專利名稱：用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及一種檢測(cè)草酸的電化學(xué)生物傳感器的制備，具體涉及一種基于部分還原氧化石墨烯固載草酸氧化酶，將固定化酶修飾玻碳電極制備電化學(xué)生物傳感器及其對(duì)草酸的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
草酸是一種在細(xì)胞代謝過程中大量產(chǎn)生的對(duì)幾乎所有的生物體都有毒性的有機(jī)物。草酸在人體內(nèi)過量累積將導(dǎo)致很多疾病，如高草酸尿癥、草酸鈣結(jié)石、腎衰竭、心肌病和心肌電導(dǎo)率紊亂等。尿液和血漿中草酸的測(cè)定對(duì)一期、二期高草酸尿癥的診斷和藥物處理十分重要。血液中草酸的分析對(duì)草酸鈣結(jié)石早期診斷十分有用。對(duì)于草酸診斷的方法有色譜發(fā)，光譜發(fā)，滴定法以及電化學(xué)法。相比其他方法，電化學(xué)傳感器耗時(shí)少，方便快捷，設(shè)備簡(jiǎn)單，應(yīng)用更為廣泛。酶電極由于其催化性高，專一性好，能夠簡(jiǎn)單、快速的給出結(jié)果，同時(shí)靈敏性較高，備受廣泛關(guān)注。其中，差分脈沖伏安法擁有較高的靈敏度，因此常用作高靈敏度的檢測(cè)。近年來，隨著納米科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的納米材料用于構(gòu)建新型生物傳感器。而自2004年由英國(guó)科學(xué)家Geim首次報(bào)道石墨烯以來,迅速成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。石墨烯具有良好的導(dǎo)電性和巨大的比表面積，是一種理想的電化學(xué)材料。與碳納米管相比，石墨烯不僅具有成本低廉、表面積大、易于制備等優(yōu)點(diǎn)，且不含金屬雜質(zhì)，為碳材料的電催化性質(zhì)的研究提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。但由于在無分散劑的情況下，石墨烯在溶液中易團(tuán)聚，不利于其應(yīng)用。通過將氧化石墨烯部分化學(xué)還原，既保留了官能團(tuán)利于分散和化學(xué)作用，又能體現(xiàn)出石墨烯良好的電化學(xué)性能。因此選用部分還原氧化石墨烯(PCRGO)作為電化學(xué)材料。鑒于草酸在生物中的重要性，發(fā)展檢測(cè)草酸的方法有十分重要。目前還沒有利用石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)性能制備出用于草酸檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種快速靈敏的用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器，該電化學(xué)傳感器為三電極體系傳感器，其中對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘貢電極，其特征在于，工作電極為固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極。一種用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極采用以下方法制備；I)制備部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料將部分還原氧化石墨烯添加到含有草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中混合，得到固定化的草酸氧化酶的分散液；2)制備固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極將步驟I)得到的分散液，滴涂在玻碳電極表面，抽真空干燥，制得固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極。標(biāo)記為OxOx-PCRGO/GC電極。所得電極4°C下保存。所述的步驟I)具體為采用部分還原氧化石墨烯作為載體，將其添加到含草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中，在4°C下旋轉(zhuǎn)混合2h，通過疏水作用，草酸氧化酶吸附在部分還原氧化石墨烯表面，將所得混合液離心并用緩沖液徹底洗滌3次，除去游離的以及吸附不牢固的草酸氧化酶分子，將沉淀分散在丁二酸鈉緩沖溶液即得部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；其中含草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中草酸氧化酶的含量為(O. I O. 5) g/L，丁二酸鈉緩沖溶液的濃度為20mM，pH值為3. 