本發(fā)明涉及一種食品檢驗(yàn)方法，特別涉及一種牛乳中獸藥殘留的檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
：四環(huán)素類抗生素包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素，由于其廣譜抗菌效果，常被用在奶牛養(yǎng)殖過程中，用以防治奶牛消化系統(tǒng)感染及促進(jìn)奶牛生長(zhǎng)。但為了防止藥物隨食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生威脅，歐盟以及我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)四環(huán)素類抗生素在牛乳中的殘留限量都作了嚴(yán)格規(guī)定。目前，用于檢測(cè)四環(huán)素類抗生素的方法很多，大致可以分為微生物法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)分析法、高效液相色譜法（HPLC）以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）。在HPLC法和LC-MS法中，樣品前處理方法通常按照《GB/T21317-2007動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》提供的前處理方法，采用Na2EDTA-Mellvaine緩沖溶液進(jìn)行樣品提取，該提取液配制步驟繁瑣，導(dǎo)致在樣品前處理步驟花費(fèi)很多時(shí)間，不利于企業(yè)日?？焖贆z測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明公開的牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法，包括樣品提取、樣品凈化和儀器分析步驟，樣品提取步驟為：向待測(cè)牛乳樣品中加入Na2EDTA-乙酸水溶液，混合后離心取上清液，即為樣品提取液。在牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法的一種示意性實(shí)施方式中，樣品提取步驟為：稱取待測(cè)牛乳樣品5g，加入0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液20mL，混合后離心，取上清液，即為樣品提取液。在牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法的一種示意性實(shí)施方式中，樣品提取步驟為：稱取待測(cè)牛乳樣品5g于50mL離心管中，加入0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩渦混合器上混合30s，然后在10000r/分鐘下離心8分鐘，取5mL上清液，即為樣品提取液。在牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法的一種示意性實(shí)施方式中，樣品凈化步驟為：取HLB固相萃取柱，用3至5mL甲醇和3至5mL超純水分別進(jìn)行活化和平衡；再將樣品提取液經(jīng)過HLB固相萃取柱，固相萃取裝置的流速不超過2mL/分鐘；待樣品提取液全部通過HLB固相萃取柱后，用3至5mL5%甲醇水溶液洗滌HLB固相萃取柱，棄去全部流出液；再用3至5mL甲醇洗脫HLB固相萃取柱，并搜集洗脫液至離心管中；然后將離心管中的洗脫液在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，再加?.0mL定容液渦旋溶解，最后以0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，即得到凈化后樣品；其中定容液的配制方法：取10mL乙腈，用水定容至100mL。在牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法的一種示意性實(shí)施方式中，儀器分析步驟采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，色譜條件為：色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18柱，2.1×100mm，1.7μm；柱溫為40℃；進(jìn)樣體積為10μL；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-水；梯度洗脫：0～1.0分鐘，15%A；1.0～2.0分鐘，15%A～25%A；2.0～2.5分鐘，25%A～30%A；2.5～3.0分鐘，30%A；3.0～3.5分鐘，30%A～40%A；3.5～4.5分鐘，40%A～80%A；4.5～5.0分鐘，80%A～15%A，流速為0.4mL/分鐘；質(zhì)譜條件為：離子化模式為電噴霧正離子模式，質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，電離電壓為3.00kV，離子源溫度為120℃，去溶劑氣溫度為400℃，去溶劑氣為N2，流量為500L/h，碰撞氣為Ar，流量為50L/h。本發(fā)明提供的牛乳中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快捷；還可以節(jié)約試劑，從而降低了分析成本，更有利于環(huán)境保護(hù)。本發(fā)明的方法不僅適用于鮮牛乳的檢測(cè)，也同樣適用于復(fù)原乳或奶粉的檢測(cè)。具體實(shí)施方式為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。