專利名稱：截短tau蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在阿耳茨海默氏病及相關疾病中特異發(fā)現(xiàn)的N端和C端截短患病形式的tau蛋白。
本發(fā)明還涉及用于篩選和測試有效抑制、中和和消除N端和C端雙重截短tau蛋白或預防其形成的潛在藥物的方法，以及用于篩選和測試其作用模式以中和由所述雙重截短患病形式tau蛋白引起的微管裝配和/或動力學改變?yōu)榛A的潛在藥物的方法。
阿耳茨海默氏病是癡呆的最常見原因。在少于5％的病例中，阿耳茨海默氏病與淀粉狀前體蛋白、早衰素(presenilin)-1、或早衰素-2基因中的一種或多種特定突變幾乎完全共分離(1)；而在超過95％的病例中，尚不清楚確切的病因。
與病因無關，阿耳茨海默氏病的組織病理學特征是存在具有配對螺旋細絲(PHF)的神經(jīng)原纖維纏結的大量神經(jīng)元和作為大腦中老年斑主要成分的β-淀粉狀蛋白的胞外沉積。盡管現(xiàn)在還不知道阿耳茨海默氏病的這兩個標志性損傷之間直接相互關系(如果有的話)的確切本質，但是神經(jīng)原纖維變性的存在似乎是疾病的臨床表現(xiàn)即癡呆所必需的(2、3、4)。神經(jīng)原纖維變性的存在表現(xiàn)為神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangle)、營養(yǎng)不良神經(jīng)突、和神經(jīng)細絲(neuropilthread)。這些結構的主要蛋白質亞基是微管相關蛋白tau(5、6)。
在健康人大腦中，tau存在通過衍生自單一基因座的轉錄本的可變mRNA剪接生成的六種蛋白質同種型(isoform)。tau蛋白的不同之處在于它們在分子的C末端附近是包含三個(t3L、t3S、或t3)還是四個(t4L、t4S、或t4)32或32個氨基酸的微管結合結構域(重復，R)，而且在N端部分包含兩個(t3L、t4L)、一個(t3S、t4S)、或零個(t3、t4)29個氨基酸的插入片段(7、8)。在生理條件下，tau蛋白參與微管的裝配、空間組織、穩(wěn)定和行為。在生理條件下，健康人大腦中存在該蛋白質的六種同種型。然而，在AD中，已知tau蛋白經(jīng)歷許多不同的翻譯后修飾(超磷酸化、便在化、糖基化)。關于tau基因中特定突變和與17號染色體連鎖的帕金森氏病額顳癡呆疾病(FTDP-17)的共分離的最近發(fā)現(xiàn)證實了tau蛋白中的某些異?？赡苁腔疾€體中神經(jīng)變性和癡呆的主要原因(9、10)。還不知道導致阿耳茨海默氏病中tau修飾和配對螺旋細絲(PHF)形成的分子事件。這解釋了大量病理學事件諸如tau蛋白的病理性再分布、軸突轉運失敗、或維持軸突微管功能失敗的觀察結果(11、12、13)。至今，最近發(fā)現(xiàn)任何蛋白質都能在體外形成細絲(14)質疑PHF細絲形成在阿耳茨海默氏病中的重要性。
許多作者認為阿耳茨海默氏病中配對螺旋細絲的形成代表以異常磷酸化為基礎的神經(jīng)原纖維病理學的主要事件。PHF裝配的tau蛋白以磷酸化依賴的方式與某些抗體發(fā)生反應，說明特定的磷酸化狀況(15、16)。另外，觀察到PHF衍生的tau蛋白在SDS凝膠中顯示電泳遷移率降低，這可能與它的磷酸化模式有關(Steiner等人，EMBO J.，93539-3544，1990)。類似的，有人提出PHF衍生tau因磷酸化而相對于正常tau蛋白具有較低的微管親和力，因為當正常tau在體外通過某些激酶磷酸化時發(fā)現(xiàn)相似作用(17、18)。tau是最易溶解的已知蛋白質之一(19、20、21)，因此它在阿耳茨海默氏病中的聚集特別神秘。另一方面，還不知道導致阿耳茨海默氏病中細絲形成的tau蛋白修飾方式的機制。tau的磷酸化影響tau形成聚集體的潛力，對微管聚合產(chǎn)生刺激性或抑制性作用，這可能依賴磷酸化位點(22-27)。許多體外研究證明在存在還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、不飽和游離脂肪酸、RNA或葡糖胺聚糖時，正常tau可以轉變成細絲(28-31、38)。另外，細絲形成過程還可以通過由Cys322氧化生成的交聯(lián)tau的存在得到加速(32)。在不同細絲裝配研究中變化的參數(shù)，包括tau蛋白濃度、pH和離子強度，比生理條件下的細胞質水平高許多倍。掃描透射電子顯微鏡術(STEM)對體外形成tau細絲的檢驗顯示，這些細絲與天然的配對螺旋細絲不同(33)。在缺乏聚糖或RNA時，在含有未磷酸化(ubiquitination)或磷酸化野生型tau的樣品中檢測不到PHF樣細絲。此外，有人提出磷酸化在阿耳茨海默氏病中可能發(fā)揮保護作用(34)。對于便在化和糖基化，提出了導致PHF裝配的tau修飾導致微管分解并干擾重要的神經(jīng)元過程諸如軸突轉運的類似建議(30、35、36、37)。然而，上述翻譯后修飾都不能獨自提供關于導致其與阿耳茨海默氏病臨床表現(xiàn)有關的機能失調的tau變化起動的分子解釋。
因此，仍然不清楚上述哪種tau修飾涉及阿耳茨海默氏病的發(fā)病機理。
至今尚未獲得關于導致早期tau蛋白復合物形成的翻譯后事件的模式或調控的可靠資料。為了預防這些復合物的形成和為了中和其任何相關病理作用，需要闡明患病tau的精確分子本質和正常tau轉變成其N端和C端雙重截短形式的調控機制。這一詳細知識將能夠構建用于阿耳茨海默氏治療學和診斷學的工具。
Zelman等人(J.P.Neurochem.，72(2)741-750，1999)提出微管結合蛋白tau的切割產(chǎn)物存在于外傷性腦損傷個體的腦脊髓液中并反映了神經(jīng)元損傷。然而，在此報告中沒有做出與阿耳茨海默氏病的聯(lián)系。
Novak(Acta Virologica，38173-189，1994)在關于“tau介子”的這篇綜述中報告了用廣譜蛋白酶“鏈霉蛋白酶(pronase)”人工生成的PHF(“配對螺旋細絲”)的最低蛋白酶抗性單位。
Kontsekova等人(J.Immunol.Meth.，185245-248，1995)公開了用于免疫分析的重組人截短tau蛋白的快速純化方法，其中利用了人tau蛋白的熱抵抗力。其中使用的重組tau類似物的結構或生物特性或功能都未有描述。
在Novak等人(EMBO J.，12(1)365-370，1993)中，在體外人工制備了配對螺旋細絲(PHF核心)，其中通過蛋白酶鏈霉蛋白酶的體外消化回收了最小的蛋白酶抗性tau單位。使用單克隆抗體MN423檢測該最小的蛋白酶抗性tau單位。然而，此文中描述的tau多肽不具有與“真實世界”tau蛋白共同的生物結構性病理特性，尤其是與阿耳茨海默氏病有關的tau蛋白。
Fasulo等人(Alzheimer′s Research，2(5)195-200，1996)報告了PHF核心tau重組類似物的過度表達不足以在配對螺旋細絲中誘發(fā)其tau聚集和裝配。這些資料與Abraha等人(J.Cell.Science，113(21)3737-3745，2000)的發(fā)表物相反，顯然是由于此發(fā)表物中描述的不常見的非生理學測定系統(tǒng)(來自猴腎的細胞系)。
Fasulo等人(J.Neurochem.，75624-633，2000)描述了誘發(fā)凋亡的tau片段。然而，本發(fā)明中描述的阿耳茨海默氏病相關tau蛋白都不能誘發(fā)凋亡。
Esposito等人(J.Peptide Science，6550-559，2000)描述了tau蛋白的C末端19個氨基酸和正常健康tau蛋白。Novak等人(Chem.Papers，52429-430，1998)和Ugolini等人(NeuroReport，83709-3712，1997)的論文也涉及C末端截短tau蛋白還有凋亡。最近的發(fā)表物顯示阿耳茨海默氏病與凋亡過程無關。
在Abraha等人(J.Cell Science，113(21)3737-3745，2000)中描述了體外實驗以顯示tau蛋白單一結構域對細絲形成的貢獻。因此，裝配了在體外生成的一組重組tau分子。沒有生成或測定這些蛋白質在細菌中的生物學或病理學活性。此外，此論文中沒有描述關于衍生自阿耳茨海默氏病患者大腦的tau蛋白的資料。
在Jicha等人(J.Neuroscience Research，55713-723，1999)中描述了對單克隆抗體Alz50和MC-1的表位的分子分析。這兩種抗體都依賴tau分子的功能性N末端，尤其是第7-9位氨基酸。此文件中沒有提及tau截短。
Brandt等人(J.Biol.Chem.，2683414-3419，1993)分析了正常健康人tau蛋白的不同結構域。為此，在細菌中生成了重組tau片段。然而，此文件中沒有描述阿耳茨海默氏相關截短tau片段。
Philippe等人(J.Neuroscience Research，46709-719，1996)公開了抗淀粉狀前體蛋白單克隆抗體。作者描述了tau反應性抗體的生成，盡管這種抗體最初是針對淀粉狀前體蛋白而生成的。此文件中沒有描述病理學相關阿耳茨海默氏tau片段。
WO 94/18560 A1公開了用于在腦脊髓液中檢測人tau蛋白的免疫測定法，用于檢測細胞中樞神經(jīng)細胞病患者。此測定法不能鑒別正常tau與中樞神經(jīng)細胞病患者的tau，但是能夠檢測樣品中tau蛋白的總量。
因此，本發(fā)明的一個目標是提供這些與阿耳茨海默氏病神經(jīng)元病理性機能失調有關的可靠標記。此外，用于確認這些tau衍生多肽的存在并測定其活性的合適工具將是用于阿耳茨海默氏診斷學和治療學的有用手段。
因此，本發(fā)明提供了N端和C端雙重截短tau分子，特征在于下列特征(“IA型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前236個N端氨基酸和至少后45個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；-所述分子在體外微管裝配實驗中阻止正常tau蛋白促進微管裝配；且-所述分子在體外微管裝配實驗中對促進微管裝配的所述阻止可以通過針對該分子的特異性抑制性中和單抗來消除。
在下文中，稱謂“N端和C端雙重截短tau蛋白”用于描述在阿耳茨海默氏病大腦中出現(xiàn)且與阿耳茨海默氏病神經(jīng)元病理性機能失調密切相關的兩類截短tau衍生物。具體而言，這些蛋白質代表了通過修飾微管相關生物學功能諸如微管裝配或胞內(nèi)轉運來展現(xiàn)病理功能的一類分子。在下文中，術語“蛋白質復合物”用于由tau和/或雙重截短tau蛋白的生理學相關分子組成的同型二聚體、異型二聚體或多聚體復合物形式的N端和C端雙重截短tau蛋白。
在用于本文時，術語“tau”指健康人大腦中存在的在它們的微管結合結構域中包含三重復(tau44)和四重復(tau43)的那組最短的天然存在同種型，如先前所述(39、40)tau43(383個氨基酸，缺失外顯子2和3(第45-102位)；tau44(352個氨基酸，缺失外顯子2、3、和10(分別是第45-102位和第275-307位)。在下文中，術語“野生型tau”與“正常tau蛋白”同義，指衍生自健康大腦的tau蛋白。
合適微管裝配實驗(或者也常常稱為“微管聚合實驗”)是例如(19)和(20)中所述。術語“阻止”包括對正常tau促進活性20％或更多，優(yōu)選50％或更多的任何顯著抑制。
依照本發(fā)明特別優(yōu)選的IA型tau分子包含選自SEQ ID NO1-3的氨基酸序列。
另外，本發(fā)明提供了N端和C端雙重截短tau分子，特征在于下列特征(“IB型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前238個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前207個N端氨基酸和至少后50個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；且-所述分子在體外微管裝配實驗中不阻止野生型tau蛋白促進微管裝配。
優(yōu)選的IB型tau分子的特征是包含選自SEQ ID NO4-10的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了N端和C端雙重截短tau分子，特征在于下列特征(“IIA型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前68個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前68個N端氨基酸和至少后20個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；-所述分子在體外微管裝配實驗中具有比野生型tau更高的微管裝配促進活性；-所述微管裝配促進活性可以在體外微管裝配實驗中通過針對該分子的特異性抑制性中和單抗來消除；且-所述分子的病理活性依賴其由微管聚合促進活性定義的與微管網(wǎng)絡的結合。
優(yōu)選的是，增強的微管裝配促進活性是分光光度法測量時比野生型tau高至少20％，尤其是高至少50％。
優(yōu)選的IIA型tau分子的特征是包含選自SEQ ID NO11-18的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明提供了N端和C端雙重截短tau分子，特征在于下列特征(“IIB型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前68個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前68個N端氨基酸和至少后20個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；且-所述分子在體外微管裝配實驗中具有與野生型tau不同的病理性微管裝配促進活性。
依照本發(fā)明優(yōu)選的IIB型tau分子的特征是包含選自SEQ ID NO19和20的氨基酸序列。
依照本發(fā)明的新型tau多肽(IA、IB、IIA、和IIB)具有典型且獨特的定位特征，因為它們專門位于阿耳茨海默氏患病大腦組織中。此外，這些多肽與未聚合微管蛋白(α/β二聚體)和聚合形式(如微管)的相互作用也是獨特的。
依照另一個方面，本發(fā)明提供了用于制備依照本發(fā)明的分子(IA、IB、IIA、和IIB型)的方法，特征是通過下列步驟a)構建攜帶雙重截短tau分子編碼序列的重組原核表達質粒，其中缺失包括至少前236個氨基酸和后40個氨基酸或前68個氨基酸和后20個氨基酸或其組合；b)在容許表達所述N端和C端雙重截短tau分子的條件下培養(yǎng)所述細菌；
c)收集細菌，優(yōu)選通過離心；d)重懸細菌沉淀；e)超聲處理所述細菌；f)通過凝膠過濾將所述經(jīng)過超聲處理的細菌分級；并g)通過微管裝配實驗監(jiān)測得到的級分的活性，從而鑒定I型和II型tau分子的不同活性。
