專利名稱：降低流體中草酸(鹽)濃度的材料和方法
交叉引用一個相關(guān)申請本申請要求2001年10月5日提交的美國臨時專利申請60/327,544的利益。
背景技術(shù)：
草酸(草酸鹽)是脊椎動物和許多可食用植物的代謝過程的天然副產(chǎn)物。不幸得很，在相當大的一部分人中草酸鹽不能完全降解，這種情況可能導致在那些人中腎結(jié)石的形成。據(jù)估計所有腎結(jié)石的70％是由草酸鹽組成。大約12％的美國人將在他們一生的某個時候患腎結(jié)石?；寄I結(jié)石或者具有形成腎結(jié)石危險的人以及有脂類吸收不良問題的患者(如口炎性腹瀉、胰腺功能不全、炎性腸疾病、腸切除，等)，具有尿草酸鹽水平升高的傾向。
在終末期腎病(ESRD)中，草酸鹽積累導致高草酸鹽血癥和繼發(fā)性草酸鹽沉積癥(Tomson，C.R.等人，1989，Clin Nephrol 3287-95)。為了提供正常發(fā)揮作用的腎的功能，血液透析清除血漿草酸和血漿草酸鈣。然而，血液透析治療不能徹底消除草酸和草酸鈣(Marangella等人，1992，Nephron.6074-80)。如果沒有血液透析，ERSD和原發(fā)性高草酸鹽尿(PH)的患者具有更高的患進行性系統(tǒng)性草酸鹽沉積癥的危險(Hoppe等人，1999，Kidney International 56268-274)。
除了在泌尿道形成結(jié)石外，草酸鹽在流體中的存在可以在許多情況下成為問題。例如，已被確認在支架和導管上的草酸鈣沉積的形成能破壞這些器械行使他們的功能的能力，并且可能是微生物感染形成的一個起作用的因素。同樣地，草酸鹽沉積的形成也在包括釀造工業(yè)的發(fā)酵過程中導致下降的效率和損害。
關(guān)于本發(fā)明的一個實施方案的特別的意義是內(nèi)置(indwelling)導管和支架上的草酸鹽的有害影響。導管和支架在醫(yī)療過程中經(jīng)常使用，這些醫(yī)療過程包括，例如尿和腹膜透析流的處理，血液透析，以及激光或碎石術(shù)治療后腎結(jié)石的排出。因為殼垢(encrustation)和細菌粘附的發(fā)生，增加了器械堵塞和尿路感染(UTI)的危險，在泌尿道中使用長期內(nèi)置導管和支架具有局限性。
與泌尿器械相關(guān)的尿路感染的發(fā)病機理經(jīng)常涉及生物膜的形成。生物膜形成的一個重要步驟是尿的成分以條件膜(conditioning film)的形式在器械上的沉積(Fuse等人，1994，J.Urol.1511703-1706；Tiezer等人，1998，J.UroL.160876-881；Santin等人，1999，Biomaterials，201245-1251)。幾個小時內(nèi)，這層膜就組成妨礙尿液流動的殼垢沉積物。對這種殼垢(encrustation)的生物化學和光學分析已經(jīng)顯示草酸鈣的存在。
關(guān)于在多種泌尿疾病中支架殼垢發(fā)生的流行病學研究已經(jīng)指出尿石形成是支架殼垢的一個主要危險因素。已經(jīng)報道在結(jié)石形成者中殼垢有相當高的發(fā)生率(Keane等人，1994，Br.J.Urol.73687-691；Robert等人，1997，Urol. Int.58100-104)。Keane等人報道58％的支架有殼垢并且支架殼垢發(fā)生的主要危險因素是尿石病歷史。這顯然因為結(jié)石形成者的尿中以鈣和草酸為主的致結(jié)石成分過飽和。尿中草酸濃度是草酸鈣飽和的一個最重要的參數(shù)。因為尿中每個草酸根離子結(jié)合多于10個鈣離子，草酸的小量增加導致超過草酸鈣過飽和閾值，引起結(jié)晶。
因為患者在放置內(nèi)置醫(yī)療器械前通常接受抗生素，正常尿道菌群經(jīng)常已經(jīng)被具有尿路病原體藥物抗性的善于棲居表面的生物代替。導管或者支架的存在也可以促進細菌上升侵入腎盂和腎組織。一旦器械相關(guān)感染形成，他們通常難以治療并且一般有取出器械的必要。
除了成為感染部位，已經(jīng)顯示許多支架具有不可通行的阻塞(El-faqih等人1991，J.Urol.1461487-1491)。在泌尿道人造材料上的殼垢沉積在感染和無菌的尿液中都會發(fā)生。在感染尿液中殼垢的形成機制同尿路結(jié)石的形成是相似的產(chǎn)生脲酶的微生物通過尿素水解提高尿液pH，從而產(chǎn)生一個堿性環(huán)境，在該環(huán)境中鎂和鈣容易從溶液中沉淀出來形成結(jié)晶。
在無菌尿中，生物材料上殼垢的形成看來是取決于尿的組分和人造材料性質(zhì)(Ramsay JWA 1987，Br.J.Urol.1987，6666-70；Denstedt等人1998，J.Endourol.12493-500)?，F(xiàn)在有多種的輸尿管支架和輸尿管導管。硅氧烷(silicone)是一種高度生物相容的材料并且用于輸尿管導管以及輸尿管支架的制造。盡管已經(jīng)有關(guān)于開發(fā)具有改性表面性質(zhì)的材料的研究，這些材料沒有一個具有殼垢抗性(Tunney等人，1996，Biomaterials，171541-1547)。一些常用的器械是已經(jīng)特別設(shè)計來降低殼垢危險的標準硅氧烷膠乳器械(Sof Flex，Cook Urology，Indiana)，親水支架(Boston Scientific，MA)和低表面能支架(Lse，Cook Urology，IN)。在西安大略大學(University of Western Ontario)的泌尿科學ESWL中心進行的詳盡研究已經(jīng)記錄了在上述常用生物材料上的殼垢和生物膜形成過程(Tiezer等人1998，J.Urol.160876-881；Wollin等人1998，J.Endourol.12101-111；Teizer等人1998，Biomater.43321-330；Reid等人1992，J.Urol.1481592-1594)。
