一種畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，該方法包括對(duì)新鮮畜禽血抗凝，分離出血漿和血紅蛋白溶液，合并后依次加入第一種蛋白變性劑、二硫鍵還原劑、第二種蛋白變性劑，通過(guò)精確控制水解條件達(dá)到限量水解目標(biāo)，獲得無(wú)異味的BAPs。該產(chǎn)品劑型多樣，性能穩(wěn)定，經(jīng)壓力蒸汽滅菌，常溫貯存，無(wú)菌有效期可達(dá)2年以上，貯存、運(yùn)輸方便。該生物活性肽應(yīng)用于美容醫(yī)學(xué)治療痤瘡，有效率達(dá)90%以上，還可廣泛用于開(kāi)發(fā)肽類試劑、肽類藥物以及功能食品和食品添加劑等；本發(fā)明方法大大簡(jiǎn)化了工藝流程、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，BAPs含量高達(dá)100g/L左右，回收率在70%以上，適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)，原料來(lái)源充足，易于形成產(chǎn)業(yè)化。
【專利說(shuō)明】一種畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽 BAPs和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物活性肽（bioactive peptides, BAPs)【技術(shù)領(lǐng)域】；具體涉及一種畜 禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 畜禽血來(lái)源廣泛，其中蛋白質(zhì)含量約19%，營(yíng)養(yǎng)豐富，與畜禽肉相近，故有"液體肉" 之美譽(yù)，具有很高的生物效價(jià)。畜禽血經(jīng)抗凝可分離出約60%的血漿(含蛋白質(zhì)約8%)和約 40%的血細(xì)胞(主要為紅細(xì)胞，含蛋白質(zhì)約36%)。紅細(xì)胞經(jīng)溶血后釋放出血紅蛋白，約占全 血蛋白質(zhì)總量的75%。畜禽血蛋白質(zhì)不但氨基酸組成平衡，必需氨基酸含量達(dá)50%以上，而 且這些蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈中含有一些在組織水平上引起機(jī)體生物學(xué)效應(yīng)的活性肽，如 阿片樣肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽等。新鮮畜禽血中的蛋白質(zhì)通過(guò)限 量水解處理后，可以將在母體蛋白中那些沒(méi)有體現(xiàn)生物學(xué)活性的肽段釋放出來(lái)，獲得對(duì)機(jī) 體具有降血壓、抗氧化、抗菌消炎和增強(qiáng)免疫活性等生物學(xué)效應(yīng)的活性肽及其它一些肽鏈 長(zhǎng)度不等的肽類混合物。該肽類混合物不僅能提供人體組織生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還 具有抗感染、抗衰老、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效。因而有可能從畜禽血中生產(chǎn)出滿足人們特 定需求的活性肽，為人類更充分地利用蛋白質(zhì)資源開(kāi)辟一條新的途徑。
[0003] 幾十年來(lái)，人們對(duì)畜禽血，特別是豬血的利用，一直在進(jìn)行不斷地開(kāi)發(fā)。開(kāi)始還只 是以少數(shù)制作血豆腐、豬血餅、血面條和用于肉類似物、香腸、布丁等的配方中，繼后有一小 部分被加工成血粉或發(fā)酵血粉，作為飼料添加劑和用于生化制藥，生產(chǎn)血紅素、蛋白胨等。 由于其色澤不好，血腥味重，適口性差等原因，我國(guó)對(duì)豬血的利用率并不高，相當(dāng)大一部分 被廢棄，既造成巨大浪費(fèi)，又污染環(huán)境。