實(shí)施例1。1、實(shí)驗(yàn)儀器超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（TQD美國(guó)Waters）；固相萃取裝置（美國(guó)Supelco）。2、實(shí)驗(yàn)試劑與材料四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司）；甲醇、乙腈均為色譜純；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水；HLB固相萃取柱（60mg/3mL，美國(guó)waters公司）。3、溶液的配制3.1、標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取適量的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱儲(chǔ)存。使用時(shí)，根據(jù)需要用10%乙腈水溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；3.2、樣品提取液0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液：在1000ml容量瓶中加入2ml冰乙酸，用超純水定容至刻度，加入37.23g乙二胺四乙酸二鈉，溶解并搖勻。配制步驟約需5分鐘；0.2%乙酸水溶液：取2mL冰乙酸，用水定容至1L；淋洗液：取5mL甲醇，用水定容至100mL；定容液：取10mL乙腈，用水定容至100mL。4、色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18柱（2.1×100mm，1.7μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：10μL；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸-水；梯度洗脫：0～1.0分鐘，15%A；1.0～2.0分鐘，15%A～25%A；2.0～2.5分鐘，25%A～30%A；2.5～3.0分鐘，30%A；3.0～3.5分鐘，30%A～40%A；3.5～4.5分鐘，40%A～80%A；4.5～5.0分鐘，80%A～15%A；流速：0.4mL/分鐘。5、質(zhì)譜條件離子化模式：電噴霧正離子模式（ES+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓（kv）：3.00；離子源溫度（℃）：120；去溶劑氣溫度（℃）：400；去溶劑氣（N2）流量（L/h）：500；碰撞氣（高純Ar）流量（L/h）：50；錐孔電壓、碰撞能量及定性和定量離子等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示：表1儀器分析的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定化合物母離子（m/z）子離子1（m/z）碰撞能量1（eV）子離子2（m/z）碰撞能量2（eV）駐留時(shí)間（s）錐孔電壓（V）土霉素461.2426.1*22443.2130.122四環(huán)素445409.7*22426.8170.122金霉素478.8443.6*27461.6230.122強(qiáng)力霉素445427.7*23153.6380.122注：*為定量離子。6、樣品前處理6.1、樣品的提取稱取牛乳樣品5g（精確到0.0001g）于50mL離心管中，加入0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩渦混合器上混合30s，然后在10000r/分鐘下離心8分鐘，取5mL上清液至另一離心管中，待凈化；6.2、樣品的凈化取HLB固相萃取柱（50mg/3mL），分別用3mL甲醇和3mL水活化和平衡，將上述待凈化的上清液經(jīng)過固相萃取柱，在固相萃取裝置上控制流速在2mL/分鐘之內(nèi)，待樣液全部通過固相萃取柱后，用3mL5%甲醇水溶液淋洗液洗滌HLB固相萃取柱，棄去全部流出液，最后用3mL甲醇洗脫固相萃取柱，并搜集洗脫液至離心管中。然后將離心管中的洗脫液在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0mL定容液渦旋溶解，過0.22μm有機(jī)系濾膜，LC-MS/MS分析。凈化步驟需要30分鐘時(shí)間。配制步驟和凈化步驟共需要35分鐘。實(shí)施例2。樣品為奶粉。本實(shí)施例僅在實(shí)施例1的“6.1樣品的提取”、“6.2、樣品的凈化”步驟中有所區(qū)別，其余步驟均與實(shí)施例1完全相同。6.1、樣品的提取稱取奶粉樣品1g（精確到0.0001g）于50mL離心管中，加入5mL水溶解，再加入0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩渦混合器上混合30s，然后在10000r/分鐘下離心8分鐘，取5mL上清液至另一離心管中，待凈化。6.2、樣品的凈化取HLB固相萃取柱（50mg/3mL），分別用4mL甲醇和4mL水活化和平衡，將上述待凈化的上清液經(jīng)過固相萃取柱，在固相萃取裝置上控制流速在2mL/分鐘之內(nèi)，待樣液全部通過固相萃取柱后，用4mL5%甲醇水溶液淋洗液洗滌HLB固相萃取柱，棄去全部流出液，最后用4mL甲醇洗脫固相萃取柱，并搜集洗脫液至離心管中。然后將離心管中的洗脫液在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0mL定容液渦旋溶解，過0.22μm有機(jī)系濾膜，LC-MS/MS分析。凈化步驟需要40分鐘時(shí)間。