專(zhuān)利名稱(chēng)：磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的定量檢測(cè)西馬特羅的免疫層析試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種免疫層析試紙，特別是涉及一種用磷光二氧化硅納米顆粒為標(biāo)記的用于定量檢測(cè)西馬特羅的免疫層析試紙條及制備方法。
背景技術(shù)：
西馬特羅(cimaterol, CIM)又名喜馬特羅,塞曼特羅,屬于苯こ胺類(lèi)藥物的ー種，是ー種強(qiáng)效β 2-受體激動(dòng)劑。CM在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上主要用于擴(kuò)張氣管和増加肺通氣量，可以用于哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痙攣和休克等癥。研究顯示，飼喂CIM可以增加肥育豬的飼料報(bào)酬并增加瘦肉率，對(duì)牛、雞、鴨和綿羊等動(dòng)物都有一定作用，故CIM常被作為飼料添加劑非法用于動(dòng)物源性食品生產(chǎn)中。長(zhǎng)期使用則可能造成CIM在可食動(dòng)物組織內(nèi)蓄積性殘留，常常引起食用者發(fā)生心悸、肌肉震顫、疼痛、神經(jīng)癥狀、頭暈頭痛、惡心嘔吐、發(fā)熱寒戰(zhàn)等臨床癥狀，特別對(duì)心臟病、糖尿病和高血壓等病人危害更大。鑒于CIM的明顯危害，我 國(guó)禁止CM在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用，并規(guī)定在所有的動(dòng)物可食組織中不得檢出。目前，用于西馬特羅殘留檢測(cè)的方法較多，如(I)理化分析方法，如高壓液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、電泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法等；(3)生物測(cè)定法，如微生物學(xué)測(cè)定法、放射受體測(cè)定法等。這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備，需要熟練的專(zhuān)業(yè)人員操作，過(guò)程復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其應(yīng)用范圍，難以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。免疫分析標(biāo)記技術(shù)是指以抗原抗體間的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)標(biāo)記物對(duì)某種物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的研究。標(biāo)記免疫分析一般是將酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物對(duì)抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，這種標(biāo)記物保持了抗體或抗原的活性，不影響標(biāo)記物的活性，當(dāng)它與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以直接測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，直接對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。通過(guò)標(biāo)記物的信號(hào)放大作用，可以提高免疫分析的敏感性。熒光免疫分析是以熒光素、熒光染料、量子點(diǎn)、鑭系元素等為標(biāo)記物，將抗原或抗體標(biāo)記以突光物質(zhì)與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合,在突光顯微鏡下檢測(cè)突光強(qiáng)度的一種檢測(cè)方法。該法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但某些熒光素會(huì)產(chǎn)生生物學(xué)毒性，導(dǎo)致抗原或抗體的靈敏度和選擇性下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種用磷光二氧化硅納米顆粒為標(biāo)記的檢測(cè)西馬特羅免疫層析試紙條及其制備方法，該試紙條具有特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便定量檢測(cè)微量西馬特羅的特點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案
ー種磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的檢測(cè)西馬特羅的免疫層析試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、磷光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)西馬特羅的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述磷光抗體纖維層采用吸附磷光抗體的玻璃纖維棉制成，磷光抗體采用磷光二氧化娃納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅抗體。所述磷光二氧化硅納米顆粒的粒徑為100_220nm。所述磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅抗體由以下方法制備，具體步驟為 (O磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化將Ig磷光二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶
液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，將得到的沉淀用無(wú)水こ醇洗滌，再將沉淀分散在無(wú)水こ醇中；