[0004] 隨著蛋白肽理論的發(fā)展和人們對(duì)畜禽血化學(xué)成分認(rèn)識(shí)的深入，相繼發(fā)現(xiàn)：①畜禽 血蛋白質(zhì)經(jīng)酶促限量水解后主要以小分子肽的形式存在，比完全游離的氨基酸更易、更快 被機(jī)體吸收利用，這是肽理論和實(shí)踐的重大突破。這些小分子肽易溶解、低黏度、抗凝膠形 成性、免消化、能完整地通過(guò)腸道直接吸收，適用于不能消化和吸收完整蛋白質(zhì)的腎病、胃 病和肝病等病人，可以作為他們膳食中蛋白質(zhì)的主要形式；②小分子肽抗原性低，可以避免 完整蛋白引起的免疫調(diào)節(jié)過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)人體無(wú)過(guò)敏性，不會(huì)增加肝臟和腎臟的負(fù)擔(dān)；③血紅 蛋白和血漿蛋白酶解產(chǎn)物中含有阿片樣肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽、 免疫調(diào)節(jié)肽、促進(jìn)鈣吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽等活性肽，具有對(duì)人體的心血管系統(tǒng)、 消化系統(tǒng)、免疫及神經(jīng)等系統(tǒng)產(chǎn)生重要的生理調(diào)節(jié)作用。
[0005] 近20多年來(lái)，人們?cè)诓粩嗟刂铝τ谔剿鲗ふ乙环N合適的方法，對(duì)畜禽血進(jìn)行處理 制備小分子活性肽。隨著生物酶技術(shù)的迅速發(fā)展，利用蛋白酶水解畜禽血以提高其利用率 的研究也越來(lái)越多，可供選擇水解畜禽血的蛋白酶種類也多。由于蛋白酶作用存在專一性， 單一的蛋白酶對(duì)一種蛋白質(zhì)的水解效果往往有一定的局限性，而且在酶解過(guò)程中產(chǎn)生了大 量疏水性氨基酸外露的小肽，使得酶解產(chǎn)物具有很重的苦味，嚴(yán)重限制了該方法的使用和 推廣。為了達(dá)到較高的水解效果，以降低成本，提高經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，人們探討了各種因素對(duì)復(fù) 合酶水解畜禽血紅蛋白的影響，對(duì)獲得的某些活性肽進(jìn)行分離、純化、測(cè)定。所有這些工作 基本上都集中在對(duì)血紅蛋白的開(kāi)發(fā)研究上，對(duì)占全血總蛋白約25%的血漿蛋白并未見(jiàn)有報(bào) 導(dǎo)，基本都被廢棄浪費(fèi)。實(shí)際上血紅蛋白與血漿蛋白合并，制備混合蛋白水解產(chǎn)物，這才是 目前國(guó)內(nèi)外畜禽血綜合利用的主要方向。在歐洲、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，豬血的利用率已經(jīng)達(dá)到 50%以上，他們主要是開(kāi)發(fā)肽類試劑、肽類藥物以及功能食品和食品添加劑。
[0006] 盡管前段人們對(duì)畜禽血常用的酶解工藝進(jìn)行了一些改進(jìn)，也取得了一定的效果， 但真正推廣的成果并不多。即便有成果轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的，規(guī)模也不大。究其原因，主要存在有 以下幾個(gè)方面的問(wèn)題。
[0007] (1)酶的產(chǎn)量有限，成本較高：酶的制備主要有直接提取和微生物發(fā)酵兩種方法。 直接提取法一般是以動(dòng)植物作為原料，從中直接提?。晃⑸锇l(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵來(lái) 生產(chǎn)。直接提取法由于動(dòng)植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，又受地理、氣候和季節(jié)等因素的影響，原料來(lái)源 受到限制,酶產(chǎn)量有限,生產(chǎn)成本較高；微生物發(fā)酵法雖然酶產(chǎn)量較大,生產(chǎn)成本也較低,但 由于蛋白酶作用存在專一性，單一種酶往往對(duì)一種蛋白質(zhì)的水解有一定的局限性。在實(shí)際 應(yīng)用中，為了獲得較好的水解率，往往需要采用數(shù)種酶共同作用。因此，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的 酶還不能完全替代直接提取法制備的某些酶。
[0008] (2)生產(chǎn)周期長(zhǎng)，工藝繁瑣：酶解時(shí)間一般需要8小時(shí)以上，有的甚至長(zhǎng)達(dá)20多小 時(shí)；每種酶都有各自的最適pH值，而酶解液的pH值隨著酶解反應(yīng)中游離氨基含量逐漸升高 而改變，在生產(chǎn)過(guò)程中需要不斷地調(diào)整酶解液的pH值。因此，很難發(fā)展成規(guī)?；a(chǎn)。
[0009] (3)產(chǎn)物濃度低，增加了后續(xù)處理的困難和成本：在酶解反應(yīng)的初始階段，隨著底 物濃度的提高酶解反應(yīng)速度加快，但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)酶解平衡點(diǎn)后，反而抑制了酶解反應(yīng) 的進(jìn)行。為保證較高的底物水解率和酶解反應(yīng)速度，一般選擇在30?80g/L作為最適的底 物濃度。因此，酶解反應(yīng)液中目標(biāo)產(chǎn)物含量低，必須進(jìn)行濃縮處理。一般先采用微濾澄清， 再采用超濾濃縮，這樣顯然大大增加了生產(chǎn)工藝的難度和成本。
