專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測 定無機磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡， 血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿 中[鈣、[磷濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積 為35—-40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，〉70時， 可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶 解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生 素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽 陰離子(H2PO,， HPO420。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合 法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定 性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規(guī)方法是 比色法。磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離 子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定 的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二 醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物， 方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標本空白，否則結(jié)果偏高。酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性 范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺 輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷(磷酸根) 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機磷(磷酸根)診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀卜.進行無機磷(磷酸根)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶 一氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)酶(偶)聯(lián)丙酮 酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、丙酮酸脫氧酶(pyruvate dehydrogenase; EC1.2丄51)酶促反應(yīng)速率比色法/終點法。丙酮酸羧化酶酶解無機磷(磷酸根) 反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最 終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm 處吸光度上升的程度，可以測算無機磷(磷酸根)的濃度大小。5實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如卜成分關(guān)系的本發(fā)明無機磷(磷酸根)診斷/測定試 劑盒較為理想緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L輔酶3 mmol/L丙酮酸羧化酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000 U/L丙酮酸脫氫酶12000U/L腺苷二磷酸6 mmol/L草酰乙酸9 mmol/L過氧化氫9 mmol/L/乙酰輔酶A3 mmol/L本發(fā)明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用甜加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔 酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。 輔酶、閃酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔 酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑 盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使 用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L丙酮酸氧化酶 12000 U/L腺苷二磷酸 6 mmol/L草酰乙酸 9mmol/L 過氧化試 9 mmol/L乙酰輔酶A 3 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定:溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑的體 積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢 測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大/ 、,實施例二本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L3 mmol/L 6 mmol/L 9 mmol/L 9 mmol/E 3 mmol/L腺苷二磷酸 草酰乙酸 過氧化氫 乙酰輔酶A 試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmoI/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L丙酮酸氧化酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在仝自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1 ， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、 試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃 度大小。 實施例三本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1二 (羧甲基)氨基甲院一鹽酸緩沖液10Ommol/L穩(wěn)定劑50 mmol/L輔酶3 mmol/L腺苷二磷酸6 mmol/L草酰乙酸9 mmol/L過氧化氫9 mmol/L乙酰輔酶A3 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L500 mmol/L丙酮酸氧化酶12000 U/L丙酮酸脫氫酶12000U/L試劑3(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L丙酮酸羧化酶10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反 應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反 應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃 度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0016;吸光度時間 反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達 16mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±6%;試劑測試的精密度 (重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.006 ± 0.003 AA/mmo1 /L;試劑在2—8"C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無機磷(磷酸根)的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L丙酮酸羧化酶1000——-80000 U/L丙酮酸氧化酶1000——80000 U/L丙酮酸脫氫酶1000—一訓OO U/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1-50 mmol/L過氧化氫l-50 mmol/L乙酰輔酶A卜50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍 外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫 氫酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、過氧化氫、乙酰輔酶A、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620145SQ20081012421
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司