(2)西馬特羅抗體的標(biāo)記將西馬特羅抗體置于2-8°C、濃度O. 025-0. 05mol/L、pH9. 5的CBS緩沖液中透析8_12h ;將氨基化的磷光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4_8min,用所述CBS緩沖液洗漆，然后與透析的西馬特羅抗體混合均勻，于2-8°C反應(yīng)，過(guò)夜，得到磷光二氧化硅的抗體復(fù)合物；向所得的抗體復(fù)合物中按I :50-120的體積比加入O. 5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2_8°C反應(yīng)8_12h ;用質(zhì)量濃度2%的BSA溶液封閉過(guò)夜，10000-13000rpm離心4_8min，得沉淀；將沉淀用O. 5mL、濃度
O.01-0. 02mol/L、pH7. 8 的 Tris-HCL 緩沖液洗滌后，4°C保存，備用。所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜； 偶聯(lián)西馬特羅的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡為平行排列的“ Il ”直線(xiàn)式印跡，或“十十”字型排列印跡，或“丁丁”字型排列印跡，或“丄I”字型排列印跡，或“トト”字型排列印跡，或N ”字型排列印跡。所述保護(hù)層為吸附纖維層、磷光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜；在吸附纖維層與磷光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線(xiàn)，該樣品標(biāo)記線(xiàn)偏向吸附纖維層ー側(cè)O. 3-0. 7cm。所述磷光二氧化硅納米顆粒采用以下方法制備
按O. 75-1. 5 2 3的體積比量取濃氨水、こ醇、水，置于反應(yīng)器中混合，攪拌均勻，得到反應(yīng)液A ;將正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的體積比混合，攪拌均勻得到溶液B ;將溶液B迅速加入到反應(yīng)液A中，室溫反應(yīng)2h ；6500rpm離心5min,得沉淀；將沉淀用こ醇超聲波洗滌，80°C烘干，于400-800°C下煅燒2-4h，即得到磷光二氧化硅納米顆粒。所述免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟
(1)西馬特羅單克隆抗體或多克隆抗體的制備；
(2)磷光抗體纖維層的制備包括磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化、西馬特羅抗體的標(biāo)記和纖維層的制備；
(3)吸附纖維層的制備吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜制成； (4)纖維素膜層的制備纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，烘干后備用；(5)試紙條的組裝將吸附纖維層、磷光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從右至左依次貼在帶有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。所述磷光抗體纖維層制備的具體方法如下
(O磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化將Ig磷光二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;將回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，得到的沉淀用無(wú)水こ醇洗滌，再將沉淀分散在無(wú)水こ醇中；
(2)西馬特羅抗體的標(biāo)記將西馬特羅抗體置于2-8°C、濃度O.025-0. 05
mol/L、pH9. 5的CBS緩沖液中透析8_12h ;將氨基化的磷光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4_8min,用所述CBS緩沖液洗漆,然后與透析的西馬特羅抗體混合均勻，于2-8°C反應(yīng)，過(guò)夜，得到磷光二氧化硅的抗體復(fù)合物；向抗體復(fù)合物中按I :50-120的體積比加入O. 5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2-8°C反應(yīng)8_12h ;用質(zhì)量濃度2% 的BSA溶液封閉過(guò)夜，10000-13000rpm離心4-8min，得沉淀；將沉淀用O. 5mL、濃度O. 01-0. 02mol/L、pH7. 8的Tris-HCL緩沖液洗滌后，4°C保存；
(3)磷光抗體纖維層的制備將制備的磷光二氧化硅抗體復(fù)合物用含有2%酪蛋白的Tris緩沖液稀釋100-1000倍，然后將作為標(biāo)記物墊的玻璃纖維棉浸入其中，以浸濕為準(zhǔn)，凍干，備用；所述Tris緩沖液的濃度為10 mM，pH值為7.8。本發(fā)明的試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明試紙條將高靈敏的磷光二氧化硅納米顆粒與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，磷光二氧化硅納米顆粒無(wú)需包裹任何熒光材料便可自行發(fā)光，且磷光壽命長(zhǎng)，制作成本低、光穩(wěn)定性強(qiáng)，能獲得比普通磷光檢測(cè)更高的靈敏度。該試紙條既保持了傳統(tǒng)膠體金試紙條簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，又克服了后者靈敏度低、無(wú)法定量的缺點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度更高、更穩(wěn)定，最低可檢測(cè)到匹克級(jí)的痕量殘留。(2)簡(jiǎn)便、快速。該試紙條可對(duì)全血、尿液、唾液、組織勻漿等直接檢測(cè)，無(wú)須進(jìn)行樣品的預(yù)處理，在紫外光下直接觀(guān)測(cè)結(jié)果，也可借助熒光閱讀器直接讀值，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)只需將試紙條插入被檢樣品10 20秒，5分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果，可現(xiàn)場(chǎng)操作，省時(shí)省力，操作簡(jiǎn)便，一歩完成。