優(yōu)選的是，截短如上文關于IA、IB、IIA和IIB型分子的定義。微管裝配實驗活性優(yōu)選如上文的定義，尤其是關于IA。
此外，本發(fā)明提供了用于制備依照本發(fā)明的分子的方法，特征是通過下列步驟a)提供阿耳茨海默氏患病大腦組織；b)將所述患病大腦組織在緩沖液尤其是Tris緩沖液中勻漿；c)將所述經(jīng)過勻漿的大腦組織進行硫酸銨沉淀；d)重新溶于PIPES緩沖液；e)通過凝膠過濾將所述重新溶解的材料分級；并f)通過微管裝配實驗監(jiān)測得到的級分的活性，從而鑒定I型和II型tau分子的不同活性。
微管裝配實驗活性優(yōu)選如上文的定義，尤其是關于IA。
本發(fā)明還提供了用于測試有效分解(disassembling)IA型分子與微管蛋白的復合物的物質的方法，包括下列步驟a)容許IA型分子與微管蛋白之間形成蛋白質復合物；并b)將蛋白質復合物與待測物質一起保溫，并鑒定那些容許野生型tau的微管裝配促進能力恢復的物質。
另外，本發(fā)明還提供了用于測試在表達野生型tau的細胞系統(tǒng)中有效抑制IA型分子起動與微管蛋白形成復合物的物質的方法，包括下列步驟a)將編碼IA型分子的功能基因導入表達正常tau蛋白的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；b)容許IA型分子與微管蛋白分子之間形成蛋白質復合物；
c)將待測物質施加到包含所述復合物的細胞上；并d)檢驗所述物質對上文定義的IA型生物學活性的效果。本發(fā)明還提供了用于將微管體外轉變成病理狀態(tài)的方法，特征是將微管蛋白與IIA型在容許所述IIA型分子與微管相互作用的生理條件下保溫而生成病理性微管。
依照另一個方面，本發(fā)明提供了用于對能夠中和IIA型分子的病理學效果的物質篩選它們消除和/或中和IIA型分子并恢復由II型分子引起的生理性微管參數(shù)和功能的特性的方法，包括下列步驟a)在存在IIA型分子和微管蛋白時形成病理性微管；b)將物質、IIA型和微管蛋白的混合物與待篩選物質一起保溫；并c)檢驗在消除由IIA型分子引起的病理性微管形成方面的結果。依照本發(fā)明，還提供了用于測試有效抑制IIA型分子在促進異常微管形成中的體內(nèi)活性和在表達IIA型分子的細胞系統(tǒng)中的功能的物質的方法，包括下列步驟a)將編碼IIA型分子的功能基因導入表達野生型tau的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；b)容許IIA型tau分子與微管之間形成復合物，由此所述復合物參與病理性微管的形成；c)將待測物質施加到包含所述復合物的細胞上；并d)檢驗所述物質對IIA型生物學活性的效果，尤其是對微管網(wǎng)絡及其相關功能的修飾。
依照另一個方面，本發(fā)明還提供了表達依照本發(fā)明的分子(IA、IB、IIA或IIB型)的轉基因動物，尤其是IA和/或IIA。
本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明的轉基因動物作為阿耳茨海默氏病的動物模型的用途，尤其是用于篩選和測試治療阿耳茨海默氏病的藥物。
通過本發(fā)明提供了包含依照本發(fā)明的分子(IA、IB、IIA或IIB)尤其是IA和IIA和制藥學可接受載體尤其是佐劑的疫苗。
本發(fā)明還提供了IA型分子與野生型tau形成復合物起動的抑制劑。這些抑制劑的具體范例是包含結合部分像單克隆抗體DC44的物質，尤其是DC44或其結合片段，諸如Fab，所述DC44以保藏號02060767保藏于歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，Porton Down，Salisbury，英國)。
由此，本發(fā)明提供了(1)N端和C端截短患病形式的tau蛋白的分子和功能鑒定和表征。這些分子通過修飾微管相關生物學功能諸如微管裝配或胞內(nèi)轉運而在阿耳茨海默氏病中發(fā)揮它們的病理學功能；(2)對蛋白質表位特異的抗體；(3)中和所述蛋白質的病理學活性的抗體；(4)用于篩選并測試有效抑制、中和和消除N端和C端雙重截短tau蛋白或預防其形成的治療性候選藥物(包括抗體)的方法；(5)可用于藥物篩選的攜帶編碼各種雙重截短tau蛋白的基因構建體作為轉基因或轉基因組合的動物模型的開發(fā)；(6)包含針對所述雙重截短tau蛋白和針對它們的起源所涉及的蛋白酶的抑制劑的藥物組合物；(7)用于篩選生成N端和C端雙重截短tau分子的分子的方法；(8)識別所述分子和/或與其相互作用的診斷性和治療性組合物；(9)基于所述雙重截短蛋白的抗原性的疫苗的開發(fā)；(10)涉及所述蛋白質及其表位和/或抗體或其它特異探針且用于阿耳茨海默氏病和與tau病理性變化有關的其它疾病的體外和體內(nèi)診斷的方法。
因此，本發(fā)明涉及專門在阿耳茨海默氏病中存在的N端和C端雙重截短形式的病理性tau蛋白及其表位的表征。
蛋白質降解是蛋白質生理性消除過程中發(fā)生的常見現(xiàn)象，包括生成各種大小的中間截短產(chǎn)物，通常具有較短半衰期。at蛋白也不例外，它在含野生型tau的健康大腦中經(jīng)歷這種過程。在下文中，術語“野生型at”包括在健康個體的大腦中發(fā)現(xiàn)的tau蛋白的所有六種天然存在的同種型形式。在細菌中生成在阿耳茨海默氏患病大腦中發(fā)現(xiàn)的各種較短截短形式at，純化至各種程度，用于探查at蛋白的生理學功能、用于繪制它們的結構域和磷酸化表位、或用于試圖理解具有模棱兩可結果的阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性疾病中配對螺旋裝配的機制的實驗(23-27、34、41、42)。普通術語“N端和C端雙重截短形式的tau蛋白”指阿耳茨海默氏病中的任何tau蛋白，分子的兩個末端都喪失了至少一個氨基酸。貫穿對來自阿耳茨海默氏患病大腦的提取物中雙重截短tau的分析，在本發(fā)明期間發(fā)現(xiàn)這些分子中的一些展示獨特的結構和功能特征，從而能夠將它們與在阿耳茨海默氏患病大腦組織中發(fā)現(xiàn)的其它tau片段鑒別開來。根據(jù)這一鑒別提供了新的設計，定義了與健康tau不同的N端和C端雙重截短tau分子的兩類主要病理性分子I型和II型tau分子。這兩類可以各自根據(jù)分子結構進一步細分成兩個亞類，分別稱為IA和B型、IIA和B型。
IA型和IIA型代表通過病理加工生成的衍生自微管相關蛋白tau的患病分子的不同結構和功能類型。N端和C端截短tau分子代表患病分子，衍生自微管相關蛋白tau、且在特定病理過程中出現(xiàn)，是阿耳茨海默氏病的特征。這是所有四類tau衍生蛋白的共同特征。所有類別的其它共同特征是N端和C端截短、它們的神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外定位、以及與正常健康tau的功能區(qū)別。
范例SEQ ID NO1-3描述了稱為“IA型”的那類分子。這些截短tau分子在擔當關鍵(中樞)活性單位和驅動病理性tau與微管蛋白相互作用方面與正常tau不同。IA型和IB型分子在微管裝配中不具有任何促進活性。令人驚訝的是，IA型能夠阻止正常tau促進微管裝配(實施例1)。不管相似一級序列特征和分子量，IB型在體外不顯示這種功能活性(實施例2)。這提示IA型與微管蛋白的強結合活性，從而提供對tau生理學的顯性失活效果。因此，IA型分子最有可能引起功能性微管網(wǎng)絡的持續(xù)慢性神經(jīng)元損耗，而且參與與阿耳茨海默氏病臨床嚴重性直接有關的神經(jīng)原纖維結構。出乎意料的是，盡管與IA型分子具有相似分子量和序列，IB型(如SEQ ID NO4-10)不展示IA類成員的病理學活性(見實施例2)。與這些類別相反，IIA型雙重截短tau衍生物結合微管并促進它們的病理性裝配(實施例3)。在下文中，由IIA型促進的微管稱為“病理性微管”。令人驚訝的是，具有相似序列和分子量范圍的分子(IIB型)缺乏這些高微管聚合能力。在微管裝配實驗中，它們發(fā)揮的水平與全長tau蛋白看到的相同(見實施例3)。
這兩類(IIA和B型)的N端和C端截短tau衍生物在細胞水平干擾軸突轉運，導致突觸喪失，最終導致阿耳茨海默氏病患者中的神經(jīng)元機能失調和認知損傷。同時，患病神經(jīng)元易受各種形式壓力的傷害，諸如氧化壓力(實施例4)。盡管與IIA型具有相似分子量，IIB型在進行分光光度法測量時額外促進微管裝配至使用全長健康tau(野生型tau)看到的水平。
在本發(fā)明IA和IB型和IIA和B型的另一個優(yōu)選實施方案中，可以通過下列步驟獲得所述分子的重組形式(a)構建攜帶所述雙重截短tau分子(I和II型)編碼序列的重組原核表達質粒；(b)在容許表達N端和C端雙重截短tau分子(I和II型)的條件下培養(yǎng)細菌；(c)通過離心收集細菌；(d)將來自500ml培養(yǎng)的細菌沉淀重懸于緩沖液A(20mM PIPESpH6.9、50mM NaCl、1mM EGTA、1mM MgSO4、2mM DTT、0.1mM PMSF)；(e)在冰上超聲處理1分鐘(3次)，于2℃以45000rpm離心15分鐘(轉子TLA-120，2，Beckmann Optima TLX)；(f)在Phosphocellulose、或MONO S HR 5/5或5ml HiTrap SPSepharose HP柱上在溶于緩沖液A的線性梯度0-1M NaCl中進行層析，通過SDS-PAGE和Western印跡分析鑒定得到的蛋白質。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IA型的N端和C端雙重截短成員包含下列氨基酸序列來自四重復tau(tau43)的衍生物將標以R4SEQ ID NO1(239-333，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile
his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala gluSEQ ID NO2(237-333，R4)asp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyrlys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu glyasn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glulys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu aspasn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr hislys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly alagluSEQ ID NO3(239-318，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IB型的N端和C端雙重截短成員包含下列氨基酸序列SEQ ID NO4(239-326，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys alaSEQ ID NO5(239-328，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu
asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thrSEQ ID NO6(239-331，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glySEQ ID NO7(239-334，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ileSEQ ID NO8(239-340，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ileval tyr lys ser pro valSEQ ID NO9(239-343，R4)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile
thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu ileval tyr lys ser pro val val ser gly來自三重復tau(tau44)的衍生物將標以R3SEQ ID NO10(208-302，R3)leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala glu可能存在tau蛋白的一個或多個表位，其特異存在于N端和C端雙重截短患病形式的tau蛋白的IA型或IIA型成員中。
在本發(fā)明的這個實施方案中，所述表位特異位于IA型(SEQ ID NO1-3)和IIA型(SEQ ID NO11-18)成員的一級結構中，而且它們的數(shù)目、異質性和特異性取決于各個類別每個成員的特定結構構象并由其添加。因此，每個分子的奇異點不僅依賴其一級結構以及它對微管裝配的作用，而且還依賴其構成其表位的二級和三級結構。它們中的一些能夠形成特別重要的“構象區(qū)”，它們對所述分子的活性貢獻巨大。
術語“構象區(qū)”在用于本文時指對它的活性有所貢獻的分子一個區(qū)域的成簇的表位。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，包含在I型和II型分子中的、包含對應于第239-267位殘基(SEQ ID NO1-9和11-14、19 R4)的氨基酸“Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val TyrLys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu”且包含對應于第217-236位殘基(SEQ ID NO10、15-18、20 R3)的氨基酸“Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys ValThr Ser Lys Cys Gly Ser Leu”的構象區(qū)稱為序列“A”。
