專利名稱：乙酸測定試劑盒及乙酸的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種乙酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙酸濃 度的方法，屬于食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
技術背景隨著配制食醋標準的出臺，食品添加劑乙酸(醋酸)的質量合格與否又直接關系著人民身體健康與否。在條文強制性標準配制食醋G B 10337—2000中明確規(guī)定，配制食醋所用的乙酸應符合G B 1903—1996 的規(guī)定，即應符合食品添加劑醋酸的要求。用工業(yè)醋酸假冒"食品添加 劑醋酸"，例如，使用某些副產(chǎn)品或回收的工業(yè)醋酸進行脫色,濃度不 夠時加入鹽酸、磷酸等以增加酸度。這類醋酸對人體的危害很大，因為 這類醋酸不僅含有添加的有毒、有害無機物，還含些很難說清的有害有 機物。 發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量/ 連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的 變化，得以測定乙酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該 方法的乙酸測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行乙酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明乙酸濃度測定方法原理如下乙酸+ 二氧化碳+亞鐵細胞色素bl 丙酮酸氧化酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl +水 丙酮酸+輔酶眾+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶 這種方法應用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ; EC 1.2.2.2)酶(偶) 聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2.1.51)酶促反應速 率比色法/終點法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反應產(chǎn)生丙酮酸，再通過 (偶)聯(lián)合丙酮酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還 原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸 光度上升的程度/速度，可以測算乙酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明乙酸測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L二氧化碳 20 mmol/L亞鐵細胞色素bl 5 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 2 mmol/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L丙酮酸脫氫酶 10000 U/L本發(fā)明的乙酸測定試劑盒可以是單劑，包括-緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、 丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。 二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸 脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶。二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸 脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接 使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乙酸濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明< 實施例一本實施例的乙酸測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 二氧化碳 亞鐵細胞色素bl 輔酶 輔酶A丙酮酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶100mmol/L 500 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L 8000 U/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時 間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 酸的濃度大小。 實施例二本實施例的乙酸測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑二氧化碳亞鐵細胞色素bl輔酶輔酶A100 mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L丙酮酸脫氫酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反 應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 酸的濃度大小。 實施例三本實施例的乙酸測定試劑為三試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑二氧化碳亞鐵細胞色素bl輔酶 輔酶A50 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑丙酮酸脫氫酶 試劑3500 mmol/L10000U/L三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶500 mmol/L 8000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定乙酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測乙酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間 5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 酸的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的乙酸的濃度測定方法，其方法原理如下乙酸+二氧化碳+亞鐵細胞色素b1丙酮酸氧化酶 丙酮酸+高鐵細胞色素b1+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出乙酸的濃度大小測定結果。
2. —種乙酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-500 mmol/L穩(wěn)定劑1-4000 mmol/L二氧化碳1-50 mmol/L亞鐵細胞色素bl1-50 mmol/L輔酶16 mmol/L輔酶A1-50 mmol/L丙酮酸氧化酶1000——訓00U/L丙酮酸脫氫酶畫0——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。二氧化碳以碳酸氫鹽取代，例 如碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。
3.根據(jù)權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙 酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙 酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩(wěn) 定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成。二氧化碳、 亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙 酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 丙酮酸氧化酶組成。二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙 酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的乙酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、二氧化碳、亞鐵細胞色素、輔酶、輔酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324514SQ20071002337
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司