5，部分還原氧化石墨烯與草酸氧化酶的質(zhì)量比為I : (I 5)。所述的部分還原氧化石墨烯來自于合成的部分還原氧化石墨烯水溶液PCRG0，其濃度為lmg/mL,合成方法采用文獻(xiàn)公開的方法,如文獻(xiàn)(Zhang, J. ；Yang, H. ；Shen, G.；Cheng, P. ；Zhang, J. ；Guo, S. , Chem. Commun. 2010,46,1112-1114.)；步驟2)所述的玻碳電極在滴涂分散液前拋光至鏡面，超聲清洗后氮?dú)獯蹈伞?一種用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，采用三電極體系，以甘汞電極為參比電極，鉬電極為對(duì)電極，部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶修飾的電極為工作電極，利用差分伏安脈沖法檢測(cè)草酸的濃度?，F(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以K3 [Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6]為電化學(xué)探針，采用循環(huán)伏安法考察了不同還原程度的氧化石墨烯制備的電極的電化學(xué)性能，實(shí)驗(yàn)表明隨著氧化石墨烯還原程度的增加，背景電流增大，電化學(xué)性能提高，但當(dāng)還原4小時(shí)以后電化學(xué)性能趨于穩(wěn)定，還原4小時(shí)與還原12小時(shí)得到的PCRG的電化學(xué)性能無明顯區(qū)別。本發(fā)明采用差分脈沖伏安法考察草酸氧化酶不同固載量下制備的電極的草酸檢測(cè)性能。實(shí)驗(yàn)表明，隨著草酸氧化酶固載量的提高，草酸檢測(cè)的范圍越寬，靈敏性越好。本發(fā)明構(gòu)建了一種新型的檢測(cè)草酸的電化學(xué)方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I為在ImM K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]的O. IM KCl溶液中，不同還原程度氧化石墨烯制備的電極在掃描速度為O. 05V/s的循環(huán)伏安曲線；圖2為OxOx-PCRGO電極在20mM 丁二酸鈉(pH3. 5)緩沖溶液中連續(xù)添加草酸的差分脈沖伏安曲線；其中，OxOx在PCRGO固載量為lmg/mg，用于制備電極的PCRGO的濃度為O. lmg/mL ；圖3為OxOx-PCRGO電極在20mM 丁二酸鈉(pH3. 5)緩沖溶液中連續(xù)添加草酸的差分脈沖伏安曲線；其中，OxOx在PCRGO固載量為5mg/mg，用于制備電極的PCRGO的濃度為O. lmg/mL。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例I :
根據(jù)文獻(xiàn)(Zhang,J. ；Yang, H. ；Shen, G. ；Cheng, P. ；Zhang, J. ；Guo, S.，Chem.Commun. 2010,46,1112-1114.)制備部分還原氧化石墨烯。IOmL lmg/mL氧化石墨烯水溶液中加入20mg抗壞血酸，室溫下分別放置2h，4h，12h。然后經(jīng)過微孔濾膜過濾洗滌，再分散于超純水中，經(jīng)過透析得到濃度為lmg/mL的PCRG0。不同時(shí)間還原得到的樣品分別命名為CRG0-2, CRG04, CRG0-12。將O.ImL, lmg/mL CRGO-12添加到含有 O. 1-0. 5mg草酸氧化酶的 O. 9ml20mM丁二酸鈉緩沖溶液(pH3. 5)中混合,在4°C下旋轉(zhuǎn)混合2h。將混合液在15000rpm下離心IOmin,并用緩沖液徹底洗滌3次，除去游離的以及吸附不牢固的OxOx分子，將沉淀分散在O. 2ml20mM丁二酸鈉緩沖溶液(PH3. 5)中形成CRG0-12濃度為O. 5mg/mL的分散液。將玻碳電極(直徑為3mm)在拋光布上依次采用I. O μ m，O. 3 μ n，O. 05 μ m的Al2O3粉拋光至鏡面。每次拋光后在超純水中超聲lmin，再用超純水、乙醇分別超聲清洗5min，然后用大量超純水洗滌，用氮?dú)獯蹈伞Ｈ?μ L上述中的分散液滴涂在處理后的玻碳電極表面，通過抽真空干燥，即得到0x0x-PCRG0/GC電極。將制備的不同還原程度的石墨烯修飾的玻碳電極在CHI660c電化學(xué)工作站上測(cè)定含ImM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6]探針的電解液中的循環(huán)伏安信號(hào)的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，隨著還原程度的增大，石墨烯修飾的電極電信號(hào)明顯增大最終區(qū)域穩(wěn)定。