃(pH8.0)溶液至體積20-50μL，加入1μL肽N-糖苷酶PNGase F(NEB，500000u/mL)，混勻后，37℃孵育24小時。

(2)蛋白變性處理

取(1)中孵育好的蛋白樣品0.5mg加入到380ul變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(3)酶解

取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1:50(wt/wt)加入胰凝乳蛋白酶酶解蛋白，37℃孵育4小時。

(4)還原和終止酶解

待(3)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終濃度0.1％，終止酶解反應，同時酸化肽段。

(5)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選與實施例1中相同，具體見表1。

實驗結(jié)果：實驗結(jié)果見下表4-5，其中：表4為本發(fā)明實施例2非還原條件融合蛋白二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表；表5為本發(fā)明實施例2非還原條件融合蛋白自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表。

表4：非還原條件融合蛋白二硫鍵肽段分子量與理論分子量對比表

表5：非還原條件融合蛋白自由巰基肽段分子量與理論分子量對比表

經(jīng)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析，二硫鍵肽段(5C/5C)碎片離子圖見附圖11，二硫鍵肽段(2C/3C)碎片離子圖見附圖12，二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖見附圖13，自由巰基肽段(5C)碎片離子圖見附圖14，自由巰基肽段(2C)碎片離子圖見附圖15，自由巰基肽段(3C)碎片離子圖見附圖16，自由巰基肽段(6C)碎片離子圖見附圖17。

綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過特異性脫糖酶去除N-糖，可以排除融合蛋白N-糖對特異性酶在酶解解蛋白時的空間位阻作用，降低N-糖對肽段離子化效率的抑制，通過較少酶切方式即可確認融合蛋白(如rhCTLA4-Ig)所有二硫鍵配對方式，僅通過胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶切方式均能確認含N-糖位點二硫鍵肽段，并且碎片離子信息豐富，全部二硫鍵配對也僅通過2種酶切方式即能確認。