專利名稱：鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法
鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類藥物為并四苯衍生物，具有十二氫化并四苯基本結(jié)構(gòu)，該類藥物有共同 的四個(gè)環(huán)的母核，其中尤以土霉素、四環(huán)素、金霉素的抗菌譜最廣，對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌均具有較強(qiáng)的抗菌作用。四環(huán)素類藥物可在動(dòng)物體內(nèi)殘留，并隨 魚類、乳制品、蛋等食品進(jìn)入人體，危害人體健康，具體表現(xiàn)為對(duì)人的肺、胃腸、腎臟、皮膚和 骨骼造成損害，尤其是對(duì)兒童的牙齒損害最大。
四環(huán)素類(TCs)藥物作為一種可治療動(dòng)物疾病的藥物或飼料添加劑被廣泛使用， 用于防治腸道感染和促進(jìn)生長，容易誘導(dǎo)耐藥菌株和導(dǎo)致食品殘留。研究發(fā)現(xiàn)該類藥物具 有致突變性和潛在的致癌性，被許多國家列為限量藥物。為此，世界各國針對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物 組織及相關(guān)產(chǎn)品中四環(huán)素類殘留量作出了明確的最高殘留限量規(guī)定，以保障公眾健康。
近年來，日本、澳大利亞等對(duì)畜、禽肉中抗生素殘留問題進(jìn)行了大量研究，日本厚生省要求進(jìn)口畜禽肉中四環(huán)素族殘留量不得超過O. 05mg/kg。澳大利亞規(guī)定 四環(huán)素類總量不得大于O. 3mg/kg。歐盟一律標(biāo)準(zhǔn)為0.01mg/kg。我國早在1991年就出臺(tái) 國標(biāo)對(duì)蜂蜜中四環(huán)素類的最高殘留量進(jìn)行規(guī)定不得大于O. 05mg/kg，也針對(duì)它們?cè)谛笄?肉及水產(chǎn)品中的最高允許殘留量進(jìn)行規(guī)定。
鑒于上述原因，有必要研究掌握四環(huán)素類藥物殘留檢測的有效檢測方法，達(dá)到有 效監(jiān)控其在環(huán)境中殘留，減少對(duì)于人類危害的目的?，F(xiàn)階段對(duì)于四環(huán)素類藥物殘留的檢測 方法多樣，但都包含了樣品前處理過程。前處理方法多為使用提取劑多次提取或有機(jī)溶劑 萃取，之后使用層析柱或者具有吸附性填料的柱子進(jìn)行清洗。此類前處理技術(shù)的關(guān)鍵缺點(diǎn) 是提取過程繁瑣、處理過程耗時(shí)較長。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單有效的鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前 處理方法。
本發(fā)明的一種鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法，包括以下步驟(1)稱取樣品5.00 g，精確至O. 01 g，置于50mL離心管中；(2)加入檸檬酸緩沖溶液20mL，混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；(3)準(zhǔn)確吸取上清液10mL于離心管中，備用；(4)C18固相萃取柱的活化過程如下a.5mL甲醇淋洗，b.5mL檸檬酸緩沖溶液除雜，c.5mL蒸餾水平衡；(5)將步驟(3)中的上清液過柱，先用2mL檸檬酸緩沖溶液淋洗，棄去全部淋洗液；(6)再用O.8ml甲醇，以l-3mL/min的流速洗脫，收集洗脫液；(I)往洗脫液中加入O.1mol/mL乙酸銨緩沖溶液定容至lmL，然后用O. 22mm微孔濾膜 過濾，所得濾液即可上機(jī)檢測；上述檸檬酸緩沖溶液的PH = 3. 5±0.05。
所述檸檬酸緩沖溶液的配制為稱取4. 20g檸檬酸，用蒸餾水溶解，定容至200mL ； 稱取2. 84g磷酸氫二鈉，用蒸餾水溶解，定容至IOOmL ;取160mL檸檬酸溶液與IOOmL磷酸 氫二鈉溶液混合，用鹽酸調(diào)節(jié)PH = 3. 5±0. 05制備緩沖溶液，稱取9. 68g乙二胺四乙酸二 鈉放入上述緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。
所述乙酸銨緩沖溶液的配制為稱取O. 385g乙酸銨，加入ImL甲酸溶液，用蒸餾水 溶解，定容至500mL。
所述四環(huán)素類藥物包括土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素。
本發(fā)明的前處理方法與現(xiàn)有方法相比，具有操作簡單有效、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu) 點(diǎn)，具有很強(qiáng)的可操作性，經(jīng)該方法處理后的待測樣品能夠直接用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為1)目前報(bào)導(dǎo)的大部分四環(huán)素類藥物提取方法是針對(duì)動(dòng)物源性食品中設(shè)計(jì)，而本方法 是針對(duì)鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的一種提取方法；2)目前報(bào)導(dǎo)的大部分提取劑均為EDTA-Mcllvainc緩沖溶液，而本方法采用 EDTA-Mcllvainc緩沖溶液的特定PH值，使四環(huán)素類藥物殘留能夠得到充分的提取，從而能 夠有效的檢測四環(huán)素類藥物殘留；3)國標(biāo)方法用EDTA-Mcllvainc緩沖溶液(PH=4.O)冰水浴超聲提取三次；而本方法用 EDTA-Mcllvainc緩沖溶液(PH=3. 5)室溫下提取一次，從而節(jié)省了提取時(shí)間。
4)國標(biāo)方法用HLB固相萃取柱來提取四環(huán)素類藥物，洗脫液氮吹濃縮至干；而在 本發(fā)明中用C18固相萃取柱來提取四環(huán)素類藥物，洗脫液直接上機(jī)檢測。
具體實(shí)施方式