[0010] (4)產(chǎn)品去味、脫色存在損耗、成本和安全等問(wèn)題：畜禽血的酶解液有較重的苦腥 味，適口性差，氣味難聞，加上血紅素的存在，顏色呈棕褐色，產(chǎn)品必須進(jìn)行去味、脫色處理。 國(guó)內(nèi)外的一些資料介紹，去味脫色一般采用：①活性炭吸附技術(shù)，活性炭雖然成本不高，脫 色去味效果也比較滿意，但產(chǎn)物的損耗率高達(dá)60% ;②大孔樹(shù)脂、羧甲基纖維素法，此法成 本較高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；③過(guò)氧化氫氧化法，此法不可避免地會(huì)使某些目標(biāo)產(chǎn)物肽氧 化，而且殘留的過(guò)氧化氫會(huì)影響到醫(yī)藥和食品的安全。
[0011] 因此，很有必要探尋一種高效的水解提取方法，對(duì)畜禽血蛋白進(jìn)行精確控制的限 量水解，將在母體蛋白中那些沒(méi)有體現(xiàn)生物學(xué)活性的肽段釋放出來(lái)，提取出具有前述各種 生物學(xué)功能的生物活性肽類物質(zhì)，為解決畜禽血在醫(yī)藥、試劑和功能食品的規(guī)模化生產(chǎn)奠 定基礎(chǔ)。
[0012] 如前所述，畜禽血不但富含蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且選擇性的酶解提取物一活 性肽具有某些生物學(xué)功能，國(guó)內(nèi)外的研究和應(yīng)用主要是開(kāi)發(fā)肽類試劑、肽類藥物以及功能 食品和食品添加劑。經(jīng)檢索尚未發(fā)現(xiàn)有在美容醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用于治療痤瘡的報(bào)導(dǎo)。
[0013] 痤瘡又稱青春痘、暗瘡，是好發(fā)于青春期的一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮 膚病。臨床表現(xiàn)為粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫，多見(jiàn)于面部、胸背部等皮脂溢出區(qū)。治療不 當(dāng)容易遺留瘢痕和色素沉著等損容性的皮膚損害，嚴(yán)重影響患者的身心健康。痤瘡的發(fā)生 是多種因素綜合作用的結(jié)果，主要是由于皮脂分泌過(guò)多，雄激素分泌增高或雄、雌激素水平 失衡，毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化過(guò)度及痤瘡丙酸桿菌增殖所致，其中痤瘡丙酸桿菌在痤瘡的多 個(gè)致病環(huán)節(jié)中起重要作用。
[0014] 痤瘡丙酸桿菌是一種革蘭染色陽(yáng)性的厭氧菌，是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，它可以分泌 蛋白質(zhì)、酶、脂多糖等成分，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，所有這些都能作為致病因素。在穩(wěn)定生 長(zhǎng)階段的痤瘡丙酸桿菌可以刺激單層角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-I a、TNF_a和GM-CSF， 這些細(xì)胞因子可以趨化炎細(xì)胞到毛囊周圍，引起炎癥損傷，是炎性尋常型痤瘡的發(fā)病機(jī)理 之一。痤瘡丙酸桿菌還可以在沒(méi)有任何刺激的條件下產(chǎn)生大量的細(xì)胞內(nèi)卟啉，主要是糞卟 啉。在紫外線照射下，皮膚表面的痤瘡丙酸桿菌糞卟啉可以產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致嚴(yán)重的皮膚損 害。