在本發(fā)明的還有一個優(yōu)選實施方案中，鑒定了所述構象區(qū)中的所述表位，并通過缺失誘變測定了它們的相對貢獻。通過顯示所有這些表位以各種程度對IA型分子的活性有所貢獻的突變形式證明了它們的重要性以及它們與對微管的功能的關系(實施例5)。這些各個表位包含下列氨基酸序列Aile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-267位殘基)。表位缺失突變體具有SEQ ID NO21(268-333，R4；del 239-267)gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leuasp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala gluA1ile lys his val pro gly gly gly ser(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-247位殘基)。缺失突變體具有SEQ ID NO22(248-333，R4；del 239-247)val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lyscys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly gln valglu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lysile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lyslys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lysthr asp his gly ala gluA2ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-257位殘基)。缺失突變體具有SEQ ID NO23(258-333，R4；del 239-257)
ser lys val thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lyspro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lysasp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his valpro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe argglu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala gluA3ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lyspro val asp leu ser lys val thr ser(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第239-262位殘基)。缺失突變體具有SEQ ID NO24(263-333，R4；del 239-262)lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly glnval glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val gln serlys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly gly asnlys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lys alalys thr asp his gly ala gluA4ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thrser(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第246-262位殘基)。表位缺失突變體具有SEQ ID NO25(239-333，R4；del 248-262)ile lys his val pro gly gly gly lys cys gly ser leu gly asn ilehis his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glu lys leuasp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu asp asn ilethr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr his lys leuthr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly ala gluA5asp leu ser lys val thr ser(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第256-262位殘基和SEQ ID NO10、15-18、20中的第225-231位殘基，R3)。表位缺失突變體具有SEQ ID NO26(239-333，R4；del 256-262)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly gly
gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val glnser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly glyasn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lysala lys thr asp his gly ala gluA6Lys Cys Gly Ser Leu(對應于SEQ ID NO1-9和11-14、19中的第263-267位殘基和SEQ ID NO10、15-18、20中的第232-236位殘基，R3)。表位缺失突變體具有SEQ ID NO27(239-333，R4；del 263-267)ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyr lys proval asp leu ser lys val thr ser gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala glu同樣可以理解的是，并非肽中的所有氨基酸都必須對特定抗體實際識別的特定位點有所貢獻。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IA型患病tau蛋白具有下列特性a)所述蛋白質是N端和C端截短的(實施例6)；b)所述蛋白質存在于阿耳茨海默氏患病組織中，而正常健康大腦中缺乏(實施例6)；c)在體外微管裝配實驗中它們阻止正常tau蛋白促進微管裝配(實施例7)；d)在使用正常tau的微管裝配實驗中，它們的抑制活性可以通過特異性抑制性中和單克隆抗體來消除(實施例11)；e)它們的病理學活性依賴正常健康tau中不存在的氨基酸序列與結構構象的組合(實施例6)；f)所述蛋白質在構象上與正常tau蛋白不同(實施例6)。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及IA型的N端和C端截短患病tau形式SEQ ID NO1-3及其“構象區(qū)”(序列“A”)和表位A1-A6。
IB型tau蛋白在下列特性方面有所不同a)IB型蛋白是N端和C端截短的(實施例6)；b)所述蛋白質可能存在于正常健康人大腦中；c)在體外微管裝配實驗中，它們不阻止正常tau蛋白促進微管裝配(實施例2和7)；d)它們不顯示修飾微管裝配的病理學活性(實施例2和7)；e)IB型分子在構象上與正常tau不同(實施例6)。
本發(fā)明的另一個實施方案是所述方法(包括多種提取方法，它們中的許多本身是本領域知道的)與關于雙重截短形式tau的功能測定法的組合，從而鑒定影響tau和微管功能的其它分子。由大腦提取物獲得的tau蛋白可能隨著具體大腦組織樣品的階段而在所提取的N端和C端雙重截短tau分子的功能性中有所變化(實施例6)。本領域熟練技術人員知道如何將本發(fā)明的方法用于多種不同目的，這都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明尤其涉及SEQ ID NO1作為IA型分子成員的原型。
本發(fā)明的還有一個目標是提供用于將正常tau蛋白體外轉變成阿耳茨海默氏蛋白的方法，其中將微管蛋白與本發(fā)明的IA型分子一起在容許所述微管蛋白與所述IA型分子相互作用的條件下溫育。
術語“容許IA型分子或其肽衍生物與微管蛋白相互作用”指容許IA型分子的活性、優(yōu)選最佳活性的條件。該活性導致與微管蛋白的結合并抑制其在微管裝配中的生理性功能。
在另一個實施方案中，IA型分子可以通過其衍生物而得到抑制或中和。正如本發(fā)明關于篩選抑制性分子時所述，可以對IA型肽及其衍生物諸如含有缺失或突變的肽測試或篩選它們對微管聚合的作用。
正常tau蛋白可以衍生自天然或重組來源。然而，為了完成本發(fā)明的方法，使用重組材料較為有利。
上文所述方法專門提供了足夠數(shù)量的IA型N端和C端雙重截短tau蛋白用于多種目的可以建立新型抑制劑的體外篩選系統(tǒng)，其預防由病理性雙重截短tau IA型引起的對微管裝配的抑制。
因此，可用于本發(fā)明組合物的抑制劑是能夠調控IA型分子與微管蛋白的病理性相互作用的任何抑制劑。這種抑制性分子的作用模式由與IA型或正常tau的相互作用組成。
這些“抑制劑”可能對IA型分子所包括的表位是特異的，通過例如阻斷表位，或者可能針對IA型分子上的多個結構域，只要它們阻止或擾亂其病理性或生理性活性?？梢酝ㄟ^測量正常tau的殘余微管裝配促進活性而定量抑制效果。作為抑制劑的來源，可以使用確定化學結構和組成的小分子庫、肽庫、抗體庫，或是游離于溶液中，或是展示在噬菌體或細菌或核糖體(核糖體展示)的合成表面的表面上，還有本領域知道的相似技術。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于測試有效分解IA型復合物的分子和化合物的方法(I型體外測定法)，包括下列步驟a)容許IA型分子或由其衍生的肽與微管蛋白或與IA型分子相互作用的其它分子之間形成蛋白質復合物；b)將蛋白質復合物與待測藥物一起保溫；c)檢驗步驟(b)保溫在恢復健康tau同種型的微管裝配促進活性方面的結果。
本發(fā)明的還有一個目標是提供用于測試有效預防或降低對健康tau同種型的正常體外活性的抑制的藥物的方法，其包括a)預計待測給定藥物聯(lián)合IA型分子或由其衍生的肽不會干擾正常tau及其體外功能；b)將IA型分子與待測藥物一起在存在正常tau和微管蛋白下保溫；c)檢驗步驟(a)和(b)保溫在存在或缺乏IA型分子對微管聚合的抑制活性方面的結果(實施例8)。
術語在缺乏所述藥物時“容許IA型分子或由其衍生的肽與微管蛋白之間形成復合物”指容許IA型分子與所述微管蛋白相互作用而導致對微管形成的抑制的條件。
本領域熟練技術人員知道如何將本發(fā)明的方法用于多種不同目的，這都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于測試有效抑制IA型分子在表達tau或tau衍生蛋白的細胞系統(tǒng)中起動復合物形成的藥物的方法(I型細胞測定法)，包括下列步驟a)將編碼IA型分子的功能基因導入表達正常tau蛋白的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；b)容許IA型分子與微管蛋白分子之間形成蛋白質復合物；c)將待測物質施加到包含所述復合物的細胞上；d)檢驗所述藥物對IA型生物學活性諸如微管結構和功能修飾的作用。
用于步驟(a)的術語“表達tau蛋白的細胞”指有能力由編碼IA型分子或其衍生物的基因構建體表達N端和C端雙重截短tau形式的細胞。本領域熟練技術人員知道導入編碼IA型分子的基因的實驗步驟的順序與本發(fā)明方法的目的無關的事實。
所述方法是特別有利的，因為該篩選系統(tǒng)基于連續(xù)生長細胞系，這提供了體內(nèi)狀況的相近的情形。此外，胞內(nèi)定位的IA型分子的充足供應容許篩選有效抑制IA型分子的生物學效果的藥物。
在一個優(yōu)選實施方案中，表達IA型分子的所述細胞是成神經(jīng)細胞瘤、或嗜鉻細胞瘤細胞或衍生自表達IA型分子的轉基因動物的神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)物。
稱為“II型”的那類分子由N端和C端雙重截短tau蛋白分子(如SEQID NO11-20所述序列)組成。這一類的代表位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外，而且在功能上與正常健康tau不同。
本發(fā)明的這一類蛋白質的發(fā)現(xiàn)和分離提供了(1)導致特定微管結合和微管裝配異常促進(實施例3)且對其載體造成病理性后果(實施例4)的tau修飾的分子描述和表征；(2)對蛋白質表位特異的抗體和(3)中和所述II型分子的病理學活性的抗體(實施例12)；(4)用于篩選和測試有效抑制、中和和消除所述II型蛋白質的治療性候選藥物的方法或(5)用于篩選和測試有效抑制tau衍生蛋白諸如II型分子形成的治療性候選藥物的方法；(6)可用于藥物篩選的攜帶編碼各種N端和C端雙重截短tau蛋白的基因構建體作為轉基因或轉基因組合的動物模型的開發(fā)；(7)包含針對所述雙重截短tau蛋白的抑制劑及其蛋白酶的藥物組合物；(8)識別所述分子和/或與其相互作用的診斷性和治療性組合物；(9)基于所述雙重截短蛋白的疫苗的開發(fā)；和(10)涉及所述蛋白質及其表位和/或抗體或其它特異性探針且用于阿耳茨海默氏病和與tau病理性變化有關的其它疾病的體外和體內(nèi)診斷的方法。
與IA和B型類別相反，IIA型分子在進行分光光度法測量時促進病理性微管裝配的水平顯著高于由正常健康tau同種型促進的微管裝配(分別見實施例1和3)。令人驚訝的是，具有相似序列和分子量范圍的N端和C端雙重截短tau分子的一個亞類(IIB型)缺乏這些“高”微管聚合能力。在微管裝配實驗中，這一亞類的分子發(fā)揮的水平與全長tau蛋白看到的相同(實施例3)。
因此，本發(fā)明涉及在阿耳茨海默氏病中發(fā)現(xiàn)的一類新的經(jīng)修飾tau蛋白，稱為IIA型tau蛋白。這一類由N端和C端雙重截短tau分子組成(SEQ ID NO11-18)。
術語II型分子指在結構和功能上不僅與正常健康tau而且與IA和IB型tau類別顯著不同的那類的成員。這一亞類的分子結合微管并促進它們的病理性裝配，比健康tau同種型的正常微管裝配顯著更高(實施例3)。IIA型N端和C端雙重截短tau分子在細胞水平干擾軸突成分的轉運，導致突觸喪失和神經(jīng)元功能障礙，最終導致阿耳茨海默氏病神經(jīng)元中和實驗條件下的整個生物體的認知損傷(分別見實施例15和16)。同時，患病神經(jīng)元易受各種形式壓力的傷害，諸如例如氧化壓力(實施例4)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IIA型的N端和C端雙重截短成員包含下列氨基酸序列