配制步驟和凈化步驟共需要45分鐘。實(shí)施例3。樣品為奶粉。本實(shí)施例僅在實(shí)施例1的“6.1樣品的提取”、“6.2、樣品的凈化”步驟中有所區(qū)別，其余步驟均與實(shí)施例1完全相同。6.1、樣品的提取稱取奶粉樣品1g（精確到0.0001g）于50mL離心管中，加入5mL水溶解，再加入0.1mol/LNa2EDTA-乙酸水溶液20mL，在漩渦混合器上混合30s，然后在10000r/分鐘下離心8分鐘，取5mL上清液至另一離心管中，待凈化。6.2、樣品的凈化取HLB固相萃取柱（50mg/3mL），分別用5mL甲醇和5mL水活化和平衡，將上述待凈化的上清液經(jīng)過固相萃取柱，在固相萃取裝置上控制流速在2mL/分鐘之內(nèi)，待樣液全部通過固相萃取柱后，用5mL5%甲醇水溶液淋洗液洗滌HLB固相萃取柱，棄去全部流出液，最后用5mL甲醇洗脫固相萃取柱，并搜集洗脫液至離心管中。然后將離心管中的洗脫液在40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0mL定容液渦旋溶解，過0.22μm有機(jī)系濾膜，LC-MS/MS分析。凈化步驟需要50分鐘時(shí)間。配制步驟和凈化步驟共需要55分鐘。實(shí)施例4（對(duì)比實(shí)施例）。本實(shí)施例僅在實(shí)施例1的6.1和6.2步驟中有所區(qū)別，其余步驟均與實(shí)施例1完全相同。6.1、樣品的提取稱取牛乳樣品5g（精確到0.0001g）于50mL離心管中，加入Na2EDTA-Mellvaine緩沖溶液20mL，在漩渦混合器上混合30s，然后在10000r/分鐘下離心8分鐘，取5mL上清液至另一離心管中，待凈化。其中Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制方法為：稱取21.01g檸檬酸，用超純水溶解，定容至1000ml，配置成0.1mol/L的檸檬酸溶液；稱取28.41g磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至1000ml，配置成0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液；將1000ml0.1mol/L的檸檬酸溶液與625ml0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液混合，并用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0,配置成Mcllvaine溶液；稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mlMcllvaine溶液中，使其溶解并混勻。配制時(shí)間30分鐘。6.2、樣品的凈化取HLB固相萃取柱（50mg/3mL），分別用5mL甲醇和5mL水活化和平衡，取10ml提取液以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5ml水和5ml5%甲醇-水溶液淋洗，2.0kPa下減壓抽干5分鐘，最后用10ml甲醇-乙酸乙酯洗脫。將洗脫液40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0mL定溶液渦旋溶解，過0.22μm有機(jī)系濾膜，LC-MS/MS分析。凈化步驟需要50分鐘時(shí)間。配制步驟和凈化步驟共需要80分鐘。實(shí)施例5（效果驗(yàn)證）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性：根據(jù)實(shí)施例1中的方法配制濃度為0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL的六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照實(shí)施例1中的儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，以待測(cè)物定量離子的峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X（μg/L）得到四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)（R2）越接近1，則說明線性關(guān)系越好。如下表2所示：表2標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4土霉素0.9963810.9928330.9932070.996216四環(huán)素0.9932640.9990710.9962380.99712金霉素0.9921420.9986530.994470.994524強(qiáng)力霉素0.9905330.9921450.995740.996588通過上表可以看出，與實(shí)施例4相比，實(shí)施例1-3中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)施例4（國(guó)標(biāo)）效果相當(dāng)，都具有很好的線性關(guān)系。實(shí)施例6（效果驗(yàn)證）。方法回收率試驗(yàn)：以未檢出四環(huán)素類抗生素的牛乳/奶粉作為空白樣品，分別對(duì)空白樣品加標(biāo)做回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度10μg/L、20μg/L、50μg/L和100μg/L。測(cè)得四環(huán)素類抗生素的最終回收率如表3所示，方法回收率可以滿足檢測(cè)的需要。