更新的進展之一是在內(nèi)置醫(yī)療器械上使用水凝膠涂層。這些親水性的聚氨基甲酸酯多聚物和水接觸后膨脹并且在他們的多陰離子結(jié)構(gòu)中保留相當大的一部分水。這被認為可以降低摩擦力和支架殼垢。也已經(jīng)開展關(guān)于下述水凝膠的研究，非離子型合成的水凝膠，如聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，聚乙二醇和聚甲氧基-PEG甲基丙烯酸酯，和離子型水凝膠，如交聯(lián)的聚丙烯酰胺-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物(Kulik E.和Y.Ikada，1996，J.Biomed.Mater.Res.30295-304)。一種連接在血清白蛋白的基于聚乙二醇的水凝膠已經(jīng)報道是一種適合于酶在生物醫(yī)學器械上固定的基質(zhì)(D’Urso EM等1995，Immobil.Biotechnol 23587-595)。
酶的表面固定是在工業(yè)和實驗室環(huán)境下使得酶簡單回收和再利用的便利和經(jīng)濟的方法。通過應用多種生物偶聯(lián)技術(shù)，酶已經(jīng)和底物共價連接。常用底物包括有機材料，例如聚碳酸酯和多糖材料(包括殼多糖)和無機材料，例如石英玻璃。這些底物為了共價連接酶，經(jīng)常被表面官能化。
因為硅氧烷彈性體具有生物惰性、低摩擦系數(shù)和彈性，所以它是在泌尿道導管制造中常用的材料。已經(jīng)嘗試對硅氧烷彈性體表面進行改性，目的是產(chǎn)生具有更高的親水性(Urban，M.W.，M.T.Stewart，1990，“ATR FT-IR studies of gas plasma modified silicone elastomersurfaces”J Appl Polym Sci.39265-283；Howard I.H.1991，“Surfacemodification of polymers by radio frequency plasma”，博士論文，佛羅里達大學，P76；和Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.Y.Kao，1996，“Preparation and characterization of a homobifunctional siliconerubber membrane grafted with acrylic acid via plasma-induced graftcopolymerization”J.Polym Sci PolChem 34141-148)，官能化的(Mutlu，M.等人，1991，“Matrix surface modification by plasmapolymerization for enzyme immobilization”J.Mater Chem 1447-450；Gaboury，S.R.，M.W.Urban，1993，“Analysis of gas plasma-modifiedpoly-(dimethylsiloxane)elastomer surface-attenuated-total-reflectanceFourier-trahsform infrared-spectroscopy”Adv Chem Ser 777-790；和Rau，K.R.，2000，“Surface modification of biomaterials by pulsed laserablation deposition and plasma/gamma polymerization”博士論文，佛羅里達大學，Gainesville，F(xiàn)L)，或者接枝聚合的(Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.Y.Kao，1996，“Preparation and characterization of ahomobifunctional silicone rubber membrane grafted with acrylic acidvia plasma-induced graft copolymerization’J.Polym Sci Pol Chem34141-148；Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.C.Wang，1994，“Characterization of Plasma-induced graft-polymerization of2-hydroxyethyl methacrylate onto silicone rubber”J.Appl Polym Sci541279-1287；Lee，S.D.等人，1996，“Plasma-induced graftedpolymerization of acrylic acid and subsequent grafting of collagenonto polymer film as biomaterials”Biomaterials 171599-1608；Ksiue，G.H.