還原4小時(shí)的石墨烯電極電信號(hào)與還原12小時(shí)的基本一致，趨于穩(wěn)定。因此，采用還原12小時(shí)的石墨烯制備電極。采用差分伏安脈沖法，將所得0x0x-PCRG0/GC電極浸入20mM 丁二酸鈉(pH3. 5)緩沖溶液中，連續(xù)添加不同量的草酸，測(cè)定差分伏安信號(hào)的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，圖3，電極檢測(cè)分別在0. 3V，0. IV，-0. 5V出現(xiàn)三個(gè)特征峰，隨著草酸濃度的增加，峰電流均增大。如圖2所示，當(dāng)OxOx的固載量為lmg/mg時(shí)，隨著草酸量的增加，峰電流增加；當(dāng)草酸濃度達(dá)到0. 6mM時(shí),繼續(xù)增加草酸濃度,其峰變化不明顯。當(dāng)OxOx的固載量為5mg/mg時(shí),如圖3所示，隨著草酸量的增加，峰電流增加，增加明顯清晰，且可檢測(cè)范圍叫低固載量時(shí)寬，靈敏性更好。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器，該電化學(xué)傳感器為三電極體系傳感器，其中對(duì)電極為鉬電極，參比電極為飽和甘貢電極，其特征在于，工作電極為固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極。
2.一種如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極采用以下方法制備 1)制備部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；將部分還原氧化石墨烯添加到含有草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中混合，得到固定化的草酸氧化酶的分散液； 2)制備固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極將步驟I)得到的分散液，滴涂在玻碳電極表面，抽真空干燥，制得固載了草酸氧化酶的部分還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述的步驟I)具體為采用部分還原氧化石墨烯作為載體，將其添加到含草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中，在4°C下旋轉(zhuǎn)混合2h，通過疏水作用，草酸氧化酶吸附在部分還原氧化石墨烯表面，將所得混合液離心并用緩沖液徹底洗滌3次，除去游離的以及吸附不牢固的草酸氧化酶分子，將沉淀分散在丁二酸鈉緩沖溶液即得部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；其中含草酸氧化酶的丁二酸鈉緩沖溶液中草酸氧化酶的含量為(O. I O.5) g/L，丁二酸鈉緩沖溶液的濃度為20mM，pH值為3. 5，部分還原氧化石墨烯與草酸氧化酶的質(zhì)量比為I : (I 5)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的玻碳電極在滴涂分散液前拋光至鏡面，超聲清洗后氮?dú)獯蹈伞?br> 5.一種如權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，采用三電極體系，以甘汞電極為參比電極，鉬電極為對(duì)電極，部分還原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶修飾的電極為工作電極，利用差分伏安脈沖法檢測(cè)草酸的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)草酸濃度的電化學(xué)生物傳感器及其制備和應(yīng)用。將草酸氧化酶固定于部分還原氧化石墨烯表面，利用滴涂法將固定化草酸氧化酶修飾于玻碳電極表面，形成基于草酸氧化酶-部分還原氧化石墨烯修飾的電化學(xué)生物傳感器。以該電極為工作電極，采用差分伏安脈沖法檢測(cè)草酸濃度。本發(fā)明所采用的生物傳感器對(duì)草酸有良好的電催化活性。隨著草酸氧化酶固載量的增多，電催化活性增強(qiáng)。該電極檢測(cè)范圍寬，具有較低的檢測(cè)下限，且響應(yīng)迅速。
文檔編號(hào)G01N27/48GK102866191SQ201210388690
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者郭守武, 張艷, 吳海霞, 楊海軍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)