(3)結(jié)果顯示形象、直觀(guān)、準(zhǔn)確。試紙條以顯示藍(lán)白色“ I ”和“ Il ”(或“十”、“丁”、“丄”、“ト”、“_| ”)印跡作為檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條藍(lán)白色“丨”印跡，表示被檢樣品中含有CIM;顯示兩條藍(lán)白色“ Il ”印跡，表示被檢樣品中不含CIM。檢測(cè)結(jié)果可用肉眼直接觀(guān)察，結(jié)果形象、直觀(guān)、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤判。(4)節(jié)省費(fèi)用。該試紙條檢測(cè)時(shí)無(wú)需另配儀器設(shè)備和其它試劑，可隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)，既能定性檢測(cè)又能定量檢測(cè)；檢測(cè)費(fèi)用低廉，能節(jié)省大量貴重儀器和設(shè)備的投入費(fèi)用。(5)適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。該試紙條能滿(mǎn)足不同層次人員的需要，包括專(zhuān)業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、養(yǎng)殖戶(hù)以及消費(fèi)者個(gè)人等，既適于單個(gè)樣品的檢測(cè)，又適于大量樣品的篩查，能應(yīng)用于疾病診斷、毒品檢測(cè)、細(xì)菌檢測(cè)和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。本發(fā)明在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要意義，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。(6)本發(fā)明制備磷光二氧化硅納米顆粒的エ藝簡(jiǎn)單可行，易于操作。以磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記CIM抗體時(shí)，只需將氨基化的磷光二氧化硅納米顆粒與抗體直接偶聯(lián)，方法易行可控，通過(guò)調(diào)節(jié)磷光二氧化硅與抗體的摩爾比控制偶聯(lián)率，從而有效提高基于磷光ニ氧化硅納米顆粒標(biāo)記的側(cè)流層析免疫試紙條的靈敏度。


圖I為本 發(fā)明中磷光二氧化硅納米顆粒的TEM表征 從圖I可知，磷光二氧化硅納米顆粒的形態(tài)均一、大小一致，呈單分散狀，有利于標(biāo)記抗體，為其作為探針用于側(cè)流層析免疫試紙奠定基礎(chǔ)。圖中顆粒粒徑為200±5nm。圖2為本發(fā)明的免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意 圖3為本發(fā)明的免疫層析試紙條的俯視圖結(jié)構(gòu)示意 圖4為本發(fā)明的免疫層析試紙條對(duì)CIM的回歸曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明試紙條的制備過(guò)程包括西馬特羅單克隆或多克隆抗體的制備、磷光抗體纖維層的制備、吸附纖維層的制備、纖維素膜層的制備和試紙條的組裝等步驟。( I)抗西馬特羅單克隆抗體或多克隆抗體的制備
單抗制備以50Pg IOOPg/只的西馬特羅載體蛋白偶聯(lián)物免疫6 8周齡Balb/C小鼠3 4次，毎次免疫間隔時(shí)間3 5周，確定抗體效價(jià)符合要求后超強(qiáng)免疫，之后3 4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽(yáng)性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒體表，無(wú)菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼龍紗布過(guò)濾，IOOOrpm離心lOmin，收集脾細(xì)胞。將IX IO8的脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞按10:1的比例混合，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入O. 7 I. O mL CIM的50%PEG4000，作用lmin，然后緩緩加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15 mL,以終止PEG的作用，37°C水浴5 10 min，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔(ΙΟΟμ 200μ 7孔)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 14天，用間接ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體可特異地與西馬特羅反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)到101° 1012，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,針對(duì)西馬特羅特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于磷光二氧化硅納米顆粒的標(biāo)記。多抗制備用西馬特羅載體蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭白兔，免疫劑量為20(^g 500μ8/次，背部皮下分4 6點(diǎn)注射。首免，用無(wú)菌PBS溶解西馬特羅載體蛋白偶聯(lián)物，與等量FCA混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用無(wú)菌PBS溶解西馬特羅載體蛋白偶聯(lián)物，與等量FIA混合，充分乳化，首免后2 3周進(jìn)行連續(xù)免疫4 5次，每次間隔2 3周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到IO5以上吋，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，即取I份高免血清加2份PBS (ρΗ7. 2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清；以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS (pH7. 2)透析48 72h，中間換液數(shù)次，4°C、12000rpm離心15min,收集上清,得純化的抗西馬特羅多克隆抗體，_20°C凍存,用于磷光二氧化硅納米顆粒的標(biāo)記。(2)磷光抗體纖維層的制備