等人，1998“Surface characterization and biological propertiesstudy of silicone rubber membrane grafted with phospholipid asbiomaterial via plasma induced graft copolymerization”J BiomedMater Res 42134-147和Langefeld，S等人，1999，F(xiàn)unctionally adaptedsurfaces on a silicone keratoprosthesis”Int.J.Artif Organs 22235-241)表面。表面改性已經(jīng)用多種方法實施，包括化學發(fā)應、紫外線(UV)照射、γ射線輻射、和射頻等離子體放電(RFPD)。RF等離子體放電是不改變主體性質(zhì)而改變材料表面性質(zhì)的有用技術(shù)，以加強生物相容性，例如蛋白質(zhì)吸附的改變，或者可以用來提高希望的細胞粘附和在生物材料表面的生長(Lee，S.D.，G.H.Hsiue，C.C.Wang，1994，“Characterization of plasma-induced graft-polymerization of2-hydroxyethyl methacrylate onto silicone rubber”J.Appl Polym Sci541279-1287；Ksiue，G.H.等人，1998“Surface characterization andbiological properties study of silicone rubber membrane grafted withphospholipid as biomaterial via plasma induced graftcopolymerization”J Biomed Mater Res 42134-147；Langefeld，S.等人，1999，“Functionally adapted surfaces on a siliconekeratoprosthesis”Int.J.Artif Organs 22235-241；和Mason，M.等人，2000，“Attachment of hyaluronic acid topolypropylene，polystyrene，and polytetrafluoroethylene”Biomaterials2131-36)。
內(nèi)置醫(yī)療器械開發(fā)的許多近期進展集中在防止細菌感染。用抗微生物物質(zhì)，如重金屬、銀氧化物和抗生素，涂層或者灌注生物材料可以降低感染的發(fā)生率，尤其是對于需要短期器械插入的患者(JohnsonJR等人1990，J.Infect.Dis.1621145-1150；Gilchrist T等人1991，Biomaterials1276-78)正如上面指出的，在流體中草酸鹽的存在可以在內(nèi)置醫(yī)療器械以外的情況中引起問題。在發(fā)酵工業(yè)中，結(jié)垢的形成是通過設(shè)備上的這些物質(zhì)的表面沉積1)水不溶的鈣和鎂的硫酸鹽和碳酸鹽(礦物質(zhì)結(jié)垢)和2)在正常發(fā)酵過程中形成的草酸鈣。如果及早處理，器械上結(jié)垢的存在不是危險的。然而如果任其發(fā)展不制止，可以導致重大的操作問題。
在醫(yī)療器械的例子中，結(jié)垢標志著微生物危害。結(jié)垢的晶體結(jié)構(gòu)給腐敗生物(例如片球菌屬(Pediococcus)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)提供很大的保護使其免受清潔劑和滅菌劑的作用。其次，結(jié)垢形成很大程度上降低了穿過器械表面的熱傳遞。這必然地降低加熱和制冷運行效率，將轉(zhuǎn)化為增加的運行時間、降低的生長量和膨脹的能量消耗。第三，結(jié)垢尤其對鍋爐有害，因為它在鍋爐運行的苛刻條件下快速沉積。這種累積能導致鍋爐失靈以及可能爆炸。
不幸得很，導致結(jié)垢形成的化學反應是發(fā)酵過程固有的。例如，結(jié)垢是通過許多化學反應形成的，這些化學反應是在整個釀造過程中發(fā)生的。一種通常已知為啤酒石的結(jié)垢形式，是在混合條件下通過鈣和草酸的反應形成的。草酸是大麥的一種有機酸組成。除了形成結(jié)垢，草酸鈣還與瓶裝啤酒的噴出和膠體不穩(wěn)定相關(guān)。
現(xiàn)在釀造廠中有許多種可選擇方法來處理結(jié)垢。這些包括離子交換、螯合試劑和酸性去垢劑。本發(fā)明提供了除去流體系統(tǒng)中的草酸(鹽)的一種可供選擇的辦法。
簡要概述本發(fā)明提供了降低流體中草酸(鹽)(oxalate)濃度的材料和方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，草酸降解酶固定在表面上并且提供了降低與該表面接觸流體中的游離草酸的有效方法。此處舉例的具體實施方案中，草酸降解酶(oxalate-degrading enzyme)結(jié)合在與生物流體接觸的表面上。這些表面可能在，例如導管、支架、或透析膜上。
此處描述的另一實施方案中，草酸降解酶連在與發(fā)酵過程涉及的流體接觸的表面上。這些改性表面因此可以用以降低結(jié)垢的發(fā)生率。
正如此處所述，草酸降解酶可以涂層在用來生產(chǎn)器械的材料上，目的是有效地原位降解草酸阻止導致殼垢的草酸鈣沉淀的起始步驟發(fā)生。這個方法可以用以防止器械的阻塞和微生物感染的危險。
在本發(fā)明的一個實施方案中，射頻等離子體放電(RFPD)用以激活和官能化惰性的硅氧烷彈性體表面。然后表面用3-氨丙基三乙氧基硅烷(AMEO)涂層，使彈性體表面獲得胺官能度，提供偶聯(lián)草酸氧化酶的胺基位點。
