專利名稱：無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無 機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[轉(zhuǎn)]、 [磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。 當(dāng)二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性 鈣化。當(dāng)乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降 鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機(jī)磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰離 子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法，酶 法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方法是 同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子型 表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的還原 劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基 醚(TritonX-lOO)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物， 方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測定無機(jī)磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點(diǎn)是無機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范圍 內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶聯(lián)反應(yīng)生成卩引嗒胺色原 (Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致在400—700nm波長處吸 光度的上升，得以測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以 實現(xiàn)該方法的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在可見光分 析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定，而且測定速度快、 靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+輔酶八+氧丙酮酸氧化酶過氧化氫+ 二氧化碳+
乙酰輔酶A
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶
吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水 這個方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶 (pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、及過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)酶促反
應(yīng)終點(diǎn)比色法。丙酮酸羧化酶酶解無機(jī)磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶) 聯(lián)合丙酮酸氧化酶、過氧化物酶的作用，最后生成的過氧化氫在過氧化物酶的作用 下，將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器， 在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大??； 通過測量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程度， 得出無機(jī)磷(磷酸根)濃度大小測定結(jié)果。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分 關(guān)系的本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液函mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
過氧化物酶30000 U/L
丙酮酸羧化酶10000 U/L
丙酮酸氧化酶12000 U/L
腺苷二磷酸8 mmol/L
草酰乙酸12 mmol/L
輔酶A4 mmol/L
還原型色原體組合0.1-20 mmol/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合:
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 雙氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
3_甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基~■N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2.4- 雙氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3.5- 雙氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 雙甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本發(fā)明的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰 乙酸、輔酶A、還原型色原體組合。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧 化物酶。
還原型色原體組合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
10緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A 。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。 還原型色原體組合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、
草酰乙酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干 粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一
本實施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
丙酮酸氧化酶
過氧化物酶
腺苷二磷酸
草酰乙酸
輔酶A
4-氨基抗砒
石碳酸
500 mmol/L 10000 U/L 12000U/L 30000 U/L 8 mmol/L 12 mmol/L 4 mmol/L 2 mmol/L 10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加 入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長503nm， 測試副波長600mn，被測無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法，延遲時間O分鐘，檢測時間5分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢 測主波長505nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。 實施例一
本實施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
腺苷二磷酸
草酰乙酸
輔酶A
2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
100 mmol/L 50 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L 4 mmol/L 0.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 丙酮酸氧化酶 過氧化物酶 4-氨基抗砒
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間IO分鐘，測試主波長546nm，
100 mmol/L 500 mmol/L
10000 U/L
12000 U/L
30000 U/L 0.6 mmol/L測試副波長600nm,被測無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑的體積比例為—1/加，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法，延遲時間O分鐘，檢測時間5分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢 測主波長546nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。 實施例三
本實施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
試劑2
試劑3
穩(wěn)定劑 腺苷二磷酸 草酰乙酸 輔酶A
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶
過氧化物酶
雙甲基苯胺
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
50 mmol/L 8 mmol/L
12 mmol/L 4 mmol/L 0.6 mmol/L
秦mmol/L 500 mmol/L
12000U/L
30000 U/L 2 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"，反應(yīng)時間IO分鐘，測試主波長578nm， 測試副波長660nm，被測無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑的體積比例為1/30，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法，延遲吋間O分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢 測主波長578nm吸光度上升的程度，從而測算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合 均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出 所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0016;吸光度時間反應(yīng)曲 線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R^O.99)線形范圍可達(dá)20mmol/L;試 劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士6 %;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變 異系數(shù)(CV) 《4%;試劑的靈敏度可達(dá)0.005 ± 0.0004AA/mmol/L;試劑在2 一8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣， 穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+輔酶A+氧 丙酮酸氧化酶 過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收程度，得出無機(jī)磷(磷酸根)濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1———4000 mmol/L過氧化物酶500——-80000 U/L丙酮酸羧化酶1000——-80000 U/L丙酮酸氧化酶1000——-80000 U/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L輔酶A1—50 mmol/L還原型色原體組合0.120 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外， 試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、輔酶A、還原型色原體組合組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、 草酰乙酸、輔酶A、還原型色原體組合組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組 成。還原型色原體組合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷 酸、草酰乙酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定 齊IJ、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶組成。還原型色原體組合丙酮酸羧化酶、丙酮酸 氧化酶、過氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合:,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸,3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2.4- 雙氯石碳酸,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸,,3-甲基-2-苯噻唑酮腙,3.5- 雙氯石碳酸磺酸,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸,3-甲基-2-苯噻唑酮月宗N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽,3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸,3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺,3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺,3-甲基-2-苯噻唑酮腙,2，2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸),3- 甲基-2-苯噻唑酮腙,4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸,3-甲基-2-苯噻唑酮腙,3- 甲基-乙基-羥基苯胺,4- 氨基抗砒 石碳酸,4-氨基抗砒N-乙基^N- G-硫丙基)-m-噻啶胺,4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺,4-氨基抗砒(2.4- 雙氯石碳酸,4-氨基抗砒(2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸,4-氨基抗砒(3.5- 雙氯石碳酸磺酸,4-氨基抗砒(3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氮基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽,4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸,4-氨基抗砒雙甲基苯胺,4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒(2,2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻挫-6-磺酸) 4-氨基抗砒,4-羥基-3-甲氧基苯甲酸,4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、腺苷二磷酸、草酰乙酸、輔酶A、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進(jìn)而直接反映出無機(jī)磷(磷酸根)濃度的大小。
文檔編號G01N21/31GK101620137SQ20081012297
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司