a.磷光二氧化硅納米顆粒的制備
采用反相微乳法制備空白ニ氧化硅納米顆粒，通過(guò)優(yōu)化微乳液中各組分的配比和氨水的量來(lái)控制納米顆粒的大小。干燥后的ニ氧化硅納米顆粒放于馬弗爐中高溫煅燒，根據(jù)不同煅燒溫度，得到不同磷光強(qiáng)度和顔色的磷光二氧化硅納米顆粒。具體過(guò)程如下
將濃氨水(質(zhì)量含量28%)、こ醇、水按1 2 3的體積比置于燒杯中，均勻攪拌，得到反應(yīng)液A ;將正硅酸四こ酷、こ醇按1:11的體積比混合均勻，得到B溶液；將B溶液迅速加入到反應(yīng)液A中，室溫反應(yīng)2h ;6500rpm離心5min,得沉淀,將沉淀用こ醇超聲波洗漆3遍，80°C烘干，于600°C下煅燒2h，即得到磷光二氧化硅納米顆粒。參見(jiàn)圖I。b.抗西馬特羅單克隆抗體的標(biāo)記
第一歩，磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化將Ig磷光二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL APTES (3-氨丙基三こ氧基硅烷)，回流12_24h ;回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，將沉淀用無(wú)水こ醇洗漆，最后分散在無(wú)水こ醇中；
第二步，西馬特羅抗體的標(biāo)記將西馬特羅抗體置于2-8°C、濃度O. 025-0. 05mol/L、pH9. 5的CBS緩沖液中透析8-12h ;將ニ氧化硅顆粒10000-13000rpm離心4_8min，用CBS緩沖溶液洗滌，然后與透析的西馬特羅抗體混合均勻，在2-8°C反應(yīng)，過(guò)夜，得到磷光二氧化硅的抗體復(fù)合物；向抗體復(fù)合物中按抗體復(fù)合物與氰基硼氫化鈉溶液I :50-120的體積比加入O. 5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2-8°C反應(yīng)8_12h ;用質(zhì)量濃度2%的BSA溶液封閉過(guò)夜，10000-13000rpm離心4_8min得沉淀；將沉淀用O. 5mL的Tris-HCL緩沖液(O. 01-0. 02mol/L, ρΗ7· 8)洗滌，4°C保存，備用。c.磷光抗體纖維層的制備
將制備好的磷光二氧化硅-抗體復(fù)合物用含有2%酪蛋白的10 mM Tris pH 7. 8緩沖液稀釋100-1000倍，然后將作為標(biāo)記物墊的玻璃纖維浸入其中，以浸濕為準(zhǔn)，然后凍干，備用?；?qū)⑾♂尯蟮牧坠舛趸?抗體復(fù)合物在檢測(cè)前以O(shè). 5-1. 5 μ L的量滴加到磷光抗體纖維層中。(3)吸附纖維層的制備
測(cè)試端吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏ニ氟こ烯PVDF膜或聚酯膜制備，將纖維材料剪成寬I. 5cm的條帶，將其放入樣品墊封閉液中浸泡30min，于37°C烘干，備用。
(4)纖維素膜層的制備
纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，剪切成寬I. 5cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)CIM抗原和羊抗小鼠IgG抗體(或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗體)，制作隱形的檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶，于37°C烘干備用。(5)羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體的制備
以飽和硫酸銨提取西馬特羅陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)，即取I份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS (pH7. 2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清，再以適量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33%，置4で冰箱211，4で、2500印111離心15min，棄上清，以適量PBS(pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS (ρΗ7· 2)透析48h，中間換液3次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度，以5(^g lOOPg/kg體重的小鼠血清(或兔血清)IgG經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次，末次注射10天后，以ELISA測(cè)定其血清效價(jià)達(dá)到I :2000以上時(shí)，心臟或動(dòng)脈采血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于西馬特羅檢測(cè)試紙條對(duì)照印跡的制備。(6)本發(fā)明試紙條的檢測(cè)反應(yīng)原理