詳細內(nèi)容本發(fā)明提供了降低在流體中草酸(鹽)濃度的材料和方法。這種草酸濃度的降低通過降解草酸或者從流體中除去草酸獲得。在一個優(yōu)選的實施方案中，草酸在生物流體中被降解。此處具體舉例的是支架和導管，導管已經(jīng)改進以降低在周圍流體中的草酸濃度從而降低或者消除殼垢。
本發(fā)明的另一方面關(guān)于透析膜，這些透析膜已經(jīng)改進以降解草酸(鹽)從而降低周圍流體中的草酸(鹽)濃度并且提高透析過程的效率。
在另一實施方案中，草酸鹽在包括發(fā)酵培養(yǎng)基的其他流體中降解。在發(fā)酵液的情況下的具體舉例是釀造過程涉及的流體中草酸的降解。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將與流體接觸的表面通過結(jié)合草酸降解酶而被改性。依照本發(fā)明的改性表面可能用，例如一種聚合材料制造。在一個實施方案中，表面包括硅(氧)橡膠。
本發(fā)明使用的方法與用于分析目的的將酶附在表面上是不同的。因此，本發(fā)明的方法通過降低在流體中的草酸濃度提供功能上的優(yōu)勢。功能優(yōu)勢可能是，例如降低草酸鈣沉積的形成、微生物感染、殼垢、細菌粘附和結(jié)垢形成。
酶和表面的結(jié)合可能通過，例如，直接連接、通過連接物連接、或者通過摻入表面涂層內(nèi)的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有多種方法使草酸降解酶和目的表面結(jié)合。結(jié)合方法的主要要求是必須保持酶降解草酸(鹽)的能力。所以例如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的將酶和人造材料直接相連的方法。另外，酶可以通過連接物和目的表面相連。許多這種連接物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，包括樹形聚合物(dendrimer)，例如在美國專利6,080,404號所描述的那些。
在另一個實施方案中，草酸降解化合物可以包埋在涂層內(nèi)。涂層可能是例如在美國專利5,554,147號；5,607,417和5,788,687中所述的那些涂層。這些專利，此處引用作為參考，也描述了多種這樣的試劑，他們可以包埋在器械涂層中并且可以結(jié)合本發(fā)明的草酸降解酶使用。
盡管在支架和導管的生物材料的改進上正在做顯著的研究，但是沒有一個目前使用的器械令人滿意地降低殼垢的程度。有優(yōu)勢的是，本發(fā)明的器械可以用在進行內(nèi)泌尿科治療過程的患者群體上。這些器械給那些易于形成草酸鹽結(jié)石和患晚期惡性梗阻的患者使用是尤其有利的。
硅(氧)橡膠(SR)被用于很多生物醫(yī)學器械，因為它具有極好的生物相容性，在生理環(huán)境內(nèi)提供彈性和長期機械穩(wěn)定性。為了防止在泌尿環(huán)境下條件膜的快速沉積，水凝膠涂層已經(jīng)用于SR器械。已經(jīng)開發(fā)了若干技術(shù)通過共價接枝多種聚合物用以SR的表面改性(Lee，S等人1996，Journal of Polymer SciencePart APolyymer Chemistry34141-148；De Fife KM等人1999，J.Biomed.Material.Res.44298-307；DiTizio，V等人1998，Biomaterials，191877-1884；Langefeld，S等人1999，Int.J.Art.Organs，22235-241)。SR的表面被活化來提供能夠連接可聚合單體的官能團。應用常規(guī)的能源可以完成活化，如鈷-60、射頻或微波氣體放電、以及等離子體放電(De FifeKM等人1999，J.Biomed.Material.Res.44298-307)。另外，應用紫外線和氧化還原試劑的光化學反應已經(jīng)用于化學改性SR表面(DiTizio，V等人1998，Biomaterials 191877-1884)。
用氬等離子體處理，在硅氧烷表面上產(chǎn)生自由基，然后將樣品暴露于氣體產(chǎn)生官能團，例如用氧氣產(chǎn)生過氧化物，和用氨氣產(chǎn)生胺基基團。Langefeld等人(Langefeld，S等人1999，Int.J.Art.Organs22235-241)用等離子體處理技術(shù)產(chǎn)生表面過氧化氫來起始聚丙烯酸(PAA)和聚甘氨酰甲基丙烯酸酯(polyglycidylmethacrylate)接枝聚合，并且開發(fā)了在活化PAA上共價固定纖維粘連蛋白的方法。這種方法用作將草酸降解酶直接共價固定在SR和PAA的水凝膠基質(zhì)的的手段。
SR也可以用聚乙二醇(PEG)-明膠水凝膠改性。在一個實施方案中，這種涂層可以用來包埋抗生素?？梢允褂玫目股氐睦影ǚZ酮、β—內(nèi)酰胺、和頭孢菌素?？股乜梢园裨谥|(zhì)體里。這種抗微生物涂層連同草酸降解酶的結(jié)合可以用于處理兩種類型的導管殼垢，即，細菌誘導的鳥糞石和磷酸鈣沉積，以及非感染環(huán)境的草酸鈣沉積。
本發(fā)明的一個實施方案中，草酸降解酶可以共價結(jié)合至射頻等離子體表面改性的硅氧烷彈性體。這些表面改性的材料可以用于，比如，防止泌尿生物材料上草酸鈣殼垢。草酸降解酶只需要作用于環(huán)繞導管表面的微環(huán)境以防止草酸鈣晶體在表面上形成。另外，通過OXO介導的游離草酸降解產(chǎn)生的H2O2，可以提供在泌尿環(huán)境的抗微生物作用。
