專利名稱：錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃 度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對人體有毒 的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價、三價和四價的形式存在，氧化程度越低，毒性 越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物學意義是作為人體中輔助因子有
多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應中，Mi嚴和MgS+可互相替代。
常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激發(fā)分析 (NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用間接的酶循環(huán)擴增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶 (偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定錳離子濃度的方法，同時，本發(fā)明還 將給出用以實現(xiàn)該方法的錳離子診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/ 可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行錳離子濃度測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明錳離子濃度測定方法原理如下
草酸+氧草酸氧化酶/Mn^二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl 丙酮酸脫氫酶丙酮酸+
高鐵細胞色素bl +水 丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A十
還原型輔酶
這種方法應用需要錳離子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4) 酶(偶)聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.2.2)、第二個丙酮酸脫氫 酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反應速率比色法。草酸氧化酶的 激活程度與錳離子的濃度成正比。草酸氧化酶作為作用酶，功能為將草酸酶解產(chǎn) 生二氧化碳。第一個丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)也是作用酶，功能為將二氧化 碳酶解產(chǎn)生丙酮酸。第二個丙酮酸脫氫酶(ECL2丄51)作為循環(huán)酶又同時作為 顯色酶；作為循環(huán)酶丙酮酸脫氫酶(EC1.2丄51)的酶促作用使丙酮酸再次變 回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重復循環(huán)利用，并不斷地循環(huán)產(chǎn)生丙酮酸。丙 酮酸脫氫酶EC 1.2丄51)作為顯色酶將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原 成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處 吸光度上升的速度，通過測量340mn處吸光度上升的速度，可以測算出錳離子 的濃度。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/測定試劑盒較為理 想
緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
草酸 15mmol/L 乙酸 12mmol/L 亞鐵細胞色素bl 5 mmol/L
輔酶A 3 mmol/L
本發(fā)明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、 乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶。 輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素 bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑-試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、二個不同的丙酮酸脫氫酶<
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶。
輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素 bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定錳離子濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的錳離子診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑
草酸氧化酶
丙酮酸脫氫酶
丙酮酸脫氫酶
乙酸
亞鐵細胞色素M 輔酶A
500 mmol/L 3 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定:溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子樣品與試劑的體積比例為 1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2 分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。 實施例二
本實施例的錳離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括-試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
乙酸
亞鐵細胞色素bl
輔酶A
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
草酸氧化酶
丙酮酸脫氫酶
丙酮酸脫氫酶
10000U/L 12000 U/L 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定:溫度37°C ，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1 ， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子樣品與試劑1、試劑2的體 積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。 實施例三
本實施例的錳離子診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 輔酶
乙j
亞鐵細胞色素M 輔酶A
50 mmol/L 3 mmol/L 15 mmol/L 12 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
丙酮酸脫氫酶 丙酮酸脫氫酶
500 mmol/L 12000 U/L 12000 U/L
試劑三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定錳離子濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應時間10 分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子 樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應方向為正反應(上升 反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.002;吸光度時間反 應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可達5mmol/L; 試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士5 %;試劑測試的精密度(重復性) 的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.24 ± 0.12AA/mmol/L;試劑 在2—8i:下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形 范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
1.一種間接的酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法的錳離子的濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧 草酸氧化酶/Mn2+ 二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素b1 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸+高鐵細胞色素b1+水丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出錳離子的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種錳離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20—500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L輔酶卜6 mmol/L草酸氧化酶1000——-訓00 U/L丙酮酸脫氫酶1000——-畫00 U/L丙酮酸脫氫酶1000———80000 U/L草酸卜50 mmol/L乙酸1-50 mmol/L亞鐵細胞色素bl1-50 mmol/L輔酶A1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、二個不同的丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。輔酶、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1_4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用間接的酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、草酸、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、草酸氧化酶、二個不同的丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101625312SQ200810123588
公開日2010年1月13日 申請日期2008年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司