當(dāng)檢測(cè)cna式紙測(cè)試端插入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)CM及磷光抗體玻璃纖維棉中的磷光抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)CIM可與磷光抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉磷光抗體上CIM的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止磷光抗體與纖維素膜上的人工抗原的檢測(cè)印跡結(jié)合不能顯示檢測(cè)印跡，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體則可與磷光抗體結(jié)合，在紫外線(xiàn)激發(fā)下(或使用熒光閱讀器直接讀值)形成藍(lán)白色對(duì)照印跡帶“ I ”，即一條藍(lán)白色帯“ I ”印跡為陽(yáng)性表示；反之樣品溶液中無(wú)CM吋，則不能阻止磷光抗體與纖維素膜上的CM人工抗原檢測(cè)印跡結(jié)合，顯示藍(lán)白色檢測(cè)印跡帶“ I ”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示藍(lán)白色對(duì)照印跡帶“ I ”，形成兩條藍(lán)白色帯“ Il ”為陰性表示。如果纖維素膜上沒(méi)有任何藍(lán)白色帶顯示，則表明試紙條已失效。以下實(shí)施例具體說(shuō)明試紙條的結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法。實(shí)施例一參見(jiàn)圖2、圖3。圖中I為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層，用玻璃纖維棉制成，磷光抗體纖維層3上吸附有抗CIM單克隆抗體的磷光抗體玻璃纖維棉，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜，手柄端的吸水材料層5用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、磷光抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5各層從右至左粘貼固定在支撐層I上，各層彼此之間交界處的纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有隱形檢測(cè)印跡6，用偶聯(lián)CM的牛血清白蛋白溶液(BSA)制成；隱形對(duì)照印跡7用羊抗抗體溶液在纖維素膜上印跡制成 “ I ”，兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶“ Il ”。8-1為覆蓋在吸附纖維層2和磷光抗體纖維層3上面的樣品端白色保護(hù)膜，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的其它顏色保護(hù)膜(如黃色)，9為樣品標(biāo)記線(xiàn)，該標(biāo)記線(xiàn)位于吸附纖維層2與磷光抗體纖維層3交界處對(duì)應(yīng)的白色保護(hù)膜偏向吸附纖維層2 —側(cè)約O. 5cm處，在標(biāo)記線(xiàn)右側(cè)保護(hù)膜上印有箭頭及max字樣。待測(cè)樣品的制備及檢測(cè)操作步驟
檢測(cè)肉樣將樣品剪碎、磨細(xì)，以生理鹽水稀釋成I :5的待測(cè)樣品懸液。coos ] 操作方法將檢測(cè)cna式紙條樣品端插入待測(cè)樣品中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線(xiàn)，約 ο秒鐘取出試紙條，在紫外光激發(fā)下觀(guān)測(cè)結(jié)果。結(jié)果判定(a)陽(yáng)性如果在纖維素膜上顯示有一條藍(lán)白色印跡帶“ I ”，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有CIM; (b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條藍(lán)白色印跡帶“ Il ”，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含CIM;(c)失效如果在纖維素膜上沒(méi)有藍(lán)白色帶顯示，則表明試紙條已失效。
實(shí)施例ニ 試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于磷光抗體纖維層3吸附有抗CIM的多克隆抗體，吸附纖維層2用尼龍膜制成，纖維素膜層4采用純纖維素膜，隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡均為“十”，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的手柄端蘭色保護(hù)膜。
用于檢測(cè)奶樣用生理鹽水將奶樣稀釋制成I :2 I :5的待測(cè)樣品懸液。操作方法將檢測(cè)cna式紙條樣品端插入待測(cè)樣品中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線(xiàn)，約 ο秒鐘取出試紙條，通過(guò)熒光閱讀器直接讀值，數(shù)值為τ線(xiàn)和c線(xiàn)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)峰值或峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算實(shí)際含量。
實(shí)施例三試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚偏ニ氟こ烯PVDF膜制成，偶聯(lián)CM的載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(OVA)，隱形對(duì)照印跡7用兔抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的手柄端緑色保護(hù)膜，隱形檢測(cè)印跡帶和隱形對(duì)照印跡帶均為“I”。用于檢測(cè)血樣提取血清并用生理鹽水將其稀釋制成I :2 10的待測(cè)樣品。結(jié)果判定和操作方法均同實(shí)施例一，不重述。實(shí)施例四試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚酯膜制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CIM的載體蛋白溶液為血藍(lán)蛋白(KLH)。用于檢測(cè)尿樣，可直接取尿液作為待測(cè)樣品；檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為“I”。操作方法和結(jié)果判定方法同例一。實(shí)施例五試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形對(duì)照印跡7用羊抗兔IgG抗體溶液在纖維素膜上制成，吸附纖維層2用尼龍膜制成。檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為“卜”。