來自四重復tau(tau43)的衍生物標以R4SEQ ID NO11(69-333，R4)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asnval gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro glygly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys valthr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly glygly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg valgln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly glygly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn alalys ala lys thr asp his gly ala gluSEQ ID NO12(93-333，R4)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr alapro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ileasn lys lys leu asp leu ser asn val gln ser lys cys gly ser lysasp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyrlys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leu glyasn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glulys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu aspasn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr hislys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly alagluSEQ ID NO13(69-363，R4)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys
thr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asnval gln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro glygly gly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys valthr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly glygly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg valgln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly glygly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn alalys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro valval ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thrgly ser ile asp met val aspSEQ ID NO14(93-363，R4)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg set gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys set pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr alapro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile ileasn lys lys leu asp leu ser asn val gln set lys cys gly ser lysasp asn ile lys his val pro gly gly gly ser val gln ile val tyrlys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly set leu glyasn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys ser glulys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu aspasn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thr hislys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his gly alaglu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser pro arghis leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val asp來自三重復tau(tau44)的衍生物將標以R3SEQ ID NO15(93-302，R3)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys set gly asp arg ser gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr ala
pro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile valtyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leugly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leuasp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala gluSEQ ID NO16(69-302，R3)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lysval thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala gluSEQ ID NO17(93-332，R3)ile ala thr pro arg gly ala ala pro pro gly gln lys gly gln alaasn ala thr arg ile pro ala lys thr pro pro ala pro lys thr propro ser ser gly glu pro pro lys ser gly asp arg ser gly tyr serser pro gly ser pro gly thr pro gly ser arg ser arg thr pro serleu pro thr pro pro thr arg glu pro lys lys val ala val val argthr pro pro lys ser pro ser ser ala lys ser arg leu gln thr alapro val pro met pro asp leu lys asn val lys ser lys ile gly serthr glu asn leu lys his gln pro gly gly gly lys val gln ile valtyr lys pro val asp leu ser lys val thr ser lys cys gly ser leugly asn ile his his lys pro gly gly gly gln val glu val lys serglu lys leu asp phe lys asp arg val gln ser lys ile gly ser leu
asp asn ile thr his val pro gly gly gly asn lys lys ile glu thrhis lys leu thr phe arg glu asn ala lys ala lys thr asp his glyala glu ile val tyr lys ser pro val val ser gly asp thr ser proarg his leu ser asn val ser ser thr gly ser ile asp met val aspSEQ ID NO18(69-332，R3)met val ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys alalys gly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lysval thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser proval val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser serthr gly ser ile asp met val asp在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IIB型的N端和C端雙重截短成員包含下列氨基酸序列SEQ ID NO19(6-378，R4)gln glu phe glu val met glu asp his ala gly thr tyr gly leu glyasp arg lys asp gln gly gly tyr thr met his gln asp gln glu glyasp thr asp ala gly leu lys ala glu glu ala gly ile gly asp thrpro ser leu glu asp glu ala ala gly his val thr gln ala arg metval ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lysgly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala ala propro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lys thrpro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lys sergly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr pro glyser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glu prolys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser ser ala
lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lys asnval lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln pro glygly gly lys val gln ile ile asn lys lys leu asp leu ser asn valgln ser lys cys gly ser lys asp asn ile lys his val pro gly glygly ser val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lys val thrser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro gly gly glygln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp arg val glnser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro gly gly glyasn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asn ala lysala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser pro val valser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser ser thr glyser ile asp met val asp ser pro gln leu ala thr leu ala asp gluval ser ala ser leuSEQ ID NO20(6-347，R3)gln glu phe glu val met glu asp his ala gly thr tyr gly leu glyasp arg lys asp gln gly gly tyr thr met his gln asp gln glu glyasp thr asp ala gly leu lys ala glu glu ala gly ile gly asp thrpro ser leu glu asp glu ala ala gly his val thr gln ala arg metval ser lys ser lys asp gly thr gly