草酸降解酶主要有三類草酸降解酶。草酸氧化酶表達于高等植物中，并催化氧依賴的氧化反應，將草酸氧化成CO2伴隨H2O2的形成。已經(jīng)建立了從大麥根中獲得草酸氧化酶的快速的三步驟純化方法(Kotsira VP和YD Klonis，1997，Arch.Biochem.Biophys.340239-249)。編碼大麥根草酸氧化酶的基因已經(jīng)克隆、測序和表達(Thompson C等人1995，Euphytica 85169-172)。
草酸脫羧酶，是第二類草酸代謝酶，主要存在于真菌中(Shimazono H.，1955，J.Biochem.42321-340)。真菌草酸脫羧酶催化游離草酸降解為CO2和甲酸。已經(jīng)報道這種酶存在于數(shù)種真菌中，包括疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，黑曲霉(Aspergillus niger)的某些株，以及白腐病真菌采絨革蓋菌(Coriolus versicolor)。編碼金針菇(Flammulina velutipes)草酸脫羧酶的基因已經(jīng)克隆和測序(Mehta A和A.Datta，1991，J.Biol.Chem.26623，548-53；國際專利WO98/42827號)。
用于草酸降解的細菌酶草酰-CoA脫羧酶對CoA激活底物有活性并將其轉(zhuǎn)化為甲酰-CoA。然后甲酰-CoA轉(zhuǎn)移酶作用使甲酸和草酸交換CoA.這些酶已經(jīng)在草酸降解細菌中進行研究，有存在土壤中的草酸假單孢菌(Pseudomonas oxalaticus)(Qyayle PR等人1961，Biochemical J.78611-615)和存在于包括人類的脊椎動物的胃腸道中的產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Oxalobacter formigenes)(Allison，M.J等人1985，Arch Microbiol.14147)。已經(jīng)表明產(chǎn)甲酸草酸桿菌和它的宿主具有共生關(guān)系，通過調(diào)節(jié)草酸在腸中的吸收和血漿中草酸的水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種細菌的缺乏的結(jié)果是成為草酸相關(guān)疾病的危險因素，如復發(fā)性先天草酸鈣尿石癥(Sidhu，H.等人1999 J.Am.Soc.Neph.10S334-S340；Kleinschmidt，K.等人，1993，InUrolithiasis 2，Plem Press，NY.)和空腸回腸旁路外科手術(shù)、囊性纖維化和炎性腸疾病繼發(fā)的腸源性尿草酸鹽過多(Allison，M.J.等人1986，J.Nutr.116455-460；Sidhu，H.等人1998，Lancet 3521026-1029)。這種細菌高度特異性地只利用草酸作為生存生長的能源。結(jié)果是草酸降解酶草酰-CoA脫羧酶和甲酰-CoA轉(zhuǎn)移酶占其細胞蛋白的大約20-30％。用于草酸-甲酸交換的蛋白質(zhì)和膜轉(zhuǎn)運體都已經(jīng)被純化和充分的性質(zhì)測定(Baetz AL和MJ Allison，1989，J.Bact.1712605-2608；Baetz AL和MJ Allison，1990，J.Bact.1723537-3540；Ruan ZS 等人，1992，J.Biol.Chem.26710537-19543)。而且，所有三種蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)克隆、測序并表達為生物活性重組蛋白質(zhì)(Abe，K.等人，1996，J.Biol.Chem.2716789-6793；Lung H.Y.等人，1994，J.Bact.1793378-3381；Sidhu，H.等人，1997，J.Bact.1793378-3381)描述多種草酸降解酶和編碼這些酶的基因的專利包括美國專利5,912,125、6,090,628和6,214,980號。此處引用這些專利作為參考。
材料和方法硅氧烷彈性體硅氧烷彈性體(MDX4-4210，醫(yī)用級彈性體，Dow Corning，Midland，MI，supplied by Factor II，Inc.，Lakeside，AZ)依照制造商的操作指南制備.簡要地說，通過在有2-mm間隔物分開的丙烯酸板間固化樹脂將彈性體鑄造成2-mm厚的薄片。使制備好的薄片在室溫下固化48個小時。用一種軟木塞鉆孔工具(Boekel，F(xiàn)easterville，PA)從固化薄片上割下直徑為10-mm的圓盤。圓盤在HPLC級的己烷(Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA)中萃取48小時來除去未反應的物質(zhì)。
表面改性射頻(RF)等離子體放電體系由鐘罩型反應室、樣品支架、蒸氣入口、有液氮冷阱的真空系統(tǒng)以及RF發(fā)生器(RF Plasma Products，Inc.，model HFS 401 S)(在固定頻率為13.56MHz、最大輸出功率為500w下運行)和匹配網(wǎng)路(使等離子體放電的阻抗同RF發(fā)生器協(xié)調(diào))組成。硅氧烷彈性體圓盤放置于反應室內(nèi)，隨后送至真空度為40mtorr的真空并且用氬氣以1000 standard cm3/min的流速吹洗5次，每次15秒。最后的氬氣吹洗點燃形成等離子體，在50 mtorr，50 watts功率下清洗和活化硅氧烷圓盤15分鐘。通過針形閥將超純水蒸氣緩慢加入反應室代替等離子體中的氬氣(15分鐘，50 mtorr，50 watts功率)。等離子體處理后，圓盤用100％乙醇漂洗15分鐘，然后與含2％(v/v)3-氨丙基三乙氧基硅烷(AMEO；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的95％乙醇溶液反應45分鐘，用100％乙醇漂洗。圓盤在室溫條件留置16-24小時固化。
