專利名稱：乙酸測(cè)定試劑盒及乙酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙酸濃度的 方法，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景隨著配制食醋標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)，食品添加劑乙酸(醋酸)的質(zhì)量合格與否又直接關(guān)系著人民身體健康與否。在條文強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)配制食醋G B 10337—2000中明確規(guī)定，配制食醋所用的乙酸應(yīng)符合G B 1903—1996的 規(guī)定，即應(yīng)符合食品添加劑醋酸的要求。用工業(yè)醋酸假冒"食品添加劑醋 酸"，例如，使用某些副產(chǎn)品或回收的工業(yè)醋酸進(jìn)行脫色，濃度不夠時(shí)加入 鹽酸、磷酸等以增加酸度。這類醋酸對(duì)人體的危害很大，因?yàn)檫@類醋酸不 僅含有添加的有毒、有害無(wú)機(jī)物,還含些很難說(shuō)清的有害有機(jī)物。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè) 定乙酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乙酸測(cè)定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析 儀上進(jìn)行乙酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí) 的推廣應(yīng)用。本發(fā)明乙酸濃度測(cè)定方法原理如下乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A 乙酰輔酶A合成酶腺苷單磷酸+ 二磷酸+乙酰輔酶A乙酰輔酶八+ 二氧化碳+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶八+輔酶這種方法應(yīng)用乙酰輔酶A合成酶(Acyl-coenzyme-A synthetase ; EC 6.2丄1; EC 6.2.1.3)酶(偶)聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2丄51)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速率比色法。乙酰輔酶A合成酶酶解 乙酸反應(yīng)產(chǎn)生乙酰輔酶A，再通過(guò)(偶)聯(lián)合丙酮酸脫氫酶的作用，最終 將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有 吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nrn處吸光度下降的程度/速度， 通過(guò)測(cè)量340nrn處吸光度下降的程度/速度，可以測(cè)算乙酸的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乙酸測(cè)定試劑盒較為 理想緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷三磷酸 輔酶A二氧化碳 乙酰輔酶A合成 100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的乙酸測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、 乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化 碳。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶。 還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、乙酰輔酶A合成酶、 丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化 碳。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶。 還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、乙酰輔酶A合成酶、 丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使 用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定乙酸濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的乙酸測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 腺苷三磷酸 輔酶A 二氧化碳乙酰輔酶A合成酶 丙酮酸脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約 O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出乙酸的 濃度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的乙酸測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑還原型輔酶 腺苷三磷酸 輔酶A二氧化碳畫(huà)mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑乙酰輔酶A合成酶 丙酮酸脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可p直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙酸樣品與 試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))， 延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出乙酸的 濃度大小。 實(shí)施例三本實(shí)施例的乙酸測(cè)定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶腺苷三磷酸輔酶A二氧化碳函mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L丙酮酸脫氫酶12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L乙酰輔酶A合成酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定乙酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37T:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)乙酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左 右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出乙酸的 濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類 同，不另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙酸濃度測(cè)定方法，其方法原理如下乙酸+腺苷三磷酸+輔酶A乙酰輔酶A合成酶 腺苷單磷酸+二磷酸+乙酰輔酶A乙酰輔酶A+二氧化碳+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出乙酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乙酸測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1———4000 mmol/L還原型輔酶0.1—~0.35 mmol/L腺苷三磷酸1-50 mmol/L輔酶A1-50 mmol/L二氧化碳1-50 mmol/L乙酰輔酶A合成酶1000——-騰00 U/L丙酮酸脫氫酶1000——-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。二氧化碳以碳酸氫鹽取代，例如碳 酸氫鈉或碳酸氫鉀。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測(cè)定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、 乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、 乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組成。還原型 輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸 脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、 乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二氧化碳、組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定 劑、乙酰輔酶A合成酶組成。還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、 二 氧化碳、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷三磷酸、輔酶A、二氧化碳、乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出乙酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101324512SQ20071002337
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司