專利名稱：蛋白質(zhì)二硫鍵色譜在線對接技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程。
目前，人們利用基因重組技術(shù)表達的蛋白質(zhì)已達4000種以上，但真正用于臨床的蛋白質(zhì)卻只有1％左右，其主要的原因是目前表達的蛋白質(zhì)大部分是利用原核尤其是大腸桿菌(E.coli)作為表達系統(tǒng)，表達的蛋白質(zhì)極易形成二硫鍵錯接和形成沒有生物學(xué)活性的包涵體而沉淀于細胞內(nèi)。為了獲得有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，必須對其進行正確地折疊復(fù)性。因此，折疊復(fù)性是絕大多數(shù)原核表達蛋白質(zhì)必須的步驟。折疊的通常辦法是先使用變性劑將包涵體溶解，再使用二硫鍵還原劑將二硫鍵還原。因此，進行折疊時最關(guān)鍵的一步也是最重要的第一步，就是將二硫鍵進行正確的對接，使之形成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。否則，蛋白質(zhì)活性難以恢復(fù)。然而，在目前表達的4000多種蛋白質(zhì)中能夠自發(fā)地形成二硫鍵正確對接的蛋白質(zhì)加上不含二硫鍵的蛋白質(zhì)合計不足5％，其余95％的蛋白質(zhì)在折疊過程中二硫鍵極易形成錯接。由于目前還沒有一個很好的技術(shù)能夠解決二硫鍵正確對接的技術(shù)難題，直接制約了基因重組蛋白質(zhì)利用率的進一步提高，造成了上游工程的巨大浪費。
目前，研究蛋白質(zhì)二硫鍵對接的方法有以下兩類①在溶液中加入一定比例的氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽或通空氣以及加入一些可以促進氧化和還原反應(yīng)的試劑如Cu2+等，它存在三個最大的缺點一是蛋白質(zhì)二硫鍵在分子內(nèi)以及分子間都容易錯接，實驗隨意性較大，條件不易控制；二是在對接過程中，大部分蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，只有一小部分進行對接；三是為了避免沉淀產(chǎn)生，需要100倍左右的稀釋，造成體積大，后處理困難。②二硫鍵異構(gòu)酶法，在蛋白質(zhì)的復(fù)性溶液中加入二硫鍵異構(gòu)酶，幫助錯誤對接的蛋白質(zhì)改正，但該方法在溶液中重新引入了雜蛋白，而且二硫鍵異構(gòu)酶的價格昂貴，只能作為理論研究，不能在實際生產(chǎn)中使用。本發(fā)明建立的二硫鍵色譜在線對接新技術(shù)則可以克服上述的缺陷。
本發(fā)明的目的是利用色譜在線對接技術(shù)解決多年來基因重組蛋白質(zhì)表達后二硫鍵無法進行對接的技術(shù)難題，使基因工程表達的蛋白質(zhì)在折疊時二硫鍵能夠進行正確的對接。提高基因重組表達蛋白質(zhì)的臨床使用率，降低整個生物技術(shù)上游產(chǎn)業(yè)的成本，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。為基因重組蛋白質(zhì)盡快地從實驗室走向臨床提供技術(shù)上的支撐。
本發(fā)明的優(yōu)點為1．有高的正確對接效率和質(zhì)量回收率；2．二硫鍵在色譜上進行二硫鍵對接的濃度高，體積比較小，后處理比較方便；3．色譜法將二硫鍵對接、蛋白質(zhì)復(fù)性和純化三者集為一身，使原來需要幾步操作才能完成的工作，在色譜上一步就可以完成，大大簡化了生產(chǎn)工藝。4．色譜方法很容易實現(xiàn)自動化，二硫鍵的對接程度可以實現(xiàn)人為的控制，容易進行工業(yè)化生產(chǎn)；5．成本低，色譜填料可循環(huán)使用100-1000次左右，大大將低了生產(chǎn)的成本。從以上可以看出，色譜法作為蛋白質(zhì)二硫鍵對接的方法具有高效、快速、成本低、易控制、可實現(xiàn)自動化的優(yōu)點。
本發(fā)明的技術(shù)方案所謂的“二硫鍵色譜在線對接技術(shù)”就是利用蛋白質(zhì)在色譜填料上進行吸附-解析的過程(即分離純化)的同時實現(xiàn)二硫鍵正確對接的技術(shù)。蛋白質(zhì)二硫鍵在色譜上可以實現(xiàn)在線對接的理論依據(jù)是①蛋白質(zhì)分子在色譜柱上進行吸附時是以單分子層分布在填料表面上，避免了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，表現(xiàn)出兩個最大的優(yōu)點一是當加入的二硫鍵對接試劑時，由于分子之間的相互作用被避免，避免了分子之間二硫鍵錯接，二硫鍵就只能在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部進行對接，大大提高了二硫鍵正確對接的效率；二是由于分子間的相互作用被避免，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間就不會相互聚集產(chǎn)生沉淀，從根本上避免了傳統(tǒng)折疊復(fù)性方法的大部分蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀的副反應(yīng)，確保了表達的蛋白質(zhì)都可以進行分子內(nèi)的二硫鍵的對接，提高了二硫鍵對接蛋白質(zhì)的數(shù)目。