[0015] 目前，市場(chǎng)上對(duì)痤瘡的治療可謂種類繁多，然而美容醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，由于抗生素的 不恰當(dāng)使用，導(dǎo)致了大量的對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性痤瘡丙酸桿菌的出現(xiàn)，很大程度上影響了 治療效果。因此，開(kāi)發(fā)天然的不易耐藥和安全性高的外用抗痤瘡丙酸桿菌藥物，成了治療痤 瘡的主要手段之一。痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖必須有一個(gè)厭氧的環(huán)境，而毛囊皮脂腺導(dǎo)管 角化過(guò)度，再加上皮脂分泌過(guò)多，使毛囊細(xì)胞粘連且不能正常移行于皮膚表面，形成適合痤 瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)繁殖的局部厭氧環(huán)境，其結(jié)果導(dǎo)致痤瘡久治難愈，而且容易復(fù)發(fā)。因此，根 治痤瘡不但要?dú)琊畀彵釛U菌，而且還要鏟除其生存和繼續(xù)繁殖的厭氧環(huán)境。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效的、適用于規(guī)模化生產(chǎn)的畜禽血（包括血漿蛋白 和血紅蛋白）中生物活性肽BAPs的提取方法。
[0017] 本發(fā)明的目的還在于提供利用上述生物活性肽BAPs的提取方法制備獲得的生物 活性肽。
[0018] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述畜禽血中生物活性肽BAPs在醫(yī)學(xué)美容中治 療痤瘡的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)在于： 1、 應(yīng)用蛋白變性劑和二硫鍵還原劑對(duì)畜禽血蛋白進(jìn)行水解的過(guò)程中，通過(guò)精確控制水 解條件達(dá)到限量水解目標(biāo)，即既能將那些在母體蛋白中沒(méi)有體現(xiàn)生物學(xué)活性的肽段最大限 度地釋放出來(lái)，又不至于水解過(guò)度使釋放出來(lái)的這些具有生物學(xué)活性的肽段再失去活性； 2、 用生物化學(xué)方法取代活性炭吸附、微濾和超濾方法，將血紅素與目標(biāo)產(chǎn)物分離，大大 簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，以適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)。
[0020] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種畜禽血中BAPs的提取 方法，包括以下步驟： (1) 采取新鮮畜禽血，加入抗凝劑，混勻抗凝，離心，分離血漿和含紅細(xì)胞的不溶物，分 別收集； (2) 向步驟（1)所得的含紅細(xì)胞的不溶物中加入純水，攪勻后進(jìn)行冷凍處理，解凍后再 進(jìn)行均質(zhì)處理或超聲波處理，徹底破碎紅細(xì)胞，使血紅蛋白溶出，離心，除去含紅細(xì)胞膜碎 片的不溶物，收集血紅蛋白溶液； (3) 將步驟（1)所得血漿和步驟（2)所得血紅蛋白溶液合并，加入第一種蛋白變性劑至 終濃度為〇. 5?5. O mol/L，70?KKTC處理3?5小時(shí)，冷卻至室溫； (4) 向步驟（3)所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入二硫鍵還原劑至終濃度為0. 2?0. 5mmol/L，80? 100°C處理20?40min，冷卻至室溫，用透析法除去反應(yīng)后產(chǎn)物中殘留的試劑； (5) 向步驟（4)所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入第二種蛋白變性劑至終濃度為0. 3?0. 8mol/L， 105?125°C蒸汽壓力中處理10?30min，冷卻至室溫； (6) 用酸試劑調(diào)節(jié)步驟（5)所得反應(yīng)產(chǎn)物的pH為3. 0?4. 2,靜置，收集上清液； (7) 用堿試劑調(diào)節(jié)步驟（6)所得上清液的pH為6. 8?7. 2,獲得無(wú)異味的微黃色生物 活性肽BAPs ; (8) 將步驟（7)所得生物活性肽BAPs滅菌，制得畜禽血液相劑型生物活性肽BAPs ; (9) 將步驟（8)所得畜禽血液相劑型BAPs進(jìn)行干燥處理，制得畜禽血固相劑型生物活 性肽BAPs。
[0021] 在上述畜禽血中BAPs的提取方法中： 步驟（1)中所述的畜禽血優(yōu)選為豬血、牛血或鵝血等；所述的抗凝劑優(yōu)選為檸檬酸鈉、 檸檬酸鉀或草酸鉀等，添加量?jī)?yōu)選為〇. 35~1. 20kg/每100L新鮮畜禽血；離心時(shí)的離心力優(yōu) 選為200(T2500Xg，離心時(shí)間優(yōu)選為5?lOmin。
