專(zhuān)利名稱(chēng)：無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒及無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無(wú) 機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動(dòng)態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、 [磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血槳鈣磷濃度的乘積為35——40。 當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性 鈣化。當(dāng)乘積<35時(shí)，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D,甲狀旁腺激素及降 鉤素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測(cè)定，所以無(wú)機(jī)磷的檢測(cè)實(shí)際上是分析磷酸鹽陰離 子(H2P(V-， HP042_)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法，酶 法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動(dòng)注射分析法等。決定性方法是 同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定無(wú)機(jī)磷的常規(guī)方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無(wú)蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子型 表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類(lèi)很多，性能比較穩(wěn)定的還原 劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐?tīng)柕?。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基 醚(TritonX-lOO)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測(cè)定磷鉬酸雜聚化合物， 方法簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標(biāo)本 空白，否則結(jié)果偏高。酶法測(cè)定無(wú)機(jī)磷是發(fā)展趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范圍 內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動(dòng)化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)
技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以 測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的無(wú)機(jī) 磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、 全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水
二氧化碳+乙酰磷酸+過(guò)氧化氫丙酮酸氧化酶磷酸根+丙酮酸
+氧+水
氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水+輔酶 這種方法應(yīng)用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4丄1.31)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3 )、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase; EC1.4丄1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作為作 用酶，功能為將無(wú)機(jī)磷(磷酸根)酶解產(chǎn)生二氧化碳。丙酮酸氧化酶作為循環(huán)酶， 它的酶促作用將二氧化碳等再次變回?zé)o機(jī)磷(磷酸根)，使無(wú)機(jī)磷(磷酸根)不斷地 被重復(fù)循環(huán)利用，同時(shí)不斷地循環(huán)重復(fù)產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶作為顯色酶，在 丙酮酸等反應(yīng)下，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在 340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度， 通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮:無(wú)論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒較為 理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸氧化酶
草酰乙酸 乙酰磷酸 過(guò)氧化氫 氯化銨
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L 14 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L
本發(fā)明的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、 丙氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫
還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以不喊。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、草酰乙 酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接 使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是二劑，本發(fā)明測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L草酰乙酸 乙酰磷酸 過(guò)氧化氫 氯化銨
14 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入 純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士 0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢 測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢 測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酰乙酸 乙酰磷酸 過(guò)氧化氫 氯化銨 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 14 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全fi動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士
0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405rnn，被測(cè)無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘
左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢
測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酰乙酸 乙酰磷酸 過(guò)氧化氫 氯化銨 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 丙氨酸脫氫酶
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 14 mmol/L 12 mmol/L
7 mmol/L
8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 謂00U/L試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng) 時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè) 無(wú)機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向 為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢 測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā) 明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出 所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0005;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲 線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)18mmol/L;試 劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)土4 %;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變 異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.02 ± 0.01AA/mmol/L;試劑在2—8 'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年； ~~本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣， 穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法，其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+乙酰磷酸+過(guò)氧化氫 丙酮酸氧化酶 磷酸根+丙酮酸+氧+水氨+丙酮酸+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 丙氨酸+水+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸氧化酶20-500 mmol/L1-4000匪ol/L0.1-0.35 mmol/L1000——80000 U/L1000—1000--80000 U/L -80000 U/L —0 mmol/L —50 mmol/L —50 mmol/L —50 mmol/L草酰乙酸 乙酰磷酸 過(guò)氧化氫 氯化銨試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外， 試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑氳，其辟寺征_在千 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫 氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨在試劑1或試劑2中的位置可以 不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙 氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化 銨在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑l一4000mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無(wú)機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無(wú)機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、過(guò)氧化氫、氯化銨、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出無(wú)機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101620121SQ20081012295
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
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