專利名稱：無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒及無機(jī)磷(磷酸根)的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定 無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動(dòng)態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]、 [磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35—— 40。當(dāng)二者乘積大于40時(shí)，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時(shí)，可發(fā)生轉(zhuǎn) 移性鈣化。當(dāng)乘積<35時(shí)，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成 骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁 腺激素及降鈣素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測(cè)定，所以無機(jī)磷的檢測(cè)實(shí)際上是分析磷酸鹽陰 離子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法， 酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動(dòng)注射分析法等。決定性方 法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定無機(jī)磷的常規(guī)方法是比色 法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子 型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的 還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測(cè)定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標(biāo) 本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測(cè)定無機(jī)磷是發(fā)展趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)是無機(jī)磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范 圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動(dòng)化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法， 同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，采 用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行無機(jī)磷(磷 酸根)濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)濃度測(cè)定方法原理如下
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+
丙酮酸+ 二氧化碳 氰化氫+ 二氧化碳+2還原型電子受體氰化氫合成酶甘氨酸+
2氧化型電子受體 甘氨酸+水+輔酶甘氨酸脫氫酶 乙醛酸+氨+還原型輔酶 電子受體electron acceptor 這種方法應(yīng)用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)酶(偶)聯(lián)氰化 氫合成酶(hydrogen cyanide synthase; EC 1.4.99.5)、甘氨酸脫氫酶(glycine dehydrogenase; EC 1.41.10)酶促反應(yīng)終點(diǎn)法。丙酮酸羧化酶酶解無機(jī)磷(磷酸根) 反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶的作用，最 終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的程度，可以測(cè)算無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小'。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是 單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒 較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶
氰化氫合成酶
甘氨酸脫氫酶
腺苷二磷酸
草酰乙酸
還原型電子受體
100 mmol/L 500 mmol/L 3 mmol/L
10000 U/L
12000 U/L
12000 U/L 6 mmol/L 9 mmol/L 6 mmol/L 6 mmol/L
本發(fā)明的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、 腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子 受體。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶'、'甘氨酸脫氫酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、 氰化氫、還原型電子受體在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干
粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子 受體。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶。 輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、
氰化氫、還原型電子受體在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可 以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L丙酮酸羧化酶 10000 U/L
氰化氫合成酶 12000 U/L
甘氨酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
草酰乙酸 9mmol/L 氰化氫 6 mmol/L
還原型電子受體 6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加
入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度《0.1，
測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑的體
積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)
時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括-. 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
草酰乙酸 9mmol/L 氰化氫 6 mmol/L100 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 12000 U/L
還原型電子受體 6mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 氰化氫合成酶 甘氨酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1 ，
測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑1、試
劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘
左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氮基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
腺苷二磷酸 草酰乙酸
還原型電子受體
幽mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 9 mmol/L 6 mmol/L 6 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
氰化氫合成酶 12000 U/L
甘氨酸脫氫酶 12000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng) 時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè) 無機(jī)磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本 發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0013;吸光度時(shí)間反 應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)15mmol/L; 試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過土5%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的 變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.008 ± 0.004 AA/mmol/L;試劑在2—8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、"精確度好，線形范圍
寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的無機(jī)磷(磷酸根)的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳氰化氫+二氧化碳+2還原型電子受體 氰化氫合成酶 甘氨酸+2氧化型電子受體甘氨酸+水+輔酶 甘氨酸脫氫酶 乙醛酸+氨+還原型輔酶+H+將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑l一—4000 mmol/L輔酶1-6 mmol/L丙酮酸羧化酶1000——-80000 U/L氰化氫合成酶1000———80000 U/L甘氨酸脫氫酶1000——-80000 U/L腺苷二磷酸卜50 mmol/L草酰乙酸1-50 mmol/L氰化氫1-50 mmol/L還原型電子受體l一50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外， 試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體組成雙劑試劑；試劑1，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶組 成。輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰 乙酸、氰化氫、還原型電子受體在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶、腺 苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體組成多劑試劑；試劑1，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶組成。輔酶、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、 甘氨酸脫氫酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1^4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機(jī)磷(磷酸根)診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定無機(jī)磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、氰化氫、還原型電子受體、丙酮酸羧化酶、氰化氫合成酶、甘氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出無機(jī)磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101620133SQ20081012296
公開日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司