[0022] 步驟（2)中純水的加入量?jī)?yōu)選為含紅細(xì)胞的不溶物總體積的5~15%，冷凍處理的 溫度優(yōu)選為-15°C?_25°C，冷凍處理的時(shí)間優(yōu)選為6?24h ;均質(zhì)處理的壓力優(yōu)選為40? 80Mpa，處理時(shí)間優(yōu)選為5?IOmin ;超聲波處理的功率優(yōu)選為800?1500W，處理時(shí)間優(yōu)選 為5?IOmin ;離心時(shí)的離心力優(yōu)選為3000?4000 Xg,離心時(shí)間優(yōu)選為10?20min。
[0023] 步驟（3)中所述的第一種蛋白變性劑優(yōu)選為N2H4CCK C12H25SO4Na或CH6ClN3 ;步驟 (4)中所述的二硫鍵還原劑優(yōu)選為C3H7N02S、C4H ltlO2S2或C4H4S 2O4Na2 (二巰基丁二酸鈉)。
[0024] 步驟（5)中所述的第二種蛋白變性劑優(yōu)選為KOH、NaOH或Ca(OH)2，步驟（6)中所 述的酸試劑優(yōu)選為HCl、H 2S04、HClO4或Cl3C2O 2H，步驟（7)中所述的堿試劑優(yōu)選為Na0H、K0H 或 Ca(0H)2。
[0025] 經(jīng)步驟（3)?（7)處理，畜禽血的蛋白水解率控制在2(Γ24%。
[0026] 步驟（8)中滅菌處理優(yōu)選采用在12(Tl25°C蒸汽中高壓15~25min，進(jìn)一步優(yōu)選在 121°C蒸汽中高壓20min，制得畜禽血液相劑型生物活性肽BAPs。
[0027] 步驟（9)中干燥處理可以采用冷凍干燥或噴霧干燥，優(yōu)選噴霧干燥。
[0028] 蛋白水解率通過(guò)以下公式計(jì)算：蛋白水解率（％)= (TAN產(chǎn)物一 TANbw)/ (TNbw - TAN原料）X 100, BAPs提取物回收率（％)= TBAPs/TPr原料X 100,其中TAN產(chǎn)物指用甲醛滴定法 測(cè)定的步驟（7)中生物活性肽BAPs氨基氮總含量，TANbw是指用甲醛滴定法測(cè)定的步驟（3) 中血漿與血紅蛋白溶液合并原料中氨基氮總含量，TN是指步驟（3)中血漿與血紅蛋白溶 液合并原料中蛋白氮總含量，TN原料=TPr原料X 16% (蛋白質(zhì)中平均氮含量為16%)，TPr原料是 指用雙縮脲法測(cè)定的步驟（3)中血漿與血紅蛋白溶液合并原料中蛋白總含量，TBAPs是指 用雙縮脲法測(cè)定的步驟（7)中所得生物活性肽BAPs總含量。
[0029] 蛋白水解率可作為控制和調(diào)整蛋白水解條件的指標(biāo)，以求達(dá)到限量水解目標(biāo)； BAPs提取物回收率可作為優(yōu)化和改進(jìn)生產(chǎn)工藝的指標(biāo)，以求達(dá)到最大限度收益。
[0030] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：利用上述畜禽血中生物活性 肽BAPs的提取方法制備獲得的生物活性肽BAPs。
[0031] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述生物活性肽BAPs在 美容醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中制備具有治療痤瘡功效的藥物中的用途。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：大大簡(jiǎn)化了工藝流程，降低了生產(chǎn)成本， 提高了產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，其中生物活性肽BAPs含量高達(dá)100g/L左右，回收率在70%以 上，能適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)，原料來(lái)源充足，易于形成產(chǎn)業(yè)化。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，以下原料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售 產(chǎn)品。
[0034] 實(shí)施例1 本實(shí)施例提供的豬血中生物活性肽BAPs的提取方法，包括以下步驟： (1) 檢疫合格的新鮮豬血50L，加入檸檬酸鈉180g，混合均勻抗凝，離心力2400 X g離心 6min，分離血漿和紅細(xì)胞等不溶物，分別收集； (2) 向步驟（1)處理所得紅細(xì)胞等不溶物中加入純水2L，攪拌均勻，置-23°C冷凍20h， 解凍后用超聲波機(jī)，功率1200W超聲處理lOmin，徹底破碎紅細(xì)胞，使血紅蛋白溶出，離心力 3900 Xg離心12min，除去紅細(xì)胞膜碎片等不溶物，收集血紅蛋白溶液； (3) 將步驟（1)處理所得血漿與步驟（2)處理所得血紅蛋白溶液合并，加入N2H4CO至終 濃度3. 5mol/L，95°C處理4. 