專利名稱：對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)雜環(huán)化合物合成技術(shù)領(lǐng)域，涉及對(duì)-異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物及其制備方法以及該螯合物作為均相時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑用于免疫分析的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
時(shí)間分辨熒光免疫分析法以其靈敏度高、快速、自動(dòng)化分析儀器的使用及技術(shù)的發(fā)展使這一分析法得到迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。該方法是以鑭系元素為標(biāo)記物，用來(lái)標(biāo)記抗體(或抗原)、寡核苷酸、生物大分子、靶細(xì)胞等，然后進(jìn)行抗原抗體的免疫反應(yīng)生成免疫復(fù)合物，或進(jìn)行核酸雜交分析、檢測(cè)DNA序列等，其原理是鑭系離子如銪、釤、鋱、鏑等與具有紫外吸收的配基螯合，受某一波段的紫外光激發(fā)后，配基能將激發(fā)態(tài)能轉(zhuǎn)移給鑭系離子，發(fā)射強(qiáng)度高且壽命長(zhǎng)的熒光光譜，不同的元素具有不同的熒光光譜且譜線窄。而且激發(fā)光(300-350nm)與所要測(cè)量的發(fā)射光譜(490-643nm)之間有很長(zhǎng)的Stokes位移，發(fā)射的熒光壽命長(zhǎng)(從微秒到毫秒級(jí))，所以用其作標(biāo)記物通過(guò)光譜分辨和時(shí)間分辨，待本底熒光(納秒級(jí))淬滅后再進(jìn)行標(biāo)記物或標(biāo)記物復(fù)合物的熒光測(cè)量，用作微量生物活性物的測(cè)量大大提高了靈敏度。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)大量的報(bào)道了時(shí)間分辨熒光分析的研究進(jìn)展并對(duì)1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷的衍生物作為核磁共振顯像造影劑和放射性藥物的潛在配體已進(jìn)行了廣泛的研究。但是將其衍生物與鑭系元素螯合作為時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種全新的對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物，它是鋼性穴狀化合物，可螯合銪、釤、鋱等鑭系元素形成鏊合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開(kāi)了對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合劑的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于公開(kāi)了對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸鑭系元素螯合物用來(lái)標(biāo)記抗體(或抗原)進(jìn)行熒光免疫分析，遺傳學(xué)診斷，各種病原體診斷，癌基因、抑癌基因的檢出等，還可標(biāo)記DNA做成探針進(jìn)行基因診斷、酶分析、受體分析等等。
發(fā)明的技術(shù)方案如下 具有下述結(jié)構(gòu)的對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+ 本發(fā)明所述螯合物的制備方法，其特征在于， (1)化合物III與化合物V進(jìn)行成環(huán)縮合反應(yīng)，制得化合物VI；
(2)將化合物VI水解制得化合物VII； (3)在有機(jī)溶劑中，將化合物VII與對(duì)氟硝基苯進(jìn)行取代反應(yīng)，制得化合物VIII；所述的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、吡啶、DMF、乙腈、氯仿等等。

(4)化合物VIII與溴乙酸反應(yīng)，制得化合物IX。
(5)化合物IX與R螯合，得到螯合物X；其中R為銪、釤、鋱或鏑離子。
(6)化合物X還原制得化合物XI。
(7)化合物X與硫代光氣反應(yīng)，得到化合物I。

本發(fā)明所述的對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物的制備方法其中化合物VII與對(duì)氟硝基苯的摩爾比為1∶0.2-0.5mol反應(yīng)溫度50-80℃，反應(yīng)時(shí)間6-8小時(shí)。
其中化合物VIII溴乙酸的摩爾比為1∶4-6，反應(yīng)溫度30-60℃，反應(yīng)時(shí)間4-8小時(shí)。
其中化合物IX還原所用還原劑為5-10％Pd/C，化合物IX與還原劑的摩爾比為1∶0.03-0.06mol，反應(yīng)溫度15-30℃，反應(yīng)時(shí)間3-5小時(shí)。
其中化合物X與硫代光氣的摩爾比為1∶3-5，反應(yīng)溫度20-30℃，反應(yīng)時(shí)間1-3小時(shí)。
本發(fā)明所述的1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸，其制備方法中對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)方法做了一定的改進(jìn) 參考文獻(xiàn)①EUR.J.MED.CHIM.THER.1984.19(5)42；②Inors.Chem.1991.302092；③CN 1225461C；具體如下 1)生成N，N′，N″-三對(duì)甲苯磺酰二乙烯三胺，反應(yīng)溫度20-35℃，反應(yīng)時(shí)間2-5小時(shí)，重結(jié)晶溶劑甲醇或乙醇。
2)生成的N，N′-二對(duì)甲苯磺酰羥乙基-N，N′-二對(duì)甲苯磺酰乙二胺，反應(yīng)溫度-5-5℃，反應(yīng)時(shí)間1-3小時(shí)，重結(jié)晶溶劑甲醇或乙醇。
3)N，N′，N″-三對(duì)甲苯磺酰二乙烯三胺可和甲醇鈉(乙醇鈉)或NaH成鹽。4)1，4，7，10，13-五對(duì)甲苯磺酰五氮雜環(huán)十五烷反應(yīng)溫度100-120℃，反應(yīng)時(shí)間3-5小時(shí)。
本發(fā)明的對(duì)-異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合劑的合成路線如下

