專利名稱：錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 錳離子濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對 人體有毒的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價、三價和四價的形式存在， 氧化程度越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物 學意義是作為人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應(yīng)中，Mi +和Mg^可互相替代。常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激 發(fā)分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測 定。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定錳離子濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的 錳離子診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行錳離子濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明錳離子濃度測定方法原理如下-草酸+氧草酸氧化酶/Mi^二氧化碳+過氧化氫 二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)L-蘋果酸+輔酶這種方法應(yīng)用需要錳離子激活的草酸氧化酶(oxalate oxidase ; EC 1.2.3.4)酶(偶)聯(lián)蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase ; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1丄1.83)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/速率比色 法。草酸氧化酶，在錳離子的激活下，酶解草酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳， 再通過(偶)聯(lián)合蘋果酸脫氫酶脫羧化的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm 處吸光度下降的速度，可以測算錳離子的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L草酸 20 mmol/L丙酮酸 20 mmol/L草酸氧化酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 10000 U/L本發(fā)明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定錳離子濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的錳離子診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L草酸 20 mmol/L丙酮酸 20 mmol/L草酸氧化酶 10000U/L蘋果酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離 子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延 遲時間大約1分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。實施例二本實施例的錳離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶丙酮酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑草酸氧化酶層mmol/L500 mmol/L10000U/L蘋果酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離 子樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。 實施例三本實施例的錳離子診斷/測定試劑為三試劑，包括:試劑1(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 還原型輔f丙酮酸試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑蘋果酸脫氫 試劑3(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 草酸氧化酶100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L100mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定錳離子濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反 應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測錳離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子 的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧草酸氧化酶/Mn2+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化) L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出錳離子的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種錳離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 l一 4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L草酸 1——50 mmol/L丙酮酸 1——50 mmol/L草酸氧化酶 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋 果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、,丙酮酸、草酸氧化酶、蘋 果酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔 酶、草酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋 果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋 果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔 酶、草酸、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫 酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。還原型輔 酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1-4000 mmol/L或0.1。/。-100n/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酸、丙酮酸、草酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，就能測算出錳離子的濃度大小。
文檔編號G01N33/84GK101324625SQ200710023398
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司