5小時(shí)，冷卻至室溫； (4) 向步驟（3)處理所得產(chǎn)物中加入C3H7NO2S至終濃度0. 24mmol/L，98°C處理38min， 冷卻至室溫，用透析法除去反應(yīng)后產(chǎn)物中殘留的N2H4CO和C 3H7NO2S ; (5) 向步驟（4)處理所得產(chǎn)物中加入KOH至終濃度0. 72mol/L，在106°C壓力蒸汽中處 理25min,冷卻至室溫； (6) 對(duì)步驟（5)處理所得產(chǎn)物用C2HCl3O2調(diào)pH至3. 4,靜置，收集上清液； (7) 對(duì)步驟（6)處理所得上清液用KOH調(diào)pH至7. 1，得無(wú)異味的微黃色BAPs提取物， 經(jīng)測(cè)定，蛋白水解率為23. 6%，BAPs提取物含量為102. 7g/L，BAPs提取物回收率為72. 7% ; (8) 對(duì)步驟（7)處理所得BAPs提取物，在121°C蒸汽中高壓20min滅菌，制得豬血液相 劑型BAP ; (9) 對(duì)步驟（8)處理所得豬血液相劑型BAPs噴霧干燥，制得豬血固相劑型BAPs。
[0035] 蛋白水解率和BAPs提取物回收率的計(jì)算方法如下（以下實(shí)施例同）： 用雙縮脲法測(cè)定步驟（3)血漿與血紅蛋白溶液合并原料中蛋白總含量（TPr帛44)，TPr β X 16%(蛋白質(zhì)中平均氮含量為16%)= ΤΝ_ (原料中蛋白氮總含量)，用甲醛滴定法測(cè)定步 驟（3)血漿與血紅蛋白溶液合并原料中氨基氮總含量（TAN 用雙縮脲法測(cè)定步驟（7)處 理所得產(chǎn)物中BAPs提取物總含量（TBAPs)，用甲醛滴定法測(cè)定步驟（7)處理所得產(chǎn)物BAPs 提取物中氨基氮總含量（TANpfe); 蛋白水解率（％)= (TAN產(chǎn)物一TAN原料）/ (TN原料一TAN原料）X 100 BAPs提取物回收率（％) = TBAPs/ TPr原料X 100 ; 實(shí)施例2 本實(shí)施例提供的牛血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步驟： (1) 檢疫合格的新鮮牛血10L，加入檸檬酸鉀37g，混合均勻抗凝，離心力2300 X g離心 7min，分離血漿和紅細(xì)胞等不溶物，分別收集； (2) 向步驟（1)處理所得紅細(xì)胞等不溶物加入純水400mL，攪拌均勻，置-20°C冷凍12h， 解凍后用均質(zhì)機(jī)在壓力60Mpa下均質(zhì)處理8min，徹底破碎紅細(xì)胞，使血紅蛋白溶出，離心力 3800 Xg離心15min，除去紅細(xì)胞膜碎片等不溶物，收集血紅蛋白溶液； (3) 將步驟（1)處理所得血漿與步驟（2)處理所得血紅蛋白溶液合并，加入CH6ClN3至 終濃度4. Omol/L，72°C處理4. 0小時(shí)，冷卻至室溫； (4) 向步驟（3)處理所得產(chǎn)物中加入C4HltlO2S2至終濃度0. 37mmol/L，92°C處理27min， 冷卻至室溫，用透析法除去反應(yīng)后產(chǎn)物中殘留的CH6ClN 3和C4HltlO2S2 ; (5) 向步驟（4)處理所得產(chǎn)物中加入NaOH至終濃度0. 48mol/L，在124°C高壓蒸汽中處 理15min,冷卻至室溫； (6) 對(duì)步驟（5)處理所得產(chǎn)物用HClO4調(diào)pH至4. 0,靜置，收集上清液； (7) 對(duì)步驟（6)處理所得上清液用KOH調(diào)pH至6. 9,得無(wú)異味的微黃色生物活性肽 BAPs，經(jīng)測(cè)定，蛋白水解率為21. 8%，生物活性肽BAPs含量為101. 2g/L，生物活性肽BAPs回 收率為70. 9% ; (8) 對(duì)步驟（7)處理所得生物活性肽BAPs，在121°C蒸汽中高壓20min滅菌，制得牛血 液相劑型生物活性肽BAPs ; (9) 對(duì)步驟（8)處理所得牛血液相劑型生物活性肽BAPs噴霧干燥，制得牛血固相劑型 生物活性肽BAPs。
[0036] 實(shí)施例3 本實(shí)施例提供的鵝血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步驟： (1) 檢疫合格的新鮮鵝血5L，加入草酸鈉50g，混合均勻抗凝，離心力2100Xg離心 8min，分離血漿和紅細(xì)胞等不溶物，分別收集； (2) 向步驟（1)處理所得紅細(xì)胞等不溶物中加入純水200mL，攪拌均勻，置-18°C冷凍 8h，解凍后用均質(zhì)機(jī)在壓力60Mpa下均質(zhì)處理7min，徹底破碎紅細(xì)胞，使血紅蛋白溶出，離 心力3500 Xg離心18min，除去紅細(xì)胞膜碎片等不溶物，收集血紅蛋白溶液； (3) 將步驟（1)處理所得血漿與步驟（2)處理所得血紅蛋白溶液合并，加入C12H25SO 4Na 至終濃度〇. 6mol/L，85°C處理3. 6小時(shí)，冷卻至室溫； (4) 向步驟（3)處理所得產(chǎn)物中加入C4H4S2O4Na 2至終濃度0. 45mmol/L，84°C處理30min， 冷卻至室溫，用透析法除去反應(yīng)后產(chǎn)物中殘留的C12H 25SO4Na和C4H4S20 4Na2。
