專利名稱：無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒及無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無(wú) 機(jī)磷濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動(dòng)態(tài) 平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反 之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升 血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，鈣和磷以骨鹽 形式沉積在骨組織，〉70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當(dāng)乘積<35時(shí)，則將 妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟 骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素 的調(diào)節(jié)。由于人體的磷目前還不能直接測(cè)定，所以無(wú)機(jī)磷的檢測(cè)實(shí)際上是分析 磷酸鹽陰離子(H2P04"， HP04"。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原 法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動(dòng) 注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實(shí)驗(yàn) 室測(cè)定無(wú)機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。磷鉬酸還原法又有無(wú)蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加 入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，4性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測(cè)定磷鉬酸雜聚 化合物，方法簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有 光吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。酶法測(cè)定無(wú)機(jī)磷是發(fā)展趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下 的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動(dòng)化分析。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè) 定無(wú)機(jī)磷濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的無(wú)機(jī)磷診 斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng) 生化分析儀上進(jìn)行無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可 以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)酶(偶) 聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)酶促反應(yīng)連續(xù)測(cè)法/速率比色法。丙酮酸羧化酶酶解無(wú)機(jī)磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸,再通過(guò)(偶)聯(lián)合丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nrn 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還 原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度 下降的程度/速度，可以測(cè)算無(wú)機(jī)磷的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試 劑盒較為理想緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25讓ol/L腺苷二磷酸5 mmol/L草酰乙酸30 mmol/L氨離子30 mmol/L丙酮酸羧化酶幽00U/L丙氨酸脫氫酶12000U/L本發(fā)明的無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離 子。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、丙酮酸羧化酶、丙氨 酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離 子。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、丙酮酸羧化酶、丙氨 酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干 粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定無(wú)機(jī)磷濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L腺苷二磷酸 5 mmol/L草酰乙酸 30mmol/L 氨離子 30 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L丙氨酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)無(wú)機(jī)磷樣品與試劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷的濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶腺苷二磷酸草酰乙酸100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸羧化酶100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L 12000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)無(wú)機(jī)磷樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶腺苷二磷酸草酰乙酸氨離子試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 5 mmol/L 30 mmol/L 30 mmol/L100 mmol/L500 mmol/L12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100mmol/L500 mmol/L10000 U/L丙酮酸羧化酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定無(wú)機(jī)磷濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)無(wú)機(jī)磷樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷 的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類 同，不另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無(wú)機(jī)磷濃度測(cè)定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+ 水+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出無(wú)機(jī)磷的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——50Ommol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L腺苷二磷酸 1——50mmol/L草酰乙酸 1——50mmol/L氨離子 1- 50mmol/L丙酮酸羧化酶 1000——80000 U/L丙氨酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、 丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無(wú)機(jī)磷診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無(wú)機(jī)磷濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氨離子、丙酮酸羧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101324616SQ20071002337
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司