專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 無機磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、 [磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿轉(zhuǎn)磷濃度的乘積為35—— 40。當(dāng)二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，〉70時，可發(fā)生轉(zhuǎn) 移性鈣化。當(dāng)乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成 骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血槳[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁 腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰 離子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法， 酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方 法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規(guī)方法是比色 法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子 型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的 還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。
4磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物， 方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標(biāo) 本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范 圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷(磷酸根)濃度的方法， 同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，采 用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷(磷 酸根)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+亞鐵細胞色素bl 甲酸脫氫酶甲酸+高鐵細胞色素bl 甲酸+輔酶 甲酸脫氫酶二氧化碳+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用磷酸烯醇式內(nèi)酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)酶(偶)聯(lián)甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; EC 1.2.2.1; EC 1.2.2.3)、 甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; EC 1.2丄2; EC 1.2.1.43)酶促反應(yīng)/終點法。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解無機磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶) 聯(lián)合二個不同的甲酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原 成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處說明書第3/7頁
吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算無機磷(磷 酸根)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是 單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒
較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 甲酸脫氫酶 甲酸脫氫酶 草酰乙酸
亞鐵細胞色素B1
100 mmol/L 500 mmol/L 3 mmol/L 10000 U/L 12000U/L 12000 U/L 12 mmol/L 7 mmol/E
本發(fā)明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫 酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、—個 同的甲酸脫氫酶。輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、草酰乙酸、亞鐵細 胞色素Bl在試劑1或試劑2中的位置口J以不限。試劑盒口J以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將.卜.述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、二個不同的甲酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、草酰乙酸、亞鐵細
胞色素B1在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L甲酸脫氫酶 甲酸脫氫酶 草酰乙酸 亞鐵細胞色素B1
12000 U/L 12000 U/L 12 mmo/"L 7 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍十燥，制成干粉試劑；使用前，加 入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度《0.1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑的體 積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測 時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀F， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
草酰乙酸 亞鐵細胞色素B1
10Ommol/L 50 mmol/L
3 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L 50 mmol/L
8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甲酸脫氫酶
甲酸脫氫酶
10000U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，
測試土波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑l、試
劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘
左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為二試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
草酰乙酸 亞鐵細胞色素B1
100誦ol/L 50 mmol/L
3 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
甲酸脫氫酶
甲酸脫氫酶
100 mmol/L 500 mmol/L
12000U/L
12000U/L試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng) 時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測 無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0009;吸光度時間反 應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可達16mmol/L; 試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的 變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達0.009 ± 0.005 AA/mmol/L;試劑在 2—8r下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍
寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無機磷(磷酸根)的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+亞鐵細胞色素b1 甲酸脫氫酶 甲酸+高鐵細胞色素b1甲酸+輔酶 甲酸脫氫酶 二氧化碳+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結(jié)果。
2.一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000——80000 UZL甲酸脫氫酶 1000——80000 U/L甲酸脫氫酶 1000——80000 U/L草酰乙酸 亞鐵細胞色素B150 mmol/L 50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外， 試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、 草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、 草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔 酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素Bl組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶組成。輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素Bl在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、 草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔 酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素Bl組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、二個不 同的甲酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素Bl在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利耍求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、草酰乙酸、亞鐵細胞色素B1、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、二個不同的甲酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620155SQ20081012422
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司