ser asp asp lys lys ala lysgly ala asp gly lys thr lys ile ala thr pro arg gly ala alapro pro gly gln lys gly gln ala asn ala thr arg ile pro ala lysthr pro pro ala pro lys thr pro pro ser ser gly glu pro pro lysser gly asp arg ser gly tyr ser ser pro gly ser pro gly thr progly ser arg ser arg thr pro ser leu pro thr pro pro thr arg glupro lys lys val ala val val arg thr pro pro lys ser pro ser serala lys ser arg leu gln thr ala pro val pro met pro asp leu lysasn val lys ser lys ile gly ser thr glu asn leu lys his gln progly gly gly lys val gln ile val tyr lys pro val asp leu ser lysval thr ser lys cys gly ser leu gly asn ile his his lys pro glygly gly gln val glu val lys ser glu lys leu asp phe lys asp argval gln ser lys ile gly ser leu asp asn ile thr his val pro glygly gly asn lys lys ile glu thr his lys leu thr phe arg glu asnala lys ala lys thr asp his gly ala glu ile val tyr lys ser proval val ser gly asp thr ser pro arg his leu ser asn val ser serthr gly ser ile asp met val asp ser pro gln leu ala thr leu alaasp glu val ser ala ser leu
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述IIA型患病tau蛋白具有下列特性a)所述蛋白質是N端和C端截短的(實施例6)；b)是微管裝配的有效病理性促進劑(實施例3；圖28C)；c)它們的病理性微管裝配促進活性可以通過特定化合物來消除，例如抑制性單克隆抗體或其衍生物(實施例12)；d)所述蛋白質不存在于正常健康大腦中(實施例6)；e)顯著損傷胞內(nèi)轉運功能(實施例16)；f)它們的病理學活性依賴結合微管網(wǎng)絡的高親和力及其功能損傷(實施例3)；g)它們在構象上與正常tau不同(實施例6)。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，IIB型分子具有下列特性a)所述蛋白是N端和C端截短的；b)在促進微管裝配中不如IIA型有效；c)所述蛋白質不存在于正常健康大腦中；d)有可能通過結合微管而損傷其功能，然而程度低于IIA型時觀察到的；e)它們在構象上與正常tau不同。
在本發(fā)明的還有一個優(yōu)選實施方案中，以與關于I型分子所述相似的方式鑒定了IIA和B型分子的表位。通過顯示所有這些表位以各種程度對N端和C端雙重截短tau分子活性有所貢獻的突變形式諸如在IA型的范例中所示證明了它們對II型分子的重要性以及它們與對微管的功能的關系。
因此，可用于本發(fā)明組合物的抑制劑是能夠調控IIA型分子與微管導致“病理性微管”的病理性相互作用的任何抑制劑。此處所用術語“病理性微管”指經(jīng)過II型分子修飾的微管。這種抑制性分子的作用模式由與微管、微管相關分子包括tau及其病理性衍生物的相互作用組成。作為抑制劑的來源，可以使用確定化學結構和組成的小分子庫、肽庫、抗體庫，或是游離于溶液中，或是展示在合成表面上或噬菌體或細菌或核糖體(核糖體展示)上，還有本領域知道的相似技術。
在一個優(yōu)選實施方案中，這些“抑制劑”可能對IIA型分子所包括的表位是特異的，通過例如阻斷表位，或者可能針對IIA型分子上的多個結構域，只要它們在體外或在體內(nèi)阻止或擾亂其病理或生物活性?？梢酝ㄟ^例如測量正常tau的殘余微管裝配促進活性或者通過測量胞內(nèi)微管參數(shù)諸如生長物(outgrowth)、穩(wěn)定性或胞內(nèi)轉運而在定量該抑制效果。
在另一個實施方案中，IIA型分子可以通過其衍生物而得到抑制或中和，例如在各自細胞中表達的顯性失活蛋白質(dominant negativeprotein)。正如本發(fā)明關于篩選抑制性分子時所述，可以對IIA型肽及其衍生物諸如含有缺失或突變的肽測試或篩選它們對抑制N端和C端雙重截短tau分子的病理學效果的作用。
通過抑制對微管結構和功能的損傷來實現(xiàn)治療性效果。
因此，本發(fā)明的另一個目標是提供包含本發(fā)明IIA型tau分子的特異抑制劑的藥物組合物，任選聯(lián)合制藥學可接受載體和/或稀釋劑。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明尤其涉及SEQ ID NO11作為IIA型分子成員的原型。
本發(fā)明的還有目標是提供用于將正常微管體外轉變成病理性狀態(tài)的方法，其中將正常tau蛋白與本發(fā)明的IIA或B型一起在容許所述IIA或B型與微管生成病理性微管相互作用的條件下保溫。
本發(fā)明還涉及容許對任何分子文庫篩選能夠中和IIA型分子病理性效果的化合物的篩選測定法。在本發(fā)明中，對測試分子篩選它們消除和/或中和IIA型分子和恢復由II型分子引起的生理性微管參數(shù)和功能的特性。所述藥物篩選測定法由下列步驟組成(1)在存在IIA型分子和微管蛋白時在合適條件下形成病理性微管(分別見實施例3和4)；(2)將這些病理性微管與待測候選藥物一起保溫；(3)檢驗在中和IIA型分子對微管的作用方面的結果(分別見實施例9和12)。
可以建立抑制劑的體外篩選系統(tǒng)，它減輕由病理性N端和C端雙重截短tau IIA型引起的對微管的作用。這些“抑制劑”可能對IIA型分子所包含的表位是特異的，通過例如阻斷表位，或者可能針對IIA型分子上的多個結構域，只要它們阻止或擾亂其活性?？梢酝ㄟ^測量微管裝配動力學而對抑制效果定量。作為抑制劑的來源，可以使用確定化學結構和組成的小分子文庫、肽庫、抗體庫，或是游離于溶液中，或是展示在噬菌體或細菌或核糖體(核糖體展示)的合成表面的表面上，還有本領域知道的相似技術。
對于本發(fā)明的目標而言，待測藥物有效減少IIA型分子的數(shù)量和/或其活性從而實現(xiàn)輔助治療效果是足夠的，盡管優(yōu)選完全消除IIA型活性。
本領域熟練技術人員知道如何將本發(fā)明的方法用于多種不同目的，這都屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于在活細胞即表達II型分子的神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細胞中確認藥物的方法(II型細胞測定法)?；蛘撸梢允褂醚苌赞D基因動物的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物或衍生自表達IIA型分子的多種來源的其它原代神經(jīng)元細胞。
上文所用術語“表達II型分子的神經(jīng)元”指穩(wěn)定表達分子的細胞或有能力表達IIA型分子的細胞和通過細胞培養(yǎng)技術或通過下文例示的轉基因技術導入了功能性IIA型基因的細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，表達IIA型分子的所述細胞是成神經(jīng)細胞瘤或嗜鉻細胞瘤細胞或衍生自表達IIA型分子的轉基因動物的神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)物。
本領域熟練技術人員知道導入編碼IIA型分子的基因的順序與本發(fā)明方法的目的無關的事實。
本發(fā)明涉及用于測試在表達IIA型分子的細胞系統(tǒng)中在促進異常微管形成和功能方面有效抑制IIA型的藥物的方法，包括下列步驟a)將編碼II型分子的功能基因導入表達正常tau蛋白的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；
b)容許IIA型tau與微管(病理性微管)之間形成復合物；c)將待測藥物施加到包含得到的復合物的細胞上；并d)檢驗所述藥物對IIA型生物學活性的效果，諸如微管網(wǎng)絡及其相關功能的修飾。
本發(fā)明的還有一個最優(yōu)選實施方案是表達IIA型分子的神經(jīng)元的表型。在合適條件下表達這些分子的神經(jīng)元引起胞內(nèi)轉運過程的擾亂。另外，表達IIA型分子的神經(jīng)元在合適壓力條件下經(jīng)歷細胞死亡(實施例4)。
所述方法是特別有利的，因為所涉及系統(tǒng)基于連續(xù)生長細胞系的使用，提供了體內(nèi)狀況的相近的情形，還提供了胞內(nèi)定位的IIA型分子的充足供應，它的生成容許對藥物篩選有效減輕胞內(nèi)IIA型作用的藥物。
在一個優(yōu)選實施方案中，使該細胞測定法的讀出(readout)適應低通量或高通量定量系統(tǒng)。術語“合適條件”在聯(lián)合導致微管轉運破壞或損傷和/或神經(jīng)元死亡的所述表型時指容許實施例中所示所述表型出現(xiàn)的任何條件。
為了本發(fā)明的目標，通過該系統(tǒng)篩選的或在系統(tǒng)中確認的潛在藥物或第三種來源的藥物有效降低表型的水平從而在治療中實現(xiàn)功能是足夠的，盡管優(yōu)選通過藥物完全清除或減少患病表型。
除了穩(wěn)定培養(yǎng)細胞系或原代細胞，各個方面還可以延伸至使用衍生自在其神經(jīng)元中表達IIA或B型分子的完整動物的細胞的類似讀出系統(tǒng)(下文將例示轉基因動物模型)。
本領域技術人員知道如何將本發(fā)明的方法用于多種不同目的，這都屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
在一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定表達N端和C端雙重截短IIA型tau形式的所述細胞和轉基因動物容許繪制疾病途徑，產(chǎn)生珍貴信息而導致與阿耳茨海默氏病發(fā)病機理有關的新分子及其診斷和治療。這些篩選和鑒定方法包括基于mRNA表達的篩選技術以及基于蛋白質的技術。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述I型和IIA和B型分子或其衍生物還提供了重組DNA構建體，可以將其導入非人動物基因組而提供攜帶并表達上文所述病理性N端和C端雙重截短形式IA型、IIA和B型的轉基因動物模型。依照本發(fā)明的轉基因動物包括直接導入了構建體的動物以及這些動物的保留了表達構建體的能力的后代。轉基因序列指與普遍表達或組織特異性啟動子功能性相連的多核苷酸序列。編碼IA型和IIA和B型分子的轉基因DNA優(yōu)選由動物或人來源衍生的cDNA和/或基因組DNA。表達所述I型和IIA和B型分子的轉基因動物預計在細胞和/或器官水平發(fā)展在表型上與阿耳茨海默氏病有關的功能變化。這些包括組織學變化、RNA表達變化、細胞生理學參數(shù)變化，而且優(yōu)選AD特征性的行為變化。在轉基因動物的成熟神經(jīng)元中，先前沒有測試I型和IIA和B型分子的表達。預計I型、IIA和B型轉基因在轉基因動物中的表達水平(即轉基因mRNA水平)是在轉基因動物中獲得一致病理生理學效果的重要參數(shù)。通過攜帶轉基因的動物的繁殖和雜交，可以增強、削弱、或調節(jié)病理學特征，諸如通過例如將轉基因導入目前擔當疾病模型的動物系、表達其它轉基因的動物、或缺乏基因的功能性表達的動物(見實施例14)。
更具體的說，本發(fā)明提供了轉基因非人動物細胞，其中編碼人I型和IIA和B型分子的DNA在合適的普遍或組織特異性啟動子的轉錄控制下表達，包括其可調控修飾。
依照本發(fā)明操作的細胞可以通過任何已知轉染技術來制備?？梢酝ㄟ^直接的遺傳操作來導入DNA序列，或者導入較早世代的細胞。由此，可以由轉基因動物獲得細胞并在體外培養(yǎng)。同樣，可以依照完全建立的方法來生成轉基因動物，諸如胚胎操作，例如通過胚胎干細胞的基因轉移、早期胚胎的逆轉錄病毒感染、或前核顯微注射。優(yōu)選前核顯微注射技術。將由本發(fā)明重組DNA構建體獲得的轉錄單位注射到動物胚胎的前核中，并繁殖獲得的轉基因生成者(founder)?？梢允褂帽绢I域眾所周知的多種技術來分析在后代中獲得的結果?；诒景l(fā)明細胞和動物的模型可用于例如鑒定和評估潛在治療劑在神經(jīng)變性疾病中的功效，其中可以分析tau和N端和C端雙重截短tau衍生分子還有與阿耳茨海默氏病有關的其它分子諸如APP及其衍生物。具體而言，這些模型可用于有可能預防本文所述N端和C端雙重截短tau衍生分子的病理性作用的檢測劑的篩選或鑒定測定法。
因此，本發(fā)明的另一個方面包括用于測試特定狀況的潛在治療劑的方法，特別是神經(jīng)變性疾病，優(yōu)選AD，其中將由表達所述雙重截短形式tau的轉基因動物衍生的細胞用作靶細胞。更具體的說，它包括這樣一種方法，其中將治療劑諸如例如抗體或其衍生物施用于本發(fā)明的轉基因動物，或者通過雜交或遺傳操作導入所述動物，并通過上文所示測定系統(tǒng)進一步測試。此外，本發(fā)明包括由這種方法組成或包括這種方法的篩選和鑒定測定法，以及包含本發(fā)明細胞的篩選測定試劑盒。本發(fā)明給出了使用表達本發(fā)明I型和IIA和B型分子的細胞系篩選潛在治療劑的方法(見實施例15)?？梢砸灶愃品绞绞褂帽景l(fā)明的細胞和動物。
本發(fā)明的另一個目標是提供包含針對N端和C端雙重截短形式tau蛋白的特異抑制劑的制藥學組合物，任選聯(lián)合制藥學可接受載體和/或稀釋劑。
術語“針對N端和C端雙重截短tau的特異抑制劑”指特異抑制所述雙重截短tau蛋白的作用的物質。抑制劑的本質可以是在本發(fā)明的測試系統(tǒng)中展示期望抑制活性的抗體及其經(jīng)過改造、衍生的分子，任何肽或確定化學組合物。
本發(fā)明的另一個目標是特異識別本發(fā)明表位且能夠部分或完全抑制N端和C端雙重截短tau分子病理學活性的抗體或其衍生物。