檢測(cè)樣品、結(jié)果判定和操作方法同例一。實(shí)施例六和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于磷光抗體纖維層3吸附有抗CIM的多克隆抗體，檢測(cè)樣品為奶樣；檢測(cè)印跡帶和對(duì)照印跡帶均為”。實(shí)施例七和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于磷光抗體纖維層3吸附有抗CIM的多克隆抗體，檢測(cè)樣品為血樣。實(shí)施例八和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于磷光抗體纖維層3吸附有抗CIM多克隆抗體，檢測(cè)樣品為尿樣。實(shí)施例九和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CIM載體蛋白溶液為血藍(lán)蛋白(KLH)。實(shí)施例十和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于隱形檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)CM載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(0VA)。實(shí)施例十一本發(fā)明試紙條的靈敏性、特異性檢測(cè)
I、靈敏性的檢測(cè)用磷酸鹽緩沖溶液PBS (PH7. 4)或雙蒸水分別配置濃度為4、2、
1、0· 5,0. 25,0. 125,0. 0625、0ng/mL的CM標(biāo)準(zhǔn)品，以實(shí)施例ー的試紙條為例，試紙條上樣SO-IOOuL，反應(yīng)5-10分鐘后，在紫外光下觀(guān)察結(jié)果。對(duì)紫外光下反應(yīng)后的試紙拍照，將圖片用畫(huà)圖工具打開(kāi)，用矩形工具選擇T線(xiàn)區(qū)域，測(cè)定其光度值(Lt)，減去T線(xiàn)(檢測(cè)線(xiàn))和C線(xiàn)(對(duì)照線(xiàn))之間的背景光度值(Lb)，以抑制率Lt-Lb為縱坐標(biāo)，以不同CIM濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，計(jì)算對(duì)該試紙條對(duì)CIM的IC5tl和最低檢測(cè)限。經(jīng)測(cè)定，該試紙條對(duì)CM的曲線(xiàn)回歸方程為y = -50. 637x + 133. 1，相關(guān)系數(shù)為R2 =
O.9923，根據(jù)回歸方程計(jì)算出該試紙對(duì)CM的IC5tl為437. 62pg/mL，該試紙條的最低檢測(cè)限為111.85pg/mL?？梢?jiàn)，該試紙條對(duì)CM具有較高的靈敏度。其他例子中試紙條的檢測(cè)結(jié)果和此類(lèi)似。參見(jiàn)圖4。2、特異性的檢測(cè)以CM的同類(lèi)藥物萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅以及磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、噁喹酸、青霉素、四環(huán)素氯霉素、新霉素、喹こ醇作為競(jìng)爭(zhēng)物，配置上述標(biāo)品的濃度為lmg/mL，用實(shí)施例一的試紙條檢測(cè)其抑制率，以試紙條對(duì)CM的IC5tl與各競(jìng)爭(zhēng)物的IC5tl的百分比為其交叉反應(yīng)率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表I?？煽闯觯嚰垪l的特異性較好，與其他藥物均無(wú)交叉反應(yīng)。其
他例子中試紙條的檢測(cè)結(jié)果和此類(lèi)似。
權(quán)利要求
1.ー種磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的檢測(cè)西馬特羅的免疫層析試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、磷光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其特征在于在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)西馬特羅的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；所述磷光抗體纖維層采用吸附磷光抗體的玻璃纖維棉制成，磷光抗體采用磷光二氧化娃納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述磷光二氧化硅納米顆粒的粒徑為100-220nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅抗體由以下方法制備，具體步驟為 (O磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化將Ig磷光二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，將得到的沉淀用無(wú)水こ醇洗滌，再將沉淀分散在無(wú)水こ醇中； (2)西馬特羅抗體的標(biāo)記將西馬特羅抗體置于2-8°C、濃度O. 025-0. 05 mol/L、pH9. 5的CBS緩沖液中透析8_12h ;將氨基化的磷光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4_8min,用所述CBS緩沖液洗漆，然后與透析的西馬特羅抗體混合均勻，于2-8°C反應(yīng)，過(guò)夜，得到磷光二氧化硅的抗體復(fù)合物；向所得的抗體復(fù)合物中按I :50-120的體積比加入O. 5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2_8°C反應(yīng)8_12h ;用質(zhì)量濃度2%的BSA溶液封閉過(guò)夜，10000-13000rpm離心4_8min，得沉淀；將沉淀用O. 5mL、濃度O.01-0. 02mol/L、pH7. 8 的 Tris-HCL 緩沖液洗滌后，4°C保存，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜；偶聯(lián)西馬特羅的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡為平行排列的“ Il ”直線(xiàn)式印跡，或“十十”字型排列印跡，或“Τ ~Γ”字型排列印跡，或“ _L I”字型排列印跡，或“トト”字型排列印跡，或“ H ”字型排列印跡。