表3方法回收率（%）實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4土霉素10μg/L95.4~105.792.3~96.893.4~102.188.6~110.4土霉素20μg/L93.2~99.193.3~104.592.8~98.694.0~98.7土霉素50μg/L92.4~110.686.1~95.290.7~97.291.5~99.8土霉素100μg/L89.7~107.994.5~99.894.3~105.687.9~96.8四環(huán)素10μg/L84.3~96.579.5~94.187.2~95.682.1~97.0四環(huán)素20μg/L90.4~97.282.7~94.884.6~97.292.6~99.4四環(huán)素50μg/L84.1~98.085.9~97.480.7~96.890.8~104.2四環(huán)素100μg/L92.3~99.890.4~102.588.3~98.888.1~97.7金霉素10μg/L75.2~90.574.2~89.577.0~91.486.3~91.1金霉素20μg/L78.4~93.283.6~93.686.1~95.372.4~87.5金霉素50μg/L82.9~94.780.5~93.782.5~92.886.5~92.8金霉素100μg/L80.6~97.476.0~88.479.7~90.471.0~87.9強(qiáng)力霉素10μg/L90.4~98.092.7~104.688.3~98.586.8~94.3強(qiáng)力霉素20μg/L88.6~96.788.5~97.290.6~100.791.5~112.4強(qiáng)力霉素50μg/L90.9~109.890.0~98.488.6~97.392.4~98.6強(qiáng)力霉素100μg/L86.9~99.289.4~99.791.4~98.590.1~97.5通過上表可以看出，本發(fā)明的實(shí)施例1-3與現(xiàn)有的方法（實(shí)施例4）相比，土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的回收率都很高，都達(dá)到了與現(xiàn)有方法相當(dāng)?shù)男Ч?。?shí)施例7（效果驗(yàn)證）。方法精密度試驗(yàn):分別對(duì)實(shí)施例8中每個(gè)加標(biāo)濃度（10μg/L、20μg/L、50μg/L和100μg/L）的加標(biāo)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），結(jié)果見表4所示。表4方法精密度（RSD%）實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4土霉素10μg/L5.222.115.426.22土霉素20μg/L3.595.365.834.36土霉素50μg/L6.464.874.965.43土霉素100μg/L7.903.055.24.46四環(huán)素10μg/L6.338.694.677.88四環(huán)素20μg/L5.426.204.634.84四環(huán)素50μg/L7.585.496.297.31四環(huán)素100μg/L4.555.195.896.55金霉素10μg/L9.604.915.175.97金霉素20μg/L8.555.747.248.25金霉素50μg/L5.296.395.86.59金霉素100μg/L8.647.217.226.54強(qiáng)力霉素10μg/L4.586.593.587.03強(qiáng)力霉素20μg/L3.264.904.375.69強(qiáng)力霉素50μg/L6.583.347.346.42強(qiáng)力霉素100μg/L7.205.136.197.32通過上表可以看出，現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施例4方法精密度可滿足一般分析工作的需要，本發(fā)明的實(shí)施例1-3在總體上的精密度與實(shí)施例4相當(dāng)。本發(fā)明的實(shí)施例1-3和現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施例4相比，配制步驟和凈化步驟可以分別節(jié)省56%、43%和31%的操作時(shí)間，大大提高了工作效率，降低了工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。在本文中，“示意性”表示“充當(dāng)實(shí)例、例子或說明”，不應(yīng)將在本文中被描述為“示意性”的任何實(shí)施方式解釋為一種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)方案。在本文中，“相等”、“相同”等并非嚴(yán)格的數(shù)學(xué)和/或幾何學(xué)意義上的限制，還包含本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的且生產(chǎn)或使用等允許的誤差。除非另有說明，本文中的數(shù)值范圍不僅包括其兩個(gè)端點(diǎn)內(nèi)的整個(gè)范圍，也包括含于其中的若干子范圍。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書是按照各個(gè)實(shí)施例描述的，但并非每個(gè)實(shí)施例僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方案或變更，如特征的組合、分割或重復(fù)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3