術語“包含本發(fā)明表位的寡肽或多肽”指在其二維或三維結構中重構本發(fā)明表位的肽，得到針對該表位的抗體的特異識別。此外，所述寡肽或多肽可以僅僅由展示所述表位的氨基酸組成，或者它們可以包含額外氨基酸。所述寡肽或多肽的構建在本領域是眾所周知的。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及單克隆抗體及其衍生物，或是天然的或是重組的、固定化的、游離于溶液中或展示在各種分子或細菌、病毒、或其它表面的表面上?？贵w及其衍生物能夠部分或完全抑制N端和C端雙重截短tau分子的生物學活性。使用針對由阿耳茨海默氏患病大腦組織分離的所述雙重截短tau分子生成的單克隆抗體DC44顯示了這種特異抗體活性(分別見實施例10和11)。
所述抗體還有許多其它變體(DC82、DC136等)，而且可以是血清衍生抗體或單克隆抗體或其任何衍生物。針對期望表位的單克隆和多克隆兩種抗體的生成在本領域是眾所周知的(43)。另外，所述抗體可以是天然的，或者是通過遺傳過程衍生的抗體，諸如通過本領域完全理解的技術衍生的嵌合抗體。此外，所述抗體還指保留其結合特定表位的能力的抗體片段，諸如Fab片段或單鏈Fv minibody、或胞內(nèi)表達的稱為intrabody的單鏈抗體。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療阿耳茨海默氏病的藥物組合物。
同樣，可以對有所需要的患者以處理該病例的醫(yī)師認為合適的路徑和劑量施用所述藥物組合物。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述制藥學組合物包含結合上文所列表位的任何部分或基團而導致其改變和/或部分或完全中和的至少一種單克隆抗體或小分子或其衍生物作為特異抑制劑(分別見實施例10、11、和12)。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于檢測和/或監(jiān)測阿耳茨海默氏病的診斷性組合物，包括a)本發(fā)明的表位；b)本發(fā)明的抗體或其衍生分子。
本發(fā)明的診斷性組合物可以包含例如特異識別IA型或IIA型分子類別成員之一或其表位或者待測樣品中IA型或IIA型分子的增強水平的本發(fā)明抗體。在另一個實施方案中，所述診斷性組合物可以包含針對本發(fā)明表位之一的本發(fā)明抗體。由此，可以通過用識別本發(fā)明表位的抗體處理所述樣品來檢測阿耳茨海默氏病狀況相關樣品?？梢允褂冕槍Ρ景l(fā)明抗體且已被本領域已知方法標記的二抗來顯現(xiàn)抗體-表位(半抗原)復合物(43)。
在本發(fā)明的還有一個實施方案中，所述診斷性組合物可以由本發(fā)明表位和本發(fā)明抗體組成。用所述抗體處理樣品，如果所述抗體與所述樣品的結合與所述抗體與用作參照樣品的本發(fā)明所述表位的結合有關，則可以得出有關相應患者的疾病狀況方面的結論。
在還有一個實施方案中，診斷性組合物可以包含IA型或IIA型分子和本發(fā)明的抗體。可以在樣品的正常tau中和能力方面監(jiān)測這兩類分子的活性，與本發(fā)明的重組IA型分子(如SEQ ID NO1)和IIA型分子(SEQID NO11-18)進行比較。由定量的異常I型分子活性，可以推導所述樣品中所含分子的水平，由此得出患者的狀況?？梢酝ㄟ^例如測量未與I型分子反應的正常tau的殘余活性來推導IA型活性?？梢酝ㄟ^在微管裝配實驗中測量II型分子的更多活性來推導II型活性。
本領域熟練技術人員能夠聯(lián)合任何上述本發(fā)明目標設計其它測試系統(tǒng)。可以理解，所有能夠想到的組合都屬于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于在體外診斷和/或監(jiān)測阿耳茨海默氏病的方法，包括測定患者的腦脊髓液分離物、關于N端和C端雙重截短tau分子IA型和IIA型分子或其表位的存在及其正常tau抑制活性的水平進行神經(jīng)組織活檢。
“患者的腦脊髓液分離物”通過標準醫(yī)學流程獲得。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及分別與IA型或IIA型所述氨基酸序列相同或同源的I型和II型分子，以及由其衍生的能夠在動物中誘導免疫應答的分子和免疫原性片段。依照本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)I型和II型這兩類分子都可作為免疫原用于生成抑制性抗體，以及作為疫苗的主要部分用于針對疾病的免疫。
通過腸胃外施用，上文所列所有序列和表位以及由患病大腦組織分離的I型和II型都具有免疫原性且導致特異性針對所述I型和II型蛋白質及其衍生物的抗體的生成(分別見實施例10和13)。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，I型和II型分子或其衍生物能夠誘導針對所述分子一級、二級和/或三級結構的免疫應答。在宿主中，由此發(fā)生的免疫應答因而能夠鑒別健康和患病形式的tau及其衍生物。本發(fā)明的這一特征可以用于疫苗，因為該N端和C端雙重截短tau形式在誘導疾病特異性免疫應答中的獨特品質。
可以理解，對于本文所包含的病理性N端和C端雙重截短tau多肽，在阿耳茨海默氏病的個別病例中存在天然變異。這些變異可能存在于整個序列中的氨基酸差異或是所述序列中氨基酸的缺失、替換、插入、倒置或添加。本發(fā)明例示性實施方案中的這些氨基酸替換屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。由此，認為不必影響多肽免疫原性的天然變異是依照本發(fā)明的所述雙重截短形式的tau多肽的免疫原性等同變體。
然而，在將IA和IIA型N端和C端雙重截短tau多肽用于例如接種目的或用于生成抗體時，不必使用本發(fā)明中描述的完整多肽。也有可能使用這些多肽的能夠誘導針對整個多肽的免疫應答的片段，即所謂的免疫原性片段。
因此，本發(fā)明的這個實施方案不僅涉及依照本發(fā)明的多肽，而且還涉及那些多肽的仍然能夠誘導針對多肽的免疫應答的衍生片段(即所謂的免疫原性片段)。
為了例示目的，給出了重組IA和IIA型肽或衍生自患病人阿耳茨海默氏大腦的IA和IIA型N端和C端雙重截短患病tau級分在動物中的免疫原性(實施例3)。
通過下列實施例和附圖進一步描述本發(fā)明，而非加以限制。


圖1使用N端和C端雙重截短tau IA型和IB型分子的微管裝配。
圖2N端和C端雙重截短tau IA型和IB型分子對微管裝配的抑制。
圖3N端和C端雙重截短tau IIA和IIB型分子在微管裝配中的活性。
圖4神經(jīng)元細胞中表達的IIA型N端和C端雙重截短tau顯著增加它們對氧化壓力的敏感性。
圖5單克隆抗體對患病tau IA型蛋白質及其缺失突變體的親和力。單克隆抗體對患病tau IA型蛋白質及其缺失突變體的表觀親和力。第一列列出了“原型”tau IA型蛋白質(SEQ ID NO1)和各種缺失突變體。中間一列是本發(fā)明所指表位。最后一列所述表觀親和力是通過競爭性ELISA測量的，而且顯示為50％競爭原型tau IA型蛋白質所需要的相應抗原濃度。
圖6來自AD大腦的tau蛋白在Superdex 200柱上的分級。
圖7來自AD大腦的三次分開分離的級分#19中的IA型抑制活性。
圖8N端和C端雙重截短tau I型分子在AD大腦中的證明。
圖9tau I型在AD大腦而非健康大腦中的存在。
圖10N端和C端雙重截短tau II型分子的免疫反應性。
圖11重組tau I-II型的構建(SEQ ID NO1-24)。
圖12AD大腦衍生和重組tau IA型對正常健康tau的抑制作用。
圖13對中和tau IA型分子的候選藥物的第一輪篩選(第一步)。
圖14對具有針對正常tau的選擇性的中和IA型分子的候選藥物的第二輪篩選(第二步)。
圖15對中和tau IIA型的候選藥物的第一輪篩選。
圖16對能夠中和tau IIA型分子并將它們與正常tau鑒別開來的候選藥物的第二輪篩選(第二步)。
圖17通過ELISA測定的prefused小鼠血清中的特異性抗體水平。
圖18單克隆抗體與AD大腦衍生tau(級分#19)和對照健康大腦衍生tau的ELISA反應性(DC20具有無關特異性的單克隆抗體。所示數(shù)據(jù)代表三次平行實驗的平均值)。
圖19單克隆抗體與重組tau分子的ELISA反應性(DC20具有無關特異性的單克隆抗體。所示數(shù)據(jù)代表三次平行實驗的平均值)。
圖20對針對AD大腦衍生tau IA型(級分#19)的中和抗體的篩選。
圖21對針對重組tau IA型(SEQ ID NO1)的中和抗體的篩選。
圖22對能夠中和tau IA型分子并將它們與健康tau鑒別開來的候選藥物的篩選。
圖23單克隆抗體對重組tau IIA型(SEQ ID NO12)的病理活性的中和。
圖24通過ELISA檢測的針對重組tau IIA型(SEQ ID NO12)的抗體水平。
圖25轉基因動物的基因分型。小圖A顯示了親代轉基因動物的基因分型。第1、2、3、和4道來自基因組DNA的DNA雙重截短序列的特異擴增指示由養(yǎng)母后代尾巴提取的基因組DNA中特定轉基因的存在。這些動物代表帶有雙重截短IIA型tau分子的親代轉基因動物。在此實施例中，顯示了陽性(+C)和陰性(-C)以及兩個額外陰性樣品(5、6)(M＝大小標記)。箭頭指示在轉基因陽性動物中期待的預期PCR片段大小。小圖BF1代動物的基因分型。由尾尖提取基因組DNA，并鑒定雙重截短tau特異DNA序列，顯示于第1道。第2和3道顯示陰性對照。F1代中tau特異DNA片段的鑒定證實了這些轉基因的可遺傳性。
圖26F1代轉基因動物中雙重截短人tau轉錄本的基因表達。由新鮮冷凍的轉基因動物組織提取RNA，并進行逆轉錄，隨后是cDNA的特異擴增。一個實施例在第1和2道中顯示表達轉基因的動物。第3-5道代表不進行表達的對照，第5道顯示使用這種方法時非轉基因動物中典型顯現(xiàn)的非特異信號。此實施例指示實驗動物中由轉基因表達的雙重截短tau特異mRNA的存在。
圖27體外分化6天后由IIA型分子過度表達引起的細胞死亡。經(jīng)過雙重截短tau IIA型轉染的SY5Y細胞(IIA型)與未轉染對照神經(jīng)元樣細胞(模擬物)的各自細胞存活率的比較。
圖28A使用來自表達IIA型雙重截短分子和全長tau的穩(wěn)定轉染細胞的tau細胞級分顯示了IIA型分子與微管的結合親和力增加。如上所述分離游離tau(FT)、微管結合tau(MT)、和核相關tau(NAT)。B有機化合物F123對tau IA和IIA型微管聚合實驗的抑制；C通過電子顯微鏡分析顯示的吸收測量與微管聚合之間的直接比較。
圖29用MitoFluor染色的對數(shù)生長SH-SY5Y細胞。線粒體在細胞體和過程中的規(guī)則分布。
圖30用MitoFluor染色的表達tau IIA型分子的對數(shù)生長SH-SY5Y細胞。綠色標記的線粒體在細胞中心體區(qū)域周圍的核周群集。
實施例實施例1N端和C端雙重截短tau IA型和IB型分子的微管裝配健康tau的生理功能在于對穩(wěn)定微管(MT)?？梢酝ㄟ^微管裝配實驗(MAA)來測量這一功能。在此實施例中，使用三類tau分子來進行MAA反應正常健康人的tau、重組形式的tau IA型(SEQ ID NO1)和IB型(SEQ ID NO4)。在分開的反應中分別測定正常人的tau、tauIA型和IB型。將tau的每一種制劑(0.1mg/ml)與純化的豬腦微管蛋白(1mg/ml)和GTP(1mM)在聚合緩沖液(100mM PIPES pH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)中混合。最后加入tau以起動對MT裝配的促進。溫和且快速混勻后，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒為間隔連續(xù)監(jiān)測340nm的混濁度達20分鐘。頂部的曲線1(圖1)顯示了正常健康tau的微管裝配促進能力。相反，IA型(曲線2)和IB型(曲線3)都不展示正常tau的這一活性，而且在MAA中缺乏任何MT裝配促進作用。
實施例2N端和C端雙重截短tau IA型和IB型分子對微管裝配的抑制tau IA型和IB型分子在應用于MT裝配實驗(MAA)時都缺乏功能活性。令人驚訝的是，tau IA型分子在微管裝配中對微管蛋白顯示抑制效果。相反，IB型分子(盡管具有相似的一級結構)在MAA中不抑制微管蛋白的功能活性。為了抑制微管裝配，使用重組形式的tau IA型(SEQID NO1)和IB型(SEQ ID NO4)。使用IA型和IB型蛋白質分別進行裝配抑制反應。將人微管蛋白(2mg/ml)與IA型分子(0.2mg/ml)或IB型分子(0.2mg/ml)混合。將混合物于37℃保溫1小時并溫和搖動。向置于冰上的混合物中加入于聚合緩沖液(100mM PIPES pH6.9、1mMMgSO4、2mM EGTA)中的正常人tau(0.1mg/ml)和GTP(混合物中微管蛋白的終濃度是1mg/ml而GTP的終濃度是1mM)。溫和且快速混勻后，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計(BeckmanCoulter DU640)中于37℃平衡。以10秒為間隔測量340nm的混濁度變化達5分鐘。頂部的曲線1(圖2)證明了正常人tau獨自就完全能夠誘導微管蛋白聚合。微管蛋白與IA型的預保溫消除微管裝配(圖2，底部曲線2)。相反，微管蛋白與IB型(盡管與IA型具有相同的分子量范圍)的預保溫不抑制正常tau的微管裝配能力(圖2，曲線3)。
表N端和C端雙重截短tau分子對微管聚合的影響 SEQ ID NO11-14、19的編號依照最短的R4同種型SEQ ID NO15-18、20的編號依照最短的R3同種型
SEQ ID NO11-14、19的編號依照最短的R4同種型SEQ ID NO15-18、20的編號依照最短的R3同種型實施例3N端和C端雙重截短tau IIA型和IIB型分子在微管裝配中的活性令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，與IA型分子相反，IIA型雙重截短tau衍生物促進病理微管裝配(見圖3和圖28C)。使用三類分子來進行微管裝配反應天然健康人的tau同種型、阿耳茨海默氏tau IIA型(SEQ ID NO12)和tau IIB型(SEQ ID NO19)。進行三個分開的反應，每個反應使用tau的一種制劑(健康tau、重組tau IIA型或IIB型)。將每一種tau制劑(0.1mg/ml)與微管蛋白和GTP(微管蛋白的終濃度是1mg/ml而GTP的終濃度是1mM)混合，所有試劑都溶于聚合緩沖液(100mM PIPESpH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)。溫和且快速混勻后，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒為間隔測量340nm的混濁度變化達5分鐘。在此實驗中，與健康tau的生理微管裝配(圖3，曲線2)相比，重組tau IIA型顯示對病理微管裝配的極高(3倍)促進(圖3，頂部曲線1)。相反，IIB型分子盡管是N端和C端雙重截短的但是在MAA中不表現(xiàn)如IIA型而是只以健康tau的水平促進微管裝配(圖3，曲線3)。
