專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 無機磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
人體內磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、 [磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35—— 40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時，可發(fā)生轉 移性鈣化。當乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成 骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁 腺激素及降鈣素的調節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽陰 離子(H2P(V—， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結合法， 酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方 法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規(guī)方法是比色 法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子 型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的 還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標 本空白，否則結果偏高。
酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范 圍內是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷(磷酸根)濃度的方法， 同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，采 用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷(磷 酸根)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 腺苷三磷酸+肌苷肌苷激酶腺苷二磷酸+肌苷單磷酸 肌苷單磷酸+氨+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+
還原性輔酶
這種方法應用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4丄1)酶(偶)聯(lián)肌苷 激酶(inosine kinase; EC 2.7.1.73)、鳥苷單磷酸還原酶(GMPreductase; EC 1.7.1.7)
酶促反應速率比色法/終點法。丙酮酸羧化酶酶解無機磷(磷酸根)反應產(chǎn)生腺苷 三磷酸，再通過(偶)聯(lián)合肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶的作用，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程 度，可以測算無機磷(磷酸根)的濃度大小實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是 單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒 較為理想
緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
丙酮酸羧化酶10000U/L
肌苷激酶12000U/L
鳥苷單磷酸還原酶12000U/L
腺苷二磷酸8 mmol/L
草酰乙酸8 mmol/L
肌苷3 mmol/L
氯化銨16 mmol/L
本發(fā)明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、
6肌苷、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。
輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、 肌苷、氯化銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
肌苷激酶 12000 U/L
鳥苷單磷酸還原酶 12000 U/L腺苷二磷酸 草酰乙酸 肌苷 氯化銨
8 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L 16 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加 入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間IO分鐘，起始吸光度《0.1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑的體 積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測 時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L 16 mmol/L
輔酶
腺苷二磷酸 草酰乙酸 肌苷 氯化銨
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 肌苷激酶
鳥苷單磷酸還原酶
50 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、試
劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘
左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 8 mmol/L 3 mmol/L 16 mmol/L
腺苷二磷酸 草酰乙酸 肌苷 氯化銨 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100mmol/L 500 mmol/L肌苷激酶
12000 U/L
鳥苷單磷酸還原酶
12000U/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
丙酮酸羧化酶
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37C，反應 時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測 無機磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0024;吸光度時間反 應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R^0.99)線形范圍可達15 mmol/L; 試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復性)的 變異系數(shù)(CV) 《2%;試劑的靈敏度可達0.015 ±0.008 AA/mmol/L;試劑在 2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍 寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無機磷(磷酸根)的濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳腺苷三磷酸+肌苷 肌苷激酶 腺苷二磷酸+肌苷單磷酸肌苷單磷酸+氨+輔酶 鳥苷單磷酸還原酶 鳥苷單磷酸+還原性輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L輔酶l一6 mmol/E丙酮酸羧化酶1000———80000 U/L肌苷激酶1000———80000 U/L鳥苷單磷酸還原酶1000———80000 U/L腺苷二磷酸l-50 mmol/L草酰乙酸1-50 mmol/L肌苷l-50 mmol/L氯化銨l一50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外， 試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定 齊IJ、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶組成。輔酶、丙酮酸羧 化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定 劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙 酮酸羧化酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶、腺苷 二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據(jù)權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、肌苷、氯化銨、丙酮酸羧化酶、肌苷激酶、鳥苷單磷酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620129SQ20081012296
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司