表面性質(zhì)測定對等離子體處理過的圓盤表面應用水下俘獲空氣接觸角測角術(shù)和X-射線光電子能譜法進行性質(zhì)鑒定。接觸角的測定應用Rame-Hart-A-100測角儀在超純水中進行。三個大約相同大小的氣泡用一個彎曲的微量注射器從下面引到硅氧烷樹脂表面上。當氣泡和改性的硅氧烷圓盤表面間形成角度時立即測定每個接觸角。對相同等離子體處理的7個圓盤總共進行21個測量，從中確定平均接觸角。應用XPS確定未改性的、等離子體處理的以及等離子體處理AMEO涂層的硅氧烷彈性體的表面元素化學的改變。應用具有DS800數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)的Kratos分析型XSAM800對每個樣品進行了低分辨率的全掃描(survey seam)和高分辨率的元素掃描。Kratos配備有Mg Ka X-射線源，在這樣條件下運行，通過能量(pass energy)為1253.6eV，使用15kV和9-mA電流。譜圖在相對于樣品表面90°的彈起角(take-off angle)獲得。從碳(Cls)、氧(Ols)、硅(Si2p)，和氮(Nls)峰的相對峰面積中進行提供相對原子濃度的元素分析。碳峰用于高分辨率掃描的校正峰。
酶的固定使用來自大麥苗的草酸降解酶草酸氧化酶(OXO)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。用溶于0.01-M磷酸鹽緩沖液(PBS)的2.5％(v/v)的戊二醛(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，pH 7.4，將酶共價結(jié)合在活化的硅氧烷彈性體圓盤上。等離子體處理后的圓盤放置于24孔組織培養(yǎng)板的不同的孔中。圓盤在搖床上輕微搖動下用PBS洗滌2次(每次5分鐘)。向每個孔中的圓盤加入2.5％的戊二醛溶液，然后培養(yǎng)板在室溫下輕微搖動孵育1小時。圓盤隨后用PBS洗滌三次(每次5分鐘)，接下來用45-mM琥珀酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗滌二次(每次5分鐘)。然后將圓盤轉(zhuǎn)至干凈的組織培養(yǎng)板。向每個圓盤加入1ml在45-mM琥珀酸鈉緩沖液(pH 4.0)中制備的100-μg/ml的草酸氧化酶溶液。向沒有圓盤的孔加入同樣量的酶，作為酶活力分析的對照反應。組織培養(yǎng)板在搖床上在4℃，以20rpm孵育48小時。孵育后，吸出酶溶液并且用琥珀酸鈉緩沖液洗滌圓盤(5分鐘)。檢測圓盤來測定結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶活力。
固定化酶的性質(zhì)測定OXO活力分析是通過Requena和Bornemann(Requena，L.等人，1999，Biochem J 343185-190)方法測定。該分析是基于H2O2比色法測定，H2O2是OXO降解草酸(鹽)過程產(chǎn)生的。在干凈的24孔組織培養(yǎng)板的單獨的孔里將固定化酶圓盤和10μg游離孵育過的酶，與1ml溶于琥珀酸鈉緩沖液的40mM草酸鉀(pH 4.0)中在37℃，100rpm下孵育(30分鐘)。移走樣品并煮沸終止酶反應，冷卻至室溫。體積為0.5ml的上述反應混合物加入到1-ml的一次性比色杯中，比色杯中含有均溶于45-mM琥珀酸鈉緩沖液(pH 4.0)的0.5ml 10-mMABTS(2，2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，2-2’azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)和10μl 2400-U/ml辣根過氧化物酶。蓋上比色杯并且在室溫下孵育15分鐘。用ShimadzuUV 160分光光度計在650nm下測定吸光度，以緩沖草酸鉀、ABTS和辣根過氧花物酶作為空白對照。摩爾消光系數(shù)10000M-1cm-1用來計算草酸氧化酶的活力。一個活力單位定義為每分鐘降解1μmole草酸(鹽)所需的酶量。
共價固定在硅氧烷彈性體表面上的酶量用QuantiProTMBCA(二辛可寧酸，bicinchoninic acid)分析試劑盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)測定。用OXO涂層的硅氧烷彈性體和1ml QP BCA工作試劑在組織培養(yǎng)板孔中37℃孵育(2小時)，然后使其冷卻至室溫，在562nm讀吸光度。固定酶量從BSA標準曲線中推知。
改良Robbins設(shè)備OXO涂層的硅氧烷彈性體的防止草酸鈣殼垢形成的能力是在模擬的泌尿環(huán)境下、通過應用連續(xù)流(continuous-flow)結(jié)殼模型改良Robbins設(shè)備(MRD)評估的。這個設(shè)備由23-cm丙烯酸塊構(gòu)成，圍住一個1.0×1.5-cm的管道，每端有管道連接器。有10個直徑為1-cm預穿孔的0.5-cm厚的丙烯酸薄片用螺絲固定在丙烯酸塊上，為了防止泄漏，一個橡膠墊圈置于兩個丙烯酸部件之間。圓盤置于每個有2-mm深的池(well)的塞子中，插入1-cm孔。使插入的圓盤保持與丙烯酸頂部部件齊平，維持設(shè)備內(nèi)的層流(laminar flow)。人造尿(AU)，其組成列于表1，以0.8ml/min的速率用泵使其流過改良Robbins設(shè)備。制備了兩種AU溶液，一種含有草酸鈉，另外一種含有氯化鈣，來防止草酸鈣結(jié)晶。兩種溶液混合作為人造尿泵入MRD，產(chǎn)生pH 6.0和通過EQUIL(Werness，P.G.等人，1985，J.Urol 1341242-1244)計算的最終相對過飽和度為8的混合溶液。