由于對接數(shù)目和正確對接比例的提高，使得色譜在線對接技術(shù)可以有一個高的對接效率。②從我們以前研究色譜熱力學(xué)的結(jié)果提示，蛋白質(zhì)在進行分子內(nèi)二硫鍵對接時，色譜填料本身具有迫使蛋白質(zhì)二硫鍵進行正確對接的趨勢，蛋白質(zhì)的復(fù)性就是利用該規(guī)律。③即使部分蛋白質(zhì)二硫鍵不能形成分子內(nèi)的正確對接，由于正確對接和不正確對接的蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，利用色譜本身是用于分離蛋白質(zhì)的特點，可在色譜上使兩者得到完全的分離。不正確對接的蛋白質(zhì)可通過設(shè)計一個自動回收裝置使其在色譜上進行重新的對接，經(jīng)過2-3次循環(huán)，不正確對接的蛋白質(zhì)就可完全正確對接。另外，由于色譜是一個自動化程度很高的儀器，因此二硫鍵在色譜上實現(xiàn)對接時的對接效果可以通過改變色譜條件進行人為地控制。該技術(shù)是一個通用性的技術(shù)，適合于所有的蛋白質(zhì)，能夠使用該技術(shù)的色譜方法包括離子交換色譜、疏水作用色譜和親和色譜。
1)填料的選擇所用的填料必須能在高濃度變性劑存在的條件下使用，并能對處于變性和還原狀態(tài)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生吸附作用。吸附的作用力包括親和力、靜電力和疏水作用力。離子交換、親和、疏水作用的軟膠和硬膠填料均可使用。
2)流動相的選擇離子交換流動相、疏水色譜流動相、親和色譜流動相。
3)氧化對接試劑的使用氧化對接試劑，包括氧化性谷胱苷肽、二硫鍵異構(gòu)酶、氧氣等氧化試劑和二硫鍵異構(gòu)試劑。
4)方法選擇合適的填料，將處于高濃度變性劑和還原狀態(tài)的蛋白質(zhì)吸附在填料的表面，利用流動相除去變性劑，或在部分變性劑存在條件下加入氧化對接試劑，在色譜填料上作用20分鐘以上，在極低的流速或停留狀態(tài)下進行充分的氧化對接，之后利用色譜本身具有復(fù)性和分離的特點使蛋白質(zhì)復(fù)性和分離。
實施例例1溶菌酶的二硫鍵對接溶菌酶溶于8mol/L的鹽酸胍和10mmol/L的DTT中，放置過夜，使蛋白質(zhì)完全處于變性的二硫鍵還原狀態(tài)，在疏水作用色譜柱上進行吸附，使用還原性谷胱苷肽和氧化性谷胱苷肽以極低的流速通過色譜柱，或停留一段時間，使用流動相進行洗脫。溶菌酶二硫鍵得到正確對接和完全的復(fù)性。
例2基因重組干擾素-α的對接將基因重組干擾素-α使用溶于8mol/L的鹽酸胍和10mmol/L的DTT中，放置過夜，使蛋白質(zhì)完全處于變性的二硫鍵還原狀態(tài)，在離子交換色譜作用色譜柱上進行吸附，使用還原性谷胱苷肽和氧化性谷胱苷肽以極低的流速通過色譜柱，或停留一段時間，使用流動相進行洗脫。干擾素的二硫鍵得到正確對接和完全的復(fù)性。
權(quán)利要求
1．蛋白質(zhì)二硫鍵色譜在線對接技術(shù)，其特征是選擇合適的填料和流動相對蛋白質(zhì)的二硫鍵在色譜上進行對接、復(fù)性和分離。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)二硫鍵色譜在線對接技術(shù)，其特征是所述的填料為離子交換、親和、疏水作用的軟膠和硬膠填料；所述的流動相可為離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜的流動相；所述的氧化對接試劑為氧化性谷胱苷肽、二硫鍵異構(gòu)酶、氧氣。
全文摘要
蛋白質(zhì)二硫鍵色譜在線對接技術(shù)，涉及生物工程，其特征是利用親和、疏水、離子交換色譜吸附蛋白質(zhì)的特性，對處于還原狀態(tài)蛋白質(zhì)的二硫鍵進行在線對接，提高蛋白質(zhì)二硫鍵對接效率和復(fù)性效果。
文檔編號C07K1/00GK1316430SQ00113769
公開日2001年10月10日 申請日期2000年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月3日
發(fā)明者郭立安 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)