按照本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容實(shí)施本發(fā)明，所需試劑溶液的配制方法如下 EDTA-Mcllvainc緩沖溶液4. 20g檸檬酸于200mL蒸餾水中+ 2. 84g磷酸氫二鈉于IOOmL 蒸餾水中充分溶解后，取將160mL檸檬酸溶液與IOOmL磷酸氫二鈉溶液混合，調(diào)節(jié)PH = 3. 5±0. 05，加入9. 68gEDTA;乙酸銨緩沖溶液0. 385g乙酸銨+ImL甲酸，用蒸餾水定容 至500mL ;標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稱取土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素各10mg，用甲醇定溶于 IOOml棕色容量瓶中，制成lOOmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液，配制成土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素均為5mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；定量曲線用 甲醇配制定量曲線標(biāo)液，各個(gè)組分的濃度O. 05mg /mL、0.1mg /mL、0. 15 mg/mL、0. 2mg /mL、 0. 25mg/mL ;基質(zhì)混合校準(zhǔn)曲線分別取濃度為5mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL、20mL、30mL、 40mL、50mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)空白樣品進(jìn)行洗脫過柱，過濾得基質(zhì)混合校準(zhǔn)溶液。本方法對(duì)空白 鰻魚樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的測定下限為10.0 mg/kg,達(dá)到國內(nèi)外檢測 四環(huán)素類抗生素的殘留的標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例1(1)稱取5.00 g(精確至O. 01 g)樣品于50 mL離心管中；(2)往上述離心管中加入提取劑(EDTA-Mcllvainc緩沖溶液)20ml；(3)尚心管加蓋振蕩I分鐘,在10000轉(zhuǎn)/分鐘尚心10分鐘；(4)準(zhǔn)確吸取上清液IOml于離心管中，備用；(5)固相萃取柱(SPE小柱C18-200mg/3mL)活化過程a.5ml甲醇活化b.5ml提取劑活化c.5ml蒸餾水活化(6)將4步驟中的上清液過柱,l-3ml/min；(7)準(zhǔn)確吸取2ml提取劑洗脫C18固相萃取柱；(8)準(zhǔn)備吸取O.8ml甲醇洗脫固相萃取柱，收集洗脫液；(9)往洗脫液中加入O.2ml IOmmoI/L乙酸銨緩沖溶液定容至1ml，洗脫液用O. 22mm微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機(jī)檢測。
本發(fā)明的提取方法較EDTA-MclIvainc緩沖溶液(PH=4. O)提取檢測的四環(huán)素類藥物回收率高(見表1)，說明本發(fā)明使四環(huán)素類藥物殘留能夠得到充分的提取，從而能夠有效的檢測四環(huán)素類藥物殘留。且本發(fā)明重復(fù)性好(見表2)，具有很強(qiáng)的可操作性。
表1:EDTA_MclIvainc緩沖溶液PH3. 5與PH4. O的回收率比較
權(quán)利要求
1.一種鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法，其特征在于所述的前處理方法包括以下步驟(1)稱取樣品5.00 g，精確至O. 01 g，置于50mL離心管中；(2)加入檸檬酸緩沖溶液20mL，混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；(3)準(zhǔn)確吸取上清液10mL于離心管中，備用；(4)C18固相萃取柱的活化過程如下a.5mL甲醇淋洗，b.5mL檸檬酸緩沖溶液除雜，c.5mL蒸餾水平衡；(5)將步驟(3)中的上清液過柱，先用2mL檸檬酸緩沖溶液淋洗，棄去全部淋洗液；(6)再用O.8ml甲醇，以l-3mL/min的流速洗脫，收集洗脫液；(7)往洗脫液中加入O.1mol/mL乙酸銨緩沖溶液定容至lmL，然后用O. 22mm微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機(jī)檢測；上述檸檬酸緩沖溶液的PH = 3. 5±0.05。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法，其特征在于所述檸檬酸緩沖溶液的配制為稱取4. 20g檸檬酸，用蒸餾水溶解，定容至200mL ;稱取2.84g磷酸氫二鈉，用蒸餾水溶解，定容至IOOmL ;取160mL檸檬酸溶液與IOOmL磷酸氫二鈉溶液混合，用鹽酸調(diào)節(jié)PH = 3. 5±0. 05制備緩沖溶液，稱取9. 68g乙二胺四乙酸二鈉放入上述緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法，其特征在于 所述乙酸銨緩沖溶液的配制為稱取O. 385g乙酸銨，加入ImL甲酸溶液，用蒸餾水溶解，定容至500mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法，其特征在于 所述四環(huán)素類藥物包括土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供了鰻魚中四環(huán)素類藥物殘留檢測的前處理方法,屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。該方法包括待測樣品的稱量、pH=3.5±0.05檸檬酸緩沖溶液的提取、固相萃取柱的活化、固相萃取柱的洗脫等操作。本發(fā)明操作簡單有效，制備出的樣品溶液可以直接用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測。該前處理方法與現(xiàn)有方法相比,具有操作簡單有效、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的可操作性，有望在商檢及出入境檢驗(yàn)檢疫等行業(yè)大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102998159SQ201210552028
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者邱彬, 周平, 林振宇, 郭隆華, 陳國南 申請(qǐng)人:福州大學(xué)