實施例4可以在體外在暴露于多種氧化壓力的表達所述分子的成神經(jīng)細胞瘤上證明由于患病tau II型蛋白引起的擾亂的壓力保護機制在此實施例中，利用3-morpholinosydnonimine(SIN-1)的氧化分解，它生成超氧陰離子和一氧化氮，它們發(fā)生反應而形成peroxynitrite。這種非?；顫姷淖杂苫軌蜻M一步氧化主要是細胞膜系統(tǒng)。本領域技術人員還將能夠對培養(yǎng)的成神經(jīng)細胞瘤細胞施加另一種氧化壓力來源，而且將能夠獲得與此處所述使用SIN-1時相同的效果。
如下測試攻擊作用1.將SIN-1以多種濃度(0-3.32mM)施加于分別表達tau IIA型蛋蛋白質SEQ ID NO15和SEQ ID NO11的人神經(jīng)元細胞系；2.通過3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)反應測定法來測量細胞存活以測定50％細胞存活的過氧化氫有效濃度(EC50)。本領域技術人員知道評估細胞存活的不同方法，用于測量本發(fā)明中描述的作用；3.對成神經(jīng)細胞瘤細胞系比較在存在或缺乏患病tau IIA型蛋白質表達時的EC50值，并通過t檢驗評估EC50值差異的統(tǒng)計學顯著性。在含10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％NEAA、50U/L慶大霉素的MEM/F12中培養(yǎng)細胞。由3-morpholinosydnonimine(SIN-1)在無血清培養(yǎng)基中的1M儲液(如47.5mg溶于230ml)進行稀釋。在MEM/F12w/o血清中制備MTT儲液(2.6mg/ml)，并過濾除菌。
通過本領域眾所周知的方法培養(yǎng)細胞。以2×104細胞/孔接種96孔板。半塊板接種表達tau II型分子的細胞，另半塊板接種不進行表達的細胞。每36-48個小時更換培養(yǎng)基。5天后，以0-3.3mM的濃度范圍添加SIN-1，并將板保溫24小時。每個濃度測定六份。SIN-1保溫后，添加MTT儲液至終濃度200mg/ml，并將板繼續(xù)保溫1小時。丟棄培養(yǎng)基；用紙巾擦干板面。每個孔加入50ml DMSO，并將板于室溫保溫過夜。在ELISA讀板儀上測量540nm的吸光度(于690nm校正背景)，并將減去背景的數(shù)值用于EC50計算，這是本領域眾所周知的。
使用t檢驗測試表達IIA型蛋白質與不表達所述蛋白質的成神經(jīng)細胞瘤細胞之間EC50濃度對數(shù)的差異的顯著性，兩種IIA型患病tau蛋白的P值都小于0.001。tau蛋白SEQ ID NO12和SEQ ID NO18的表達將成神經(jīng)細胞瘤細胞對氧化壓力的抵抗力降低了50％。
所述實施例的結果(圖4)有助于解釋患病形式tau蛋白的病理作用。
本領域技術人員能夠結合任何上述本發(fā)明目標來設計其它測試系統(tǒng)?？梢岳斫猓心軌蛳氲降慕M合都屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
依照圖4的圖表反映了存在tau IIA型時神經(jīng)元細胞對氧化壓力的相對抵抗力的降低。不含所述蛋白質的細胞(對照)的抵抗力表述成100％(左柱)，表達患病tau蛋白的神經(jīng)元細胞的抵抗力顯示為對照值的百分比(中柱和右柱)。抵抗力定義為50％細胞死亡的培養(yǎng)液中由SIN-1生成的自由基濃度。結果分別反映了雙重截短tau蛋白IIA型SEQ ID NO12(93-333，R4)和SEQ ID NO18(69-332，R3)的測量結果。
實施例5各個表位對雙重截短tau IA型構象的貢獻通過整個構象區(qū)(區(qū)段A)或其各個部分(稱為表位且稱作A1-A6)的連續(xù)缺失來測定tau IA型中“構象區(qū)”(區(qū)段A)或其部分的重要性。由于IA型分子的構象與它們的功能關系緊密，因此根據(jù)它在使用tau單克隆抗體時的反應性來測量每個表位(A1-A6)對“區(qū)段A”整個構象的貢獻(圖5)。
原型tau IA型(SEQ ID NO1)具有10nM的親和力。分別缺失了表位A1、A2、和A5的各種缺失突變體SEQ ID NO22、23、和26顯示，這些區(qū)域的貢獻表現(xiàn)為親和力(20-40nM)降低了2-4倍；而在SEQ IDNO24、25、和27中分別缺失表位A3、A4、和A6貢獻更大，親和力損失10-30倍(100-300nM)。只有在缺失整個區(qū)段A(突變體SEQ ID NO21)后，親和力顯著降低，相對于原型tau IA型的親和力降低了三個數(shù)量級。
實施例6N端和C端雙重截短tau I型和II型的分離制備阿耳茨海默氏大腦衍生tau I型和II型分子將來自神經(jīng)病理學確認的阿耳茨海默氏病病例的患病人大腦組織作為來源用于分離雙重截短tau IA、IB、和IIA蛋白。由阿耳茨海默氏大腦制備tau基于TRIS緩沖液中的組織勻漿與通過飽和硫酸銨沉淀的裂解物分級的聯(lián)合。將組織在冷的20mM TRIS pH8、0.32mM蔗糖、10mM b-merkaptoethanol、5mM EGTA、10mM EDTA、5mM MgSO4、1mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5mM苯甲脒、5μg/ml亮肽素、1.5μg/ml抑胃酶肽、2μg/ml抑酶肽中用Heidolph DIAX 900勻漿器于4℃勻漿10分鐘。將勻漿液于4℃以27000g離心30分鐘以除去細胞碎片。通過添加44.12％(v/v)飽和硫酸銨而由大腦組織上清液沉淀tau蛋白。于25℃保溫20分鐘并溫和混勻后，將樣品于25℃以20000g離心10分鐘。將沉淀重懸于500μl 100mMPIPES pH6.9、2mM EGTA、1mM MgSO4，并在相同緩沖液中透析。將此制劑通過凝膠過濾在Superdex 200柱(Amersham-Pharmacia-Biotech)上分級，并通過SDS-PAGE(梯度5-20％聚丙烯酰胺)分離級分，依照標準流程使用抗tau抗體DC25通過免疫印跡檢測tau蛋白(圖6)。測試各個級分對微管裝配的作用。
tau IA型和IB型的分離級分#19(圖7)含有對應于代表雙重截短IA型和IB型分子的分子量(12kDa)的tau分子-此級分顯示最高的抑制能力。使用三種抗tau抗體通過Western印跡分析來鑒定此級分DC25(識別截短和全長這兩種蛋白質)、DC39(對完整C末端特異)、和Alz50(對完整N末端特異)(圖8)。這些抗體的免疫反應性證明了只在來自AD大腦的級分中N端和C端雙重截短I型蛋白質的缺乏。通過相同方法由正常健康大腦制備的相應級分既不顯示抑制活性又不顯示特異免疫反應性(圖9)。通過夾心RIA測定tau蛋白的濃度。使用Bradford測定法測定總蛋白濃度。tau制劑保存于-20℃直至使用。
tau IIA型的分離包含對應于分子量30kDa的tau分子的級分#15(圖6)代表雙重截短IIA型分子。級分#15顯示異常高的微管裝配促進活性。使用三種抗tau抗體通過Western印跡分析來鑒定此級分DC25(識別截短和全長這兩種蛋白質)、DC39(對完整C末端特異)、和Alz50(對完整N末端特異)(圖10)。這些抗體的免疫反應性證明了只在衍生自AD大腦的級分中N端和C端雙重截短II型蛋白質的存在。通過夾心RIA測定tau蛋白的濃度。使用Bradford測定法測定總蛋白濃度。
重組tau I型和II型蛋白的克隆、表達和純化重組截短tau蛋白的基因衍生自同種型tau43和tau44的人cDNA。使用NdeI-EcoRI限制性位點將cDNA插入片段克隆到pET17b(Novagen)載體中。(圖11)(Studier等人，Meth.Enzym.，18560-89，1990)。
通過由cDNA PCR擴增相關區(qū)域來制備重組N端和C端雙重截短tau分子(SEQ ID NO1-24)。使用引入翻譯起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TGA)、和NdeI-EcoRI限制性位點的特異引物。
通過反相PCR生成在tau cDNA中攜帶A4-A6表位(SEQ IDNO25-27)缺失的質粒，如圖11所示(底圖)。
實施例7AD大腦衍生和重組tau IA型在微管裝配實驗中對正常健康tau的抑制作用tau IA型的AD大腦提取物和重組分子能夠在使用天然健康tau同種型時抑制微管裝配促進。對于這些實驗，健康人tau分離自年齡匹配對照大腦，而tau IA型分離自AD患者大腦(見實施例6，圖6，級分#19)。如實施例6所示生成并純化重組tau IA型(SEQ ID NO1)和IB型(SEQID NO4，陰性對照)。在這些實驗中，將大腦衍生健康tau同種型(0.1mg/ml)、AD大腦衍生或重組tau IA型或IB型(0.2mg/ml)與微管蛋白混合。分別測定每種組合。將測試混合物在水浴中于37℃保溫1小時并溫和搖動。向置于冰上的混合物中加入GTP和/或正常tau(微管蛋白的終濃度是1mg/ml而GTP的終濃度是1mM)，所有試劑都溶于聚合緩沖液(100mM PIPES pH6.9、1mM MgSO4、2mM EGTA)。溫和且快速混勻后，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計(Beckman Coulter DU640)中于37℃平衡。以10秒為間隔測量340nm的混濁度變化達5分鐘。數(shù)據(jù)顯示AD大腦衍生和重組這兩種雙重截短IA型分子都抑制正常tau促進微管裝配的能力(圖12，曲線2、3)。相反，重組IB型不能抑制由正常人tau誘發(fā)的微管蛋白聚合促進活性(圖12，曲線4)。曲線1(圖12)代表由正常tau促進的微管裝配。
實施例8中和tau IA型病理活性的候選藥物的篩選測定法利用雙重截短tau IA型分子抑制健康正常tau促進微管聚合的活性的能力，設計用于選擇能夠中和IA型分子抑制活性的化合物的篩選測定法?；疾au IA型可以衍生自AD大腦或重組來源，然而有利的是使用重組材料。可以通過測量正常健康tau促進微管裝配的殘余能力來定量確定候選藥物的中和作用。該測定法分兩步進行1.篩選中和tau IA型的候選藥物。將原型重組IA型分子(SEQ IDNO1)(終濃度100mg/ml)與每種候選藥物(終濃度50mg/ml)的分別混合物于37℃預保溫1小時。保溫后，于4℃向混合物中添加微管蛋白、GTP和健康tau(終濃度微管蛋白-1mg/ml，GTP-1mM，健康tau-100mg/ml)?？焖倩靹蚝螅瑢悠芳虞d到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計中于37℃平衡。測量340nm的混濁度變化。通過測量正常健康tau的殘余微管裝配促進能力來選擇能中和IA型活性的候選藥物(圖13；將候選藥物與IA型分子一起預保溫，并測定IA型在微管裝配中的中和效率。底部曲線1和頂部曲線2代表所測候選藥物針對患病IA型分子的陰性(無中和)和陽性(100％)中和活性。中部曲線指示三種不同候選藥物的IA型中和的不同效率)。顯然，選擇陽性藥物的閾值是任意的，而且可以由IA型的完全中和至部分中和而變化。
2.選擇中和IA型分子并將它們與正常健康tau鑒別開來的候選藥物。對具有針對tau IA型分子的中和活性的選定候選物篩選與正常健康tau的反應性以選擇只對IA型特異的分子。將正常健康tau(終濃度100mg/ml)與每種候選藥物(終濃度50mg/ml)的分開混合物于37℃預保溫1小時。保溫后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(終濃度微管蛋白1mg/ml，GTP 1mM)?？焖倩靹蚝螅瑢悠芳虞d到石英微量比色杯中。測量340nm的混濁度變化。選擇那些顯示不干擾健康tau的MT聚合促進活性的候選藥物(圖14)。
實施例9中和tau IIA型的病理活性的候選藥物的篩選測定法本發(fā)明顯示了tau IIA型分子具有出乎意料的促進微管蛋白聚合的高潛能，這構成了用于選擇中和IIA型蛋白質所述活性的化合物的篩選測定法的基礎?？梢酝ㄟ^測量IIA型分子的殘余微管裝配活性來對IIA型的中和作用定量。該測定法分兩步進行1.篩選中和tau IIA型的治療性候選藥物。將tau IIA型(SEQ ID NO12)(終濃度100mg/ml)與每種候選藥物(終濃度50mg/ml)的分別混合物于37℃預保溫1小時。保溫后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(終濃度微管蛋白1mg/ml，GTP-1mM)?？焖倩靹蚝螅瑢悠芳虞d到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計中于37℃平衡。測量340nm的混濁度變化。選擇顯著降低微管裝配速率的候選藥物用于測定法的第二步(圖15；將候選藥物與IIA型分子一起預保溫，并在微管裝配中測定IIA型的中和效率。底部曲線1代表各種候選藥物的陽性(100％)中和活性，而頂部曲線2指示患病IIA型分子沒有中和。中部曲線指示多種候選藥物在IIA型中和方面的不同效率)。
2.選擇中和IIA型分子并將它們與正常健康tau鑒別開來的候選藥物。將每種候選藥物(終濃度50mg/ml)與正常健康tau(終濃度100mg/ml)的分別混合物于37℃預保溫1小時。然后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(終濃度微管蛋白1mg/ml，GTP-1mM)?？焖倩靹蚝?，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計中平衡于37℃。測量340nm的混濁度變化。選擇不干擾健康tau的候選藥物(圖16；將第一步中選擇的候選藥物與健康tau一起預保溫，并測定對微管裝配的作用。底部曲線1代表健康tau的最大抑制，而頂部曲線2指示不抑制健康tau。中部曲線顯示具有針對健康tau的不同抑制活性的候選藥物)。
實施例10中和N端和C端雙重截短IA型和IIA型分子的單克隆抗體的制備免疫方案和融合流程將由人阿耳茨海默氏大腦分離的N端和C端雙重截短tau I型蛋白質(級分#19，實施例6)用作免疫原。用溶于完全弗氏佐劑的所述蛋白質(50mg/小鼠)對Balb/c小鼠進行皮下引發(fā)，并用相同蛋白質(50mg/小鼠)以4周為間隔進行3次腹膜內(nèi)加強。采集prefusion血清，并通過ELISA測試針對tau的特異性抗體水平(圖17；在ELISA中在相同抗原上測試經(jīng)過AD衍生tau免疫的小鼠血清中特異性抗體水平。所有5份血清都對所述tau蛋白顯示高抗tau結合活性。圖17代表一只經(jīng)免疫小鼠中的特異性抗體水平。使用來自用無關蛋白質免疫的小鼠的血清作為對照)。使用本領域眾所周知的修正流程(M.Kohler和C.Milstein，1975)，將小鼠脾細胞與NS/0骨髓瘤細胞融合。