[0037] (5)向步驟（4)處理所得產(chǎn)物中加入Ca(OH)2至終濃度0· 32mol/L，在115°C壓力 蒸汽中處理20min，冷卻至室溫； (6) 對(duì)步驟（5)處理所得產(chǎn)物用HCl調(diào)pH至3. 8,靜置，收集上清液； (7) 對(duì)步驟（6)處理所得上清液用NaOH調(diào)pH至7. 0,得無(wú)異味的微黃色生物活性肽 BAPs，經(jīng)測(cè)定，蛋白水解率為22. 5%，生物活性肽BAPs含量為99. 6g/L，生物活性肽BAPs回 收率為70. 1% ; (8) 對(duì)步驟（7)處理所得生物活性肽BAPs，在121°C蒸汽中高壓20min滅菌，制得鵝血 液相劑型生物活性肽BAPs ; (9) 對(duì)步驟（8)處理所得鵝血液相劑型生物活性肽BAPs噴霧干燥，制得鵝血固相劑型 生物活性肽BAPs。
[0038] 應(yīng)用實(shí)施例1制得的豬血固相劑型BAPs對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌效果觀察 改良的GAM瓊脂培養(yǎng)基，115°C蒸汽中高壓15min滅菌，加入5%羊血，傾倒在平板培養(yǎng) 皿內(nèi)，以此用作凍干菌株的復(fù)蘇平板。利用平板劃線法將痤瘡丙酸桿菌凍干菌株（ATCC 11827)接種至復(fù)蘇平板內(nèi)，37°C厭氧培養(yǎng)72h后，挑取單個(gè)生長(zhǎng)的菌落用生理鹽水稀釋成 〇· 5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬s為I. 5X 108cfu/mL)濃度的菌懸液。
[0039] 通過(guò)無(wú)菌操作，取實(shí)施例1制得的豬血固相劑型BAPs用滅菌蒸餾水溶解，調(diào)整含 量為10mg/mL。取無(wú)菌試管8支，依次編為1?8號(hào)。在第1，3?8管中各加滅菌蒸餾水 3mL，在第2、3管中各加上述BAPs溶液3mL，第3?7管依次作倍比稀釋，即第3管溶液混勻 后，吸取3mL加入第4管,第4管溶液混勻后，吸取3mL加入第5管,如此一直到第7管,第 7管溶液混勻后吸取3mL棄掉。將改良GAM瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化，吸取12mL加入上述各試 管，混勻后傾注于與試管編號(hào)對(duì)應(yīng)的1?8號(hào)平板中。使第2?7號(hào)瓊脂平板BAPs的倍比 稀釋度分別為 1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,BAPs 濃度分別為 2. 00, L 00,0· 50,0· 25， 0. 13,0. 06mg/mL ;另取羅紅霉素用滅菌蒸饋水溶解至濃度為2. 5mg/mL，按上述方法制備 參照組平板，得第2?7號(hào)參照瓊脂平板羅紅霉素濃度分別為500, 250,125,62. 5, 31. 3， 15. 6M"g/mL〇
[0040] 1號(hào)平板為陰性對(duì)照(未點(diǎn)種痤瘡丙酸桿菌)，8號(hào)平板為陽(yáng)性對(duì)照(不含BAPs或羅 紅霉素)。將制備好的菌懸液2PL點(diǎn)種于2?8號(hào)平板的表面，置厭氧環(huán)境中37°C培養(yǎng)48h 后，將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面，觀察能夠完全抑制痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)的最低藥液濃 度，作為對(duì)痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度（MIC)。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。
[0041] 表I BAPs對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用

【權(quán)利要求】
