專利名稱：與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類抗生素(tetracycline antibiotics)是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括金霉素(chlotetracycline)、土霉素(oxytetracycline)> 四環(huán)素(tetracycline)及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺基四環(huán)素等，其結(jié)構(gòu)均含并四苯基本骨架。四環(huán)素類抗生素具有如下應(yīng)用作為預(yù)防和治療畜禽疾病的獸藥，作為促進畜禽生長的飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用于治療多種魚類疾病，在乳業(yè)中用于提高奶牛產(chǎn)奶 量，在養(yǎng)蜂業(yè)中用于預(yù)防蜜蜂的感染性疾病。四環(huán)素類抗生素過量使用不可避免的使母體、代謝產(chǎn)物等相關(guān)抗生素殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，影響人體健康。鑒于抗生素的作用與危害并存，動物性食品中四環(huán)素族抗生素的殘留問題受到關(guān)注，各國制定了動物源性食品中獸藥最高殘留標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。我國2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235公告中規(guī)定土霉素/金霉素/四環(huán)素在所有動物性食品的肌肉中的含量不得高于IOOii g/kg，在牛奶及羊奶中的含量也不能超過IOOii g/kg。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR (又稱TetR蛋白)在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了 TetR蛋白在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用；所述TetR蛋白是如下Ca)或(b)或(C)(a)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述TetR蛋白可用于制備檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒。本發(fā)明還保護一種檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒，包括所述TetR蛋白(包被原)。所述試劑盒還包括洗滌液、樣品稀釋液、底物顯色液和終止液中的至少一種。每I升洗滌液可按照如下方法配制得到將IOml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到洗滌液。所述磷酸鹽緩沖液可為PH7. 2-7. 6,0. 005M-0. 015M的磷酸鹽緩沖液，具體可為的濃度可為pH7. 4,0. 01M)的磷酸鈉緩沖液。所述樣品稀釋液可為pH7. 2,0. IM的PBS緩沖液。所述底物顯色液包括顯色液A和顯色液B，可為獨立包裝的顯色液A和顯色液B，也可直接將顯色液A和顯色液B等體積混合得到。所述顯色液可為過氧化氫溶液或過氧化脲溶液；所述顯色液B可為鄰苯二胺(OPD)溶液或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液。所述顯色液A具體可為2% (g/100ml)過氧化脲水溶液。所述顯色液B具體可為1% (g/100ml)四甲基聯(lián)苯胺水溶液。所述終止液具體可為0. 2M硫酸水溶液。所述TetR蛋白可用于制備檢測四環(huán)素類抗生素的試紙條。本發(fā)明還保護一種檢測四環(huán)素類抗生素的試紙條，由樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊組成；沿試紙條的軸向，樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次按順序連接，樣品吸收墊的末端與膠體金墊的始端相連，膠體金墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水塾的始端相連；
所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的N末端具有His標(biāo)簽的所述TetR蛋白；所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)(T線)和質(zhì)控區(qū)(C線)均為與試紙條軸向垂直的條帶狀；檢測區(qū)位于靠近膠體金墊末端的一側(cè)；質(zhì)控區(qū)位于遠離膠體金墊末端的一側(cè)；檢測區(qū)包被有包被原，質(zhì)控區(qū)包被有His-tag單克隆抗體；所述包被原為四環(huán)素與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述試紙條上還可具有樣品孔，所述樣品孔位于樣本吸收墊上遠離膠體金墊末端
的一端。所述載體蛋白具體可為卵清白蛋白(0VA)。以上任一所述TetR蛋白具體可為采用以下方法制備得到的蛋白質(zhì)培養(yǎng)重組菌，得到所述與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR ;所述培養(yǎng)過程中加入IPTG作為誘導(dǎo)劑；所述重組菌為將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。所述重組表達載體具體可為在載體pET28b的多克隆位點插入所述與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR的編碼基因得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達載體更具體可為在載體pET28b的NdeI和XhoI酶切位點之間插入所述編碼基因得到的重組質(zhì)粒。所述編碼基因具體可為如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第4至624位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)所述的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0. I XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述重組菌更具體可為LYP-BLR (又稱重組菌LYP-BLR-6)。LYP-BLR屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli),已于2012年2月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5759。所述方法中，在培養(yǎng)體系的OD6tltl為0. 6時，加入所述IPTG，使IPTG在所培養(yǎng)體系中的濃度為ImM。以上任一所述四環(huán)素類抗生素具體可為具有并四苯骨架的化合物。以上任一所述四環(huán)素類抗生素具體可為四環(huán)素、土霉素、金霉素或強力霉素。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在四環(huán)素類抗生素的檢測中將發(fā)揮重大作用。


圖I為實施例5的步驟三得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。載體pET28b購自德國Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號為69865。大腸桿菌BL21(DE3)購自德國Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號為69387。T4DNALigase購自美國Promega公司，產(chǎn)品目錄號為M1801S。辣根過氧化物酶(HRP)購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。載體PMD19-T購自TAKARA公司，產(chǎn)品目錄號為D102A。His-tag單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號分別為AB102-02和SAlOl-Ol。四環(huán)素購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為87128,結(jié)構(gòu)見式(I )。土霉素購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為05875,結(jié)構(gòu)見式(II )。 金霉素購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為C4881,結(jié)構(gòu)見式(III)。強力霉素購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為44577，結(jié)構(gòu)見式(IV)。
權(quán)利要求
1.TetR蛋白在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.TetR蛋白在制備檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒中的應(yīng)用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
3.—種檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒，包括TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(C) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
4.TetR蛋白在制備檢測四環(huán)素類抗生素的試紙條中的應(yīng)用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
5.一種檢測四環(huán)素類抗生素的試紙條，由樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊組成； 沿試紙條的軸向，樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊依次按順序連接，樣品吸收墊的末端與膠體金墊的始端相連，膠體金墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水塾的始端相連； 所述膠體金墊上包被有膠體金標(biāo)記的N末端具有Hi s標(biāo)簽的TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c): (a)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(C)將(a)或(b)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與四環(huán)素類抗生素結(jié)合的由(a)衍生的蛋白質(zhì)； 所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均為與試紙條軸向垂直的條帶狀；檢測區(qū)位于靠近膠體金墊末端的一側(cè)；質(zhì)控區(qū)位于遠離膠體金墊末端的一側(cè)；檢測區(qū)包被有包被原，質(zhì)控區(qū)包被有His-tag單克隆抗體；所述包被原為四環(huán)素與載體蛋白的偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與四環(huán)素結(jié)合的蛋白TetR(又稱TetR蛋白)在檢測四環(huán)素類抗生素中的應(yīng)用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述TetR蛋白可用于制備檢測四環(huán)素類抗生素的試劑盒或檢測四環(huán)素類抗生素的試紙條。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在四環(huán)素類抗生素的檢測中將發(fā)揮重大作用。
文檔編號G01N33/68GK102680711SQ20121016665
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者徐飛, 李向梅, 李娜, 楊光, 王戰(zhàn)輝, 趙寧 申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司