專利名稱：草酸診斷/測定試劑盒及草酸濃度測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明f及一種草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃 度的方法，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術(shù)領域。
技術(shù)背景草酸作為一種最簡單的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有 重要的生理功能，并且在植物抗逆性中發(fā)揮積極作用。草酸多以鉀鹽或鈣 鹽的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中卻以游離酸的形式存在，草酸有毒， 能溶解于水。草酸是一種重要的化工原料，廣泛用于醫(yī)藥、染料、涂料、 稀土金屬的分離和提純以及衣物的漂白。測定草酸的方法有離子色譜法、電導離子色譜法、HPLC方法。臨床上大多數(shù)結(jié)石屬草酸鈣結(jié)石。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰 胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定草酸濃度 的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的草酸診斷/測定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行 草酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應 用。本發(fā)明草酸濃度測定方法原理如下草酸+氧草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)L-蘋果酸+輔酶這種方法應用草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4)偶聯(lián)蘋果酸脫 氫酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1丄1.83)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法/終點比色法。草酸氧化酶酶解草酸反應產(chǎn)生 二氧化碳，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從面得以測定還— 原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度 下降的程度/速度，可以測算草酸的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明草酸診斷/測定試劑盒 較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 12000 U/L丙酮酸 20 mmol/L本發(fā)明的草酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑2中— 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶。還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定草酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的草酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 12000 U/L丙酮酸 20 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。 實施例二本實施例的草酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。實施例三本實施例的草酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 100 mmol/L穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑蘋果酸脫氫酶500 mmol/L12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 草酸氧化酶500 mmol/L10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定草酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間 IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405腦， 被測草酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向 為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度 大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的草酸濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶 蘋果酸脫氫酶(脫羧化) L-蘋果酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出草酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種草酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35mmol/L草酸氧化酶 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L 丙酮酸 1——50mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸 組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型 輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、丙酮酸 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。還原型輔酶、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、 丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 齊IJ 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術(shù)領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/50GK101329331SQ20071002472
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司