1. 一種畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征包括以下步驟： (1) 采取新鮮畜禽血，加入抗凝劑，混勻抗凝，離心，分離血漿和含紅細(xì)胞的不溶物，分 別收集； (2) 向步驟（1)所得的含紅細(xì)胞的不溶物中加入純水，攪勻后進(jìn)行冷凍處理，解凍后再 進(jìn)行均質(zhì)處理或超聲波處理，徹底破碎紅細(xì)胞，使血紅蛋白溶出，離心，除去含紅細(xì)胞膜碎 片的不溶物，收集血紅蛋白溶液； (3) 將步驟（1)所得血漿和步驟（2)所得血紅蛋白溶液合并，加入第一種蛋白變性劑至 終濃度為〇. 5?5. O mol/L，70?KKTC處理3?5小時(shí)，冷卻至室溫； (4) 向步驟（3)所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入二硫鍵還原劑至終濃度為0. 2?0. 5mmol/L，80? 100°C處理20?40min，冷卻至室溫，用透析法除去反應(yīng)后產(chǎn)物中殘留的試劑； (5) 向步驟（4)所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入第二種蛋白變性劑至終濃度為0. 3?0. 8mol/L， 105?125°C蒸汽壓力中處理10?30min，冷卻至室溫； (6) 用酸試劑調(diào)節(jié)步驟（5)所得反應(yīng)產(chǎn)物的pH為3. 0?4. 2,靜置，收集上清液； (7) 用堿試劑調(diào)節(jié)步驟（6)所得上清液的pH為6. 8?7. 2,獲得無(wú)異味的微黃色生物 活性肽BAPs ; (8) 將步驟（7)所得生物活性肽BAPs滅菌，制得畜禽血液相劑型生物活性肽BAPs ; (9) 將步驟（8)所得畜禽血液相劑型生物活性肽BAPs進(jìn)行干燥處理，制得畜禽血固相 劑型生物活性肽BAPs。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步驟（1) 中所述的畜禽血為豬血、牛血或鵝血；所述的抗凝劑為檸檬酸鈉、檸檬酸鉀或草酸鉀，添加 量為0· 35?I. 20kg/每100L新鮮畜禽血，離心時(shí)的離心力為200(T2500Xg，離心時(shí)間為 5~10min〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步驟（2) 中純水的加入量為含紅細(xì)胞的不溶物總體積的5~15%，冷凍處理的溫度為-15°C?_25°C， 冷凍處理時(shí)間為6?24h ;均質(zhì)處理的壓力為40?80Mpa，處理時(shí)間為5?IOmin ;超聲波 處理的功率為800?1500W，處理時(shí)間為5?IOmin ;離心時(shí)的離心力為3000?4000Xg， 離心時(shí)間為10?20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步驟（3) 中所述的第一種蛋白變性劑為N2H 4COX12H25SO4Na或CH6ClN 3 ;步驟（4)中所述的二硫鍵還原 劑為 C3H7NO2S、C4HltlO 2S2 或 C4H4S2O4Na215
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步驟（5) 中所述的第二種蛋白變性劑為KOH、NaOH或Ca (OH) 2，步驟（6沖所述的酸試劑為HCl、H2S04、 HClO4或Cl3C2O2H，步驟（7)中所述的堿試劑為NaOH、KOH或Ca(0H) 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：經(jīng)步驟 (3)?（7)處理后，畜禽血的蛋白水解率控制在2(Γ24%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步驟（8) 中滅菌處理采用在12(Tl25°C蒸汽中高壓15~25min，制得畜禽血液相劑型BAPs。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：將畜禽血 液相劑型BAPs經(jīng)干燥處理，制得畜禽血固相劑型BAPs。
9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法制備獲得的生物 活性肽BAPs。
10. 權(quán)利要求9所述的生物活性肽BAPs在美容醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中制備具有治療痤瘡功效的藥 物中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104211755SQ201410411874
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月21日
【發(fā)明者】肖應(yīng)慶 申請(qǐng)人:廣州天賜福音生物科技有限公司