四個OXO包被圓盤和四個對照(不含酶)圓盤安裝入樣品塞子中并且和AU孵育6天。在2、4和6天時取出一個酶涂層的圓盤和一個對照圓盤，用45-mM琥珀酸鈉緩沖液(pH 4.0)漂洗。如前述測定這些圓盤的酶活力然后測定殼垢程度。在第6日剩余的圓盤用蒸餾水漂洗，使其干燥，用于掃描電子顯微術(shù)(SEM)和能量彌散X-射線光譜法(EDS)。
殼垢評定圓盤用去離子水漂洗并且用1ml的0.05M的HCl在4℃處理過夜(15-20小時)以溶解殼垢物質(zhì)。該溶有草酸鹽的鹽酸溶液用SigmaDiagnostics Kitfor Oxalate(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)測定草酸鹽濃度。草酸鹽濃度用于定量圓盤表面殼垢程度。圓盤殼垢的結(jié)構(gòu)和元素分析也通過應用掃描電子顯微術(shù)(SEM)和能量彌散X-射線光譜法(EDS)完成。硅氧烷彈性體樣品用一片導電膠帶安置在5/8-in的鋁短線(aluminum stub)上。樣品和短線在標準條件下用金/鈀涂層。樣品用JEOL 6400顯微鏡分析，所述顯微鏡在15-kV加速電壓，孔徑設(shè)定為2-3以及聚光鏡當前范圍為9-10nA的條件下運行。數(shù)字化圖像的獲取應用附帶的Oxford微分析硬件和Link ISISTM軟件包進行。用同樣的JEOL 6400 SEM相關(guān)的硬件和軟件進行EDS對表面殼垢的組成分析。
下面是實施例用以舉例說明實現(xiàn)本發(fā)明的方法。這些實施例不應作為限制。除非另外指出，所有的百分含量是按重量計算并且所有的溶劑混合物的比例是按體積計算。
實施例1-酶在SR上的吸附通過將底物浸入含有蛋白質(zhì)的溶液中在37℃，輕微攪動數(shù)小時，根據(jù)本發(fā)明使用的草酸降解酶可以被吸附到SR表面。盡管蛋白質(zhì)吸附到SR上是很可能的，但是不能期待通過這種方法可以得到高濃度的蛋白質(zhì)。Ruggieri等人(81)已經(jīng)使用一種離子表面活性劑，氯化-三-十二烷基甲基銨鹽(TDMAC)，將肝素復合到疏水的導管表面(膠乳，PVC和PTFE)。盡管這種方法在降低導管表面的細菌粘附上是成功的，但是發(fā)現(xiàn)肝素在大約一個星期后流失。因為這些酶固定的簡單方法固有的困難，可以使用其他的，更持久的酶固定方法?？晒┻x擇的方法包括1)SR可以在等離子體反應室內(nèi)活化并且用超純氨氣處理?；罨腟R然后可以浸入包含偶聯(lián)劑的溶液中，如戊二醛或三羥甲基膦(THP)。已經(jīng)表明THP是一種非常有效的獲得胺官能度的偶聯(lián)劑，并且它比戊二醛更不易于水解(Osward，P.R.等人，1998，Enzyme andMicrobial Technology，2314-19)。最后，改性的硅氧烷可以浸入包含酶的溶液中使酶通過它的胺基堿性殘基共價結(jié)合偶聯(lián)劑。(氨基酸分析表明草酸降解酶包含許多這樣的胺基殘基)。包含胺基的側(cè)鏈，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常暴露在蛋白質(zhì)的表面并且可以輕而易舉地被衍生。
2)DiTizio等人(DiTizio，V.等人，1998，Biomaterials，191977-1884)描述的方法也可以使用。這個方法包括將PEG-明膠-脂質(zhì)體混合物應用到硅氧烷表面，該表面已經(jīng)用一薄層4-疊氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸(AFB)修飾的明膠預先處理。AFB-明膠可以按照他們出版物中概述的那樣合成。AFB-明膠用紫外光照射固定在硅氧烷表面，然后水凝膠混合物通過將涂層生物材料浸入堿性溶液施加，并且通過NPC-PEG(聚氧乙烯雙-對-硝基苯基碳酸酯，polyoxyethylene bis p-nitrophenyl carbonate)和明膠的胺基基團反應交聯(lián)。這種方法可以用草酸降解酶替代脂質(zhì)體組分而被采用。酶具有胺基基團，可以隨同明膠的胺基基團和NPC-PEG共價結(jié)合。
3)聚丙烯酸(PAA)也可以用氬氣等離子體技術(shù)接枝到SR上(Langefeld，S.等人，1999，Int.J.Art.Organs，22∶235∶241)。通過用N(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(N(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)活化接枝PAA鏈末端，可以將酶和PAA共價連接。
實施例2-硅氧彈性體上草酸氧化酶的固定硅氧彈性體表面依次在氬氣和水蒸氣條件下用RF等離子體改性。正如用接觸角和XPS分析測定，氬氣等離子體導致表面親水性和相對氧含量顯著增加。和氬氣等離子體處理相比，水蒸氣等離子體導致表面親水性和氧含量進一步的增加。對等離子體處理的硅氧烷彈性體使用AMEO涂層導致表面親水性的相對下降。如XPS測定的，AMEO涂層表面的增加的氮含量表明表面胺化。
有活性的草酸氧化酶通過戊二醛生物偶聯(lián)固定在胺化表面。固定化的OXO保留了大量的天然活力。