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫層析試紙條，其特征是所述保護(hù)層為吸附纖維層、磷光抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜；在吸附纖維層與磷光抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線(xiàn)，該樣品標(biāo)記線(xiàn)偏向吸附纖維層ー側(cè)O. 3-0. 7cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條，其特征在于所述磷光二氧化硅納米顆粒采用以下方法制備 按O. 75-1. 5 2 3的體積比量取濃氨水、こ醇、水，置于反應(yīng)器中混合，攪拌均勻，得到反應(yīng)液A ;將正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的體積比混合，攪拌均勻得到溶液B ;將溶液B迅速加入到反應(yīng)液A中，室溫反應(yīng)2h ；6500rpm離心5min,得沉淀；將沉淀用こ醇超聲波洗滌，80°C烘干，于400-800°C下煅燒2-4h，即得到磷光二氧化硅納米顆粒。
8.權(quán)利要求I所述免疫層析試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟 (1)西馬特羅單克隆抗體或多克隆抗體的制備； (2)磷光抗體纖維層的制備包括磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化、西馬特羅抗體的標(biāo)記和纖維層的制備； (3)吸附纖維層的制備吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜制成； (4)纖維素膜層的制備纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，烘干后備用； (5)試紙條的組裝將吸附纖維層、磷光抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從右至左依次貼在帶有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于磷光抗體纖維層的制備方法如下 (O磷光二氧化硅納米顆粒的氨基化將Ig磷光二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;將回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，得到的沉淀用無(wú)水こ醇洗滌，再將沉淀分散在無(wú)水こ醇中； (2)西馬特羅抗體的標(biāo)記將西馬特羅抗體置于2-8°C、濃度O.025-0. 05 mol/L、pH9. 5的CBS緩沖液中透析8_12h ;將氨基化的磷光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4_8min,用所述CBS緩沖液洗漆,然后與透析的西馬特羅抗體混合均勻，于2-8°C反應(yīng)，過(guò)夜，得到磷光二氧化硅的抗體復(fù)合物；向抗體復(fù)合物中按I :50-120的體積比加入O. 5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2-8°C反應(yīng)8_12h ;用質(zhì)量濃度2%的BSA溶液封閉過(guò)夜，10000-13000rpm離心4-8min，得沉淀；將沉淀用O. 5mL、濃度O. 01-0. 02mol/L、pH7. 8的Tris-HCL緩沖液洗滌后，4°C保存； (3)磷光抗體纖維層的制備將制備的磷光二氧化硅抗體復(fù)合物用含有2%酪蛋白的Tris緩沖液稀釋100-1000倍，然后將作為標(biāo)記物墊的玻璃纖維棉浸入其中，以浸濕為準(zhǔn)，凍干，備用；所述Tris緩沖液的濃度為10 mM，pH值為7.8。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的制備方法，其特征在于所述磷光二氧化硅納米顆粒采用以下方法制備 按O. 75-1. 5 2 3的體積比量取濃氨水、こ醇、水，置于反應(yīng)器中混合，攪拌均勻，得到反應(yīng)液A ;將正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的體積比混合，攪拌均勻得到溶液B ;將溶液B迅速加入到反應(yīng)液A中，室溫反應(yīng)2h ；6500rpm離心5min,用こ醇超聲波洗漆,80°C烘干,于400-800°C下煅燒2-4h，即得到磷光二氧化硅納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅免疫層析試紙條及其制備方法。試紙條含有支撐層、吸附層和保護(hù)層，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、磷光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)西馬特羅的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的隱形對(duì)照印跡；磷光抗體纖維層采用吸附磷光抗體的玻璃纖維棉制成，磷光抗體采用磷光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的西馬特羅抗體。本發(fā)明的試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便，直觀(guān)，準(zhǔn)確，可進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，最低可檢測(cè)到匹克級(jí)的痕量殘留，適用范圍廣，成本低，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102866252SQ20121028158
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者職愛(ài)民, 張改平, 胡驍飛, 趙東, 宋春美, 楊繼飛 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院