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了對(duì)-異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物作為在制備用于時(shí)間分辨熒光免疫分析方面的應(yīng)用。特別是在標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行熒光免疫分析方面的應(yīng)用。具有代表意義的螯合物為對(duì)-異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸銪。用此螯合劑標(biāo)記抗體(或抗原)用于時(shí)間分辨熒光免疫分析，檢測(cè)激素，癌標(biāo)志物，或用于標(biāo)記寡核苷酸，進(jìn)行基因診斷等等。

具體實(shí)施例方式 為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述對(duì)-異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合劑制備實(shí)施實(shí)例。典型的是對(duì)-異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸銪螯合物制備方法，這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。
下面是對(duì)異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸銪螯合物的合成路線
參考實(shí)施例 實(shí)施例1 N，N’-二對(duì)甲苯磺酰羥乙基-N，N’-二對(duì)甲苯磺酰乙二胺(化合物III) 77g(0.4mol)對(duì)甲苯磺酰氯在100ml吡啶中，劇烈攪拌下，滴加14.8g(0.1mol)N，N’-二(2-羥乙基)乙二胺在200ml吡啶中的溶液，滴畢室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶液倒入250ml冰和250ml濃鹽酸中過(guò)濾，水洗，乙醇重結(jié)晶，得淡黃色晶體，mp99-100℃(70％)。
實(shí)施例2 N，N’，N”-三對(duì)甲苯磺酰二乙三胺(化合物IV) 10.3g(0.1mol)二乙烯三胺加106ml(0.4mol)氫氧化鈉溶液中，在劇烈攪拌下，0℃滴加57.1g(0.3mol)對(duì)甲苯磺酰氯在375ml的乙醚溶液，加畢，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，過(guò)濾得粗品，用乙醇重結(jié)晶，mp200-202℃(60％) 實(shí)施例3 N，N’，N”-三對(duì)甲苯磺酰二乙三胺二鈉鹽(化合物V) 56.4g(0.1mol)化合物2加到13.6g(0.2mol)乙醇鈉在150ml無(wú)水乙醇溶液80℃加熱1小時(shí)，減壓除去溶劑，真空干燥得到產(chǎn)品。
制備實(shí)施例 實(shí)施例1 1，4，7，10，13-五對(duì)甲苯磺酰基五氮雜環(huán)十五烷(化合物VI) 先加入100ml DMF，然后通氮?dú)猓?00℃加熱，攪拌下緩慢同時(shí)滴加76.4g(0.1mol)化合物III在200ml DMF的溶液和61g(0.1mol)化合物V在200ml DMF的溶液，滴畢，棕色反應(yīng)液在100-110℃反應(yīng)3小時(shí)。冷卻，攪拌下，倒入水中，濾出沉淀，水洗，醇洗，用乙醇重結(jié)晶得白色晶體mp289-290℃(文獻(xiàn)290-291℃，278-280℃)(65％)。
實(shí)施例2 1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷(化合物VII) 2.0g(2.03mmol)化合物VI和10ml98％濃硫酸混合，通氮?dú)?，?80℃加熱攪拌，水解反應(yīng)4-5小時(shí)，得棕灰色液體。冰水冷卻下緩慢從滴液漏斗加入50ml乙醚，灰色沉淀很快過(guò)濾立即用乙醚洗，然后溶解在20ml水中，用過(guò)量NaOH片堿，調(diào)成pH 8左右，用CHCl3提取，除去溶劑得到白色結(jié)晶，乙醚重結(jié)晶，得到結(jié)晶mp90-91℃(文獻(xiàn)100-102℃)(80％)。
1HNMR，δ2.774(s，20H，CH2)；1.829(s，5H，NH)。
實(shí)施例3 1’-對(duì)硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷(化合物VIII) 43.82g(0.20mol)化合物VII溶解在500ml乙腈中，60℃攪拌加50ml水，然后該溶液滴加到對(duì)氟硝基苯(7.66g，0.054mol)的50ml乙腈溶液，60℃反應(yīng)8小時(shí)，過(guò)濾，粗品溶于1升沸水中，得到的溶液用水稀釋1∶1上柱(

XAO1600)用水洗去未反應(yīng)的原料，用甲醇洗脫，除去甲醇得產(chǎn)品。mp170-172℃，(收率73.1％)。
實(shí)施例4(與銪離子螯合) 1-對(duì)硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸(化合物IX) 29.64g(0.21mol)溴乙酸攪拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH調(diào)PH＝10，在50℃條件下反應(yīng)6小時(shí)，冷卻，過(guò)濾，濾液用鹽酸調(diào)PH＝3，再用水1∶1稀釋后上柱(

