專利名稱：無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒及無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及 測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動(dòng)態(tài)平 衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦 然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血槳轉(zhuǎn)磷 濃度的乘積為35——40。當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，媽和磷以骨鹽形式沉積在骨 組織，〉70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當(dāng)乘積<35時(shí)，則將妨礙骨組織的鈣化， 甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的 恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測(cè)定，所以無(wú)機(jī)磷的檢測(cè)實(shí)際上是分析磷酸 鹽陰離子(H2P04"， HPO420。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料 結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動(dòng)注射分析法 等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定無(wú)機(jī)磷的 常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無(wú)蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非 離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比 較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐?tīng)柕?。表面活性?則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-lOO)最理想。磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測(cè)定磷鉬酸雜聚化合 物，方法簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收， 必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測(cè)定無(wú)機(jī)磷是發(fā)展趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下的中 性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動(dòng)化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定無(wú)機(jī)磷 (磷酸根)濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的無(wú)機(jī)磷(磷 酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確 度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸
+丙酮酸+ 二氧化碳 葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶艦22+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
葡萄糖-6-磷酸+輔酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡糖酸內(nèi)酯磷酸
+還原型輔酶
這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4丄1)酶(偶)聯(lián) 己糖激酶(Hexokinase; EC 2.7.1.1)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC 1丄1.49)酶促反應(yīng)終點(diǎn)法。丙酮酸羧化酶酶解無(wú)機(jī)磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生腺苷三磷酸，再通過(guò)(偶)聯(lián)合己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫
氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程 度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的程度，可以測(cè)算無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃 度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú) 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)
定試劑盒較為理想
緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
己糖激酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 2 mmol/L
草酰乙酸 9mmol/L
葡萄糖 15 mmol/L
氯化鎂 1 mmol/L
本發(fā)明的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草 酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以
是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草 酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑 盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法， 其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例一
本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括:
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酉每 3 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
己糖激酶 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 2 mmol/L
草酰乙酸 9 mmol/L
葡萄糖 15 mmol/L
氯化鎂 1 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的 濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷二磷酸 草酰乙酸
氯化鎂
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L 9 mmol/L 15 mmol/L 1 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 己糖激酶
50 mmol/L 10000U/L 12000 U/L
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延
遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的
濃度大小。
實(shí)施例三本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷二磷酸 草酰乙酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
己糖激酶
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶
50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L 9 mmol/L 15 mmol/L 1 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L 12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
10000U/L
:試劑，可以直接使用。
丙酮酸羧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體 測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37i:，
反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的 濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀
器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.002;吸光度 時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可 達(dá)16mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)土5 %;試劑測(cè)試的 精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達(dá)0.006 ± 0.003 AA/mmol/L;試劑在2—8i:下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度 高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶/Mg2+ 葡萄糖-6-磷酸+腺苷二磷酸葡萄糖-6-磷酸+輔酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡糖酸內(nèi)酯磷酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶丙酮酸羧化酶 己糖激酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶腺苷二磷酸草酰乙酸試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂組成雙劑試劑；試劑1，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂組成； 試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷 二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂組成多劑試劑；試劑1，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成；試劑 3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、己糖 激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1—4000mmol/L或0.P/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、葡萄糖、氯化鎂、丙酮酸羧化酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101620130SQ20081012296
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司