應用改良Robbins設(shè)備測定了在PDMS圓盤上的固定化的草酸氧化酶在泌尿環(huán)境中針對防止草酸鈣殼垢的效力。在循環(huán)的人造尿中孵育4和6天后，和未涂層的圓盤相比，用OXO給硅氧烷圓盤涂層導致殼垢物質(zhì)上草酸鹽濃度分別下降54％和56％。在酶涂層的表面殼垢抑制可以進一步通過SEM和EDS對圓盤表面的形態(tài)學的和元素分析證明。
表面改性圖2是不同等離子體處理后XPS測定的俘獲空氣接觸角測量結(jié)果和表面元素組成。
下降的接觸角表明，Ar和H2O等離子體處理產(chǎn)生的表面，同對照的硅氧烷彈性體相比，與增加的親水性相關(guān)聯(lián)，具有增加的氧含量和相應下降的碳含量。H2O等離子體處理后用AMEO涂層導致強疏水性表面(接觸角為96°)，具有和對照PDMS樣品相當?shù)难鹾吞己俊MEO涂層的表面是唯一導致表面胺化的處理。等離子體處理后硅氧烷含量基本保持不變。
酶的固定表3中是用QP BCA蛋白質(zhì)測定方法測定的固定化蛋白質(zhì)的量以及酶活力。
通過戊二醛生物偶聯(lián)，平均一個胺化的直徑為10mm的硅氧烷圓盤上可以固定20.8μg草酸氧化酶(OXO)，這相當于0.26μg/mm2。正如應用游離酶所測定，發(fā)現(xiàn)固定化蛋白質(zhì)具有酶活力并且保留了它的天然活力的47.5％(表3)殼垢評定表4顯示從在MRD中孵育6天后的硅氧烷彈性體圓盤中再溶的草酸鹽量，代表了殼垢的程度。在MRD中孵育2天后，在對照或OXO涂層的圓盤上都有很少殼垢沉積。僅僅4天后，OXO涂層的硅氧烷彈性體圓盤顯著抑制殼垢沉積，6天后有更明顯的效果。
對照圓盤PDMS表面的掃描電子顯微鏡(SEM)顯示一些殼垢沉積，而相應的OXO結(jié)合的PDMS圓盤的SEM表明更少的殼垢沉積。殼垢沉積主要顯示形態(tài)學上像草酸鹽一水合物結(jié)晶。二者表面的電子彌散譜(EDS)證明殼垢沉積包含鈣。鈣的組成譜圖證明同OXO結(jié)合PDMS樣品相比對照PDMS有更多的殼垢沉積。
應當理解，此處描述的實施例和實施方案只作舉例說明的目的，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)它可有多種改進或者改變，并且包括在本申請的實質(zhì)和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.降低含有草酸(鹽)的流體中草酸(鹽)濃度的方法，其中所述的方法包含用至少一種固定在表面上的草酸降解酶與該流體接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中流體是生物流體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中生物流體選自血液和尿液。
4.權(quán)利要求1的方法，其中草酸降解酶被固定在內(nèi)置醫(yī)療器械的表面。
5.權(quán)利要求4的方法，其中草酸降解酶被固定在導管、支架或者透析膜的表面。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在發(fā)酵過程的流體中降低草酸(鹽)濃度。
7.權(quán)利要求6的方法，其中草酸(鹽)濃度的降低減少了結(jié)垢的發(fā)生率。
8.權(quán)利要求1的方法，其中其上固定酶的表面是聚合的物質(zhì)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中其上固定酶的表面是硅氧烷彈性體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中草酸降解酶通過連接物結(jié)合在所述表面上。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述表面進一步包含抗微生物化合物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的酶選自草酸氧化酶、草酸脫羧酶、草酰-CoA脫羧酶和甲酰-CoA轉(zhuǎn)移酶。
13.權(quán)利要求1的方法，其中多種草酸降解酶被固定在表面上。
14.權(quán)利要求1的方法，在哺乳動物體內(nèi)實施。
15.權(quán)利要求14的方法，該哺乳動物是人。
16.結(jié)合至少一種草酸降解酶的表面，并且其中所述的表面是在透析膜、內(nèi)置醫(yī)療器械或者發(fā)酵體系上。
17.權(quán)利要求16的表面，其中所述的內(nèi)置醫(yī)療器械選自支架和導管。
18.權(quán)利要求16的表面，其是聚合的物質(zhì)。
19.權(quán)利要求18的表面，其是硅氧烷彈性體。
20.權(quán)利要求16的表面，其中草酸降解酶通過連接物結(jié)合在表面上。
21.權(quán)利要求16的表面，其中表面進一步包含抗微生物化合物。
22.權(quán)利要求16的表面，其中所述的酶選自草酸氧化酶、草酸脫羧酶、草酰-CoA脫羧酶和甲酰-CoA轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了降低流體中草酸濃度的材料和方法。在優(yōu)選的實施方案中，降低了生物流體中的草酸濃度。具體地修飾了支架、導管和透析膜以降解循環(huán)流體中的草酸。在另外的實施方案中，降低了包括發(fā)酵液的其他流體中的草酸。在發(fā)酵液的情況中，具體說明了從釀造過程中涉及的流體中去除草酸。
文檔編號A61M25/00GK1578833SQ02821478
公開日2005年2月9日 申請日期2002年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月5日
發(fā)明者H·西德尤 申請人:伊克西翁生物技術(shù)公司