XAO1600)，用水洗去未反應(yīng)的原料，用甲醇洗，蒸干得到的產(chǎn)品與10.32g(0.04mol)EuCl3在pH為6的醋酸緩沖溶液中螯合得到相應(yīng)的銪螯合物。
實(shí)施例5 1-對(duì)氨基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸(化合物X) 11.39g(0.02mol)化合物X的50ml水溶液中，加入5％Pd/C 0.7g室溫催化氫化，大約4小時(shí)，過(guò)濾，濾液濃縮得到粗品，不需純化，直接進(jìn)行下步反應(yīng)。
實(shí)施例6 1-對(duì)異硫氰基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸(化合物I) 對(duì)氨基苯基化合物(化合物X)4.13g(6mmol)溶于50ml水中，加NaHCO3至pH8.5，室溫滴加CSCl2(硫代光氣)1.07g(9mmol)的氯仿溶液20ml，滴畢，室溫?cái)嚢?h。分去CHCl3層，水層用CHCl3提取后，合并有機(jī)層，減壓蒸去CHCl3，殘?jiān)?含產(chǎn)品)用半制備高壓液相C18柱分離，收集相應(yīng)的部分，減壓濃縮至干，即得到最終對(duì)異硫氰基銪螯合物。
1H NMR(D2O)δ＝7.15(d，2H)，6.7(d，2H)，3.6(s，4H)，3.4(s，4H)，3.3(s，2H)，3.27(s，8H)，3.1(s，4H)。
實(shí)施例7 1-對(duì)硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸(化合物IX) 表1鑭系元素 29.64g(0.21mol)溴乙酸攪拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH調(diào)pH＝10，在50℃條件下反應(yīng)6小時(shí)，冷卻，過(guò)濾，濾液用鹽酸調(diào)pH＝3，再用水1∶1稀釋后上柱(

XAO1600)，用水洗去未反應(yīng)的原料，用甲醇洗，蒸干得產(chǎn)品與表1的鑭系元素在pH為6的醋酸緩沖液中螯合得到相應(yīng)的鑭系元素螯合物。
權(quán)利要求
1、具有下述結(jié)構(gòu)的對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+I。
2、權(quán)利要求1所述螯合物的制備方法，其特征在于，
(1)化合物III與化合物V進(jìn)行成環(huán)縮合反應(yīng)，制得化合物VI；
(2)將化合物VI水解制得化合物VII；
(3)在有機(jī)溶劑中，將化合物VII與對(duì)氟硝基苯進(jìn)行取代反應(yīng)，制得化合物VIII；
(4)化合物VIII與溴乙酸反應(yīng)，制得化合物IX；
(5)化合物IX與R螯合，得到螯合物X；
(6)化合物X還原制得化合物XI；
其中R為銪、釤、鋱或鏑離子；
(7)化合物X與硫代光氣反應(yīng)，得到化合物I。
3、如權(quán)利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物VII與對(duì)氟硝基苯的摩爾比為1∶0.2-0.5mol；反應(yīng)溫度50-80℃，反應(yīng)時(shí)間6-8小時(shí)。
4、如權(quán)利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物VIII∶溴乙酸的摩爾比為1∶4-6mol，反應(yīng)溫度30-60℃，反應(yīng)時(shí)間4-8小時(shí)。
5、如權(quán)利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物IX還原所用還原劑為5-10％Pd/C，化合物IX與還原劑的摩爾比為1∶0.03-0.06mol，反應(yīng)溫度15-30℃，反應(yīng)時(shí)間3-5小時(shí)。
6、如權(quán)利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物X與硫代光氣的摩爾比為1∶3-5mol，反應(yīng)溫度20-30℃，反應(yīng)時(shí)間1-3小時(shí)。
7、權(quán)利要求1所述螯合物在制備用于時(shí)間分辨熒光免疫分析方面的應(yīng)用。
8、權(quán)利要求1所述螯合物在標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行熒光免疫分析方面的應(yīng)用。
9、如權(quán)利要求8所述螯合物，其特征在于所述螯合物為對(duì)異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環(huán)十五烷四乙酸銪螯合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物及其制備方法，其中包括縮合、水解、取代反應(yīng)，生成物與溴乙酸縮合，再和鑭系元素螯合得到對(duì)硝基苯基五氮雜環(huán)四乙酸，再經(jīng)5％Pd/C還原，最后和硫代光氣反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物I。本發(fā)明的對(duì)異硫氰基苯基五氮雜環(huán)四乙酸螯合物為未知化合物，形成的鋼性穴狀化合物和銪、銦、釤、鋱等鑭系元素螯合，經(jīng)元素分析、紅外光譜、紫外光譜、核磁及質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)，所制備的螯合物主要用做時(shí)間分辨熒光免疫分析。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101348468SQ200710058139
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2007年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日
發(fā)明者施培基, 王榮先, 浩 王, 李美佳, 周曉靚, 傅榕賡, 鵬 尹, 黃海舟, 呂茜茜 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所