依照圖18所示結果，單克隆抗體DC44、DC82和DC136識別來自阿耳茨海默氏大腦的N端和C端雙重截短IA型和IIA型分子。對于這些抗體，在使用通過相同方法由正常人大腦制備的分離物時沒有觀察到反應性(圖18)。相反，單克隆抗體DC25在ELISA中與來自病理大腦和正常健康大腦的所述蛋白質發(fā)生反應(圖18)。這一抗體不能鑒別tau的病理形式(AD-tau)與正常人tau。這一初級篩選后，將雜交瘤亞克隆到軟瓊脂糖中，這是本領域熟練技術人員眾所周知的技術，最后生成分泌具有相同獨特型的抗體的同源雜交瘤群體。
在與篩選測定法相同的ELISA中，對這些克隆的雜交瘤克隆進一步檢查與重組全長tau同種型和雙重截短tau IA型(SEQ ID NO1)和IIA型(SEQ ID NO12)分子的反應性。
實施例11使用單克隆抗體對AD大腦衍生和重組N端和C端截短IA型分子的病理活性的中和對選定的單克隆抗體DC44、DC82、DC136、和DC25進一步鑒定它們中和由阿耳茨海默氏大腦分離的天然tau IA型的活性的能力(見實施例6)。所述tau分離物(終濃度100mg/ml)與所測抗體(終濃度50mg/ml)一起于37℃預保溫1小時。保溫后，于4℃向混合物中添加微管蛋白、正常人tau和GTP(終濃度微管蛋白-1mg/ml，健康人tau-100mg/ml，GTP-1mM)?？焖倩靹蚝?，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計中平衡于37℃。測量340nm的混濁度變化。單克隆抗體DC136、DC44和DC82能夠抑制所述蛋白質的病理活性(圖20；將抗體與天然tau IA型(級分#19)一起預保溫，隨后與健康人tau、微管蛋白、和GTP混合。于37℃5分鐘后分光光度法測定微管形成。柱代表三次獨立實驗的平均值。MAA-使用健康人tau的微管裝配實驗。MAIA-使用與tau IA型一起預保溫的健康人tau的微管裝配抑制實驗(不含抗體))。在一個類似實驗中，用重組原型tau IA型(SEQ ID NO1)測試抗體，顯示中和活性的相似模式(圖21)。對照抗體DC25在ELISA和Western印跡測試中識別所有形式的截短和正常tau，但是在微管裝配實驗中不干擾AD大腦衍生IA型活性。這些結果說明，與抗體DC136、DC44和DC82相比，抗體DC25與tau的獨特區(qū)域發(fā)生反應。相反，抗體DC136、DC44和DC82結合涉及IA型分子病理學的表位。
下一個選擇步驟針對能夠鑒別健康與IA型分子的抗體。將正常健康tau(終濃度100mg/ml)與所測抗體(終濃度50mg/ml)的混合物于37℃預保溫1小時。保溫后，于4℃向混合物中添加微管蛋白和GTP(終濃度微管蛋白-1mg/ml，GTP-1mM)?？焖倩靹蚝?，將樣品轉移到石英微量比色杯中，并在控溫分光光度計中平衡于37℃。測量340nm的混濁度變化。抗體DC136、DC44、DC82和DC25都不能在微管裝配中抑制正常健康tau(圖22；將中和tau IA型的抗體與健康tau一起預保溫，隨后與微管蛋白和GTP混合。于37℃保溫5分鐘后分光光度法測定微管形成。柱顯示三次獨立實驗的平均值。MAA-使用健康tau的微管裝配實驗。使用中和健康tau的抗體作為陰性對照)。這些數(shù)據(jù)證明抗體DC136、DC44、和DC82識別涉及截短患病形式tau與健康tau蛋白相互作用的特定表位。
實施例12單克隆抗體對IIA型活性的中和使用實施例8B所述方法，對先前為了它們的tau IA型中和活性而分離的抗體測試它們針對重組tau IIA型(SEQ ID NO12)的中和能力。所有三種中和性單克隆抗體DC44、DC82、和DC136都能夠降低N端和C端雙重截短tau IIA型分子的病理活性(圖23；將抗體與重組tau IIA型一起預保溫，然后與微管蛋白和GTP混合。于37℃保溫5分鐘后分光光度法測定微管形成。柱代表三次獨立實驗的平均值。MAA-使用tauIIA型的微管裝配實驗(不含抗體))。這說明所述抗體的表位至少由IA型SEQ ID NO1與IIA型SEQ ID NO12共享。對于抗體DC25，沒有觀察到IIA型抑制活性。
實施例13重組N端和C端雙重截短tau IA和IIA型分子的免疫原性免疫方案在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將所述重組tau IA和IIA型蛋白質用于接種目的或用于引起特異中和患病tau IA和IIA型分子的病理活性的抗體。在給定實施例中，將重組N端和C端雙重截短tau IIA型(SEQ ID NO12)用作免疫原。用溶于完全弗氏佐劑的所述蛋白質(50mg/小鼠)對Balb/c小鼠進行皮下引發(fā)，并用溶于不完全弗氏佐劑的相同蛋白質(50mg/小鼠)以4周為間隔進行3次腹膜內(nèi)加強。采集免疫血清，并通過ELISA測定針對各自重組抗原tau的特異性抗體水平(圖24)。
實施例14轉基因動物由尾尖提取DNA使用Dneasy組織試劑盒(Qiagen)提取基因組DNA。
基因分型(圖25)對衍生自親代轉基因動物的基因組DNA進行編碼雙重截短tau形式的轉基因的特異擴增，并顯示于圖25A。對F1代基因組DNA的進一步分析揭示了轉基因是可遺傳的，因為它們在親代的后代中也得到鑒定。因此，編碼雙重截短tau的轉基因固定在動物的染色體DNA中(圖25B-F1代的基因分型)。此實施例中所使用的動物具有特定遺傳背景，特征是自發(fā)性高血壓和其它阿耳茨海默氏病相關致病因素(risk factor)，諸如異常脂血癥或糖尿病。因此，這種動物系通過結合最頻繁發(fā)生的阿耳茨海默氏病致病因素諸如高血壓和糖尿病而代表獨特的實驗性阿耳茨海默氏模型。
使用如Sambrook等人，《Molecular Cloning，A LaboratoryManual》即《分子克隆，實驗室指南》，CSH實驗室，紐約，2001所述的分子生物學標準技術來生成轉基因。將編碼雙重截短tau的cDNA導入表達載體，該載體連接普遍性或組織特異性方式指導表達的啟動子。通過前核注射將基因片段導入一日齡胚胎(不受限制)。使用來自尾尖的基因組DNA對得到的后代進行基因分型。
轉基因表達的分析(圖26)運用普遍知道的方法諸如RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳，通過RT-PCR分析來評估由轉基因衍生的mRNA的表達。
圖25的小圖A顯示了親代轉基因動物的基因分型。第1、2、3、和4道來自基因組DNA的DNA雙重截短序列的特異擴增指示由養(yǎng)母(fostermother)后代尾巴提取的基因組DNA中特定轉基因的存在。這些動物代表攜帶雙重截短IIA型tau分子的親代轉基因動物。在此實施例中，顯示了陽性(+C)和陰性(-C)以及兩個額外陰性樣品(5、6)(M＝大小標記)。箭頭指示在轉基因陽性動物中期待的預期PCR片段大小。圖25的小圖BF1代動物的基因分型。由尾尖提取基因組DNA，并鑒定雙重截短tau特異DNA序列，顯示于第1道。第2和3道顯示陰性對照。F1代中tau特異DNA片段的鑒定證實了這些轉基因的可遺傳性。
圖26由新鮮冷凍的轉基因動物組織提取RNA，并進行逆轉錄，隨后是cDNA的特異擴增。一個實施例在第1和2道中顯示表達轉基因的動物。第3-5道代表不進行表達的對照，第5道顯示使用這種方法時非轉基因動物中典型顯現(xiàn)的非特異信號。此實施例指示實驗動物中由轉基因表達的雙重截短tau特異mRNA的存在。
實施例15AIIA型分子的過度表達在已分化神經(jīng)元樣分子中引起細胞死亡在成神經(jīng)細胞瘤細胞系SH-SY5Y中，使用本領域熟練技術人員知道的標準化體外分化條件證明了由IIA型分子引起的細胞死亡。在表達IIA型雙重截短tau的穩(wěn)定轉染細胞中測試該作用，并與未轉染細胞進行比較。一式三份使用臺盼藍(trypan blue)排除測定法對細胞存活率手工定量，并使用單向ANOVA檢驗進行統(tǒng)計學評估。體外分化6天后發(fā)現(xiàn)了過度表達IIA型雙重截短tau的細胞與野生型細胞之間細胞存活率的顯著差異(p＜0.001)。IIA型雙重截短tau的過度生成(占總蛋白量的0.5％)引起細胞存活率降低3倍(圖27；用雙重截短tau IIA型轉染的SY5Y細胞(IIA型)與未轉染對照神經(jīng)元樣細胞(模擬物)各自細胞存活率的比較)。
與先前顯示的構造類似，使用編碼雙重截短I型分子的構建體建立了相似系統(tǒng)。
II型雙重截短tau分子顯示對微管系統(tǒng)的結合親和力增加。
由表達IIA型雙重截短tau和全長tau的穩(wěn)定轉染SH-SY5Y細胞分離游離tau級分(FT)、微管相關級分(MT)和核級分(NAT)。對與微管結合的tau的定量顯示雙重截短IIA型tau與微管的親和力相對于全長形式增加(超過50％)(圖28A；使用來自表達IIA型雙重截短分子和全長tau的穩(wěn)定轉染細胞的細胞級分證明了IIA型分子與微管的結合親和力增加。如上所述分離游離tau(FT)、微管結合tau(MT)和核相關tau(NAT))。依照本領域所使用的標準細胞生物學分級方法對tau的量定量，隨后是Western印跡分析。使用定量的重組tau蛋白計算校準曲線。
B對有機物F123[C34-59O14-23H32-44N6-8]n分析它在微管聚合實驗中的抑制效果(1)將F123與tau(正常tau和IA型tau濃度100μg/ml；IIA型tau濃度60μg/ml)一起于37℃保溫1小時；(2)添加微管蛋白(濃度＝1mg/ml)；
(3)測量340nm/5分鐘(注意所有稀釋用PIPES緩沖液進行)。
C對正常健康tau和阿耳茨海默氏tau II型分析它們的微管裝配促進能力。在此實施例中，由tau43代表的正常tau形成典型微管，如電子顯微鏡檢查所示(見圖28C)。然而，阿耳茨海默氏tau II型生成具有典型模式的病理微管(見圖28C)。
實施例16真核細胞中N端和C端雙重截短tau II型過度表達的功能后果在成神經(jīng)細胞瘤細胞系SH-SY5Y中進行顯示由過度表達IIA型分子引起的線粒體轉運改變的病理表型。通過在活的野生型SH-SY5Y細胞與轉染細胞中比較線粒體再分布來檢驗N端和C端雙重截短tau II型分子的影響。使用本領域熟練技術人員知道的細胞生物學轉運測定法。簡而言之，依照標準實驗室技術在LabTekII室(Nunc)上培養(yǎng)細胞至相等密度(70％匯合)，并使用Fugene 6(Roche)依照制造商的指示進行轉染。遵循制造商的指示進行線粒體染色(MitoFluor Red 594，Molecular Probes)。用配備63x油浸接物鏡和熒光濾鏡的Axiovert200M熒光顯微鏡(ZEISS)檢查活細胞。用CCD相機(Photometrics，Cool snap HQ；Hamamatsu)聯(lián)合軟件程序MetaMorph(UniversalImaging)照相。
使用線粒體特異染料MitoFluor(Molecular Probes)，在經(jīng)誘導與未誘導SH-SY5Y細胞中比較線粒體定位。染色證實了IIA型雙重截短tau分子在SH-SY5Y細胞中對線粒體轉運的消極作用，導致核周線粒體在中心體附近群集，指示截短末端針對胞內(nèi)力量的功能優(yōu)勢(圖30)。
作為對照，對數(shù)生長細胞(圖29)顯示線粒體在細胞體和細胞周邊的規(guī)則分布?？傊?，N端和C端雙重截短IIA型蛋白質因而能夠影響胞內(nèi)轉運機制，進而影響線粒體再分布。此實驗設置顯示用于測試針對IIA型分子的抑制活性的合適方法。
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權利要求
1.N端和C端雙重截短tau分子，特征在于(“IA型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前236個N端氨基酸和至少后45個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；-所述分子在體外微管裝配實驗中阻止正常tau蛋白促進微管裝配；且-所述微管裝配促進的阻止作用可以在微管裝配實驗中通過針對該分子的特異性抑制性中和單抗來消除。
2.依照權利要求1的IA型tau分子，特征是包含選自SEQ ID NO1-3的氨基酸序列。
3.N端和C端雙重截短tau分子，特征在于(“IB型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前238個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前207個N端氨基酸和至少后50個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；且-所述分子在體外微管裝配實驗中不阻止野生型tau蛋白促進微管裝配。
4.依照權利要求3的IB型tau分子，特征是包含選自SEQ ID NO4-10的氨基酸序列。
5.N端和C端雙重截短tau分子，特征在于(“IIA型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前68個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前68個N端氨基酸和至少后20個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；-所述分子在體外微管裝配實驗中具有比野生型tau更高的微管裝配促進活性；-所述分子在體外微管裝配實驗中的所述微管裝配促進活性可以通過針對該分子的特異性抑制性中和單抗來消除；且-所述分子的病理活性依賴其由微管聚合促進活性限定的與微管網(wǎng)絡的結合。
6.依照權利要求5的IIA型tau分子，特征是包含選自SEQ ID NO11-18的氨基酸序列。
7.N端和C端雙重截短tau分子，特征在于(“IIB型tau分子”)-所述分子相對于含四重復的tau43而言截短至少前68個N端氨基酸和至少后40個C端氨基酸或相對于含三重復的tau44而言截短前68個N端氨基酸和至少后20個C端氨基酸；-所述分子能夠在阿耳茨海默氏患病大腦組織中檢測到，但不能在正常健康大腦組織中檢測到；且-所述分子在體外微管裝配實驗中具有與野生型tau不同的病理微管裝配促進活性。
8.依照權利要求7的IIB型tau分子，特征是包含選自SEQ ID NO19-20的氨基酸序列。
9.用于制備依照權利要求1-8任一項的分子的方法，特征是通過下列步驟a)構建攜帶雙重截短tau分子編碼序列的重組原核表達質粒，其中缺失包括至少前236個氨基酸和后40個氨基酸或前68個氨基酸和后20個氨基酸或其組合；b)在容許表達所述N端和C端雙重截短tau分子的條件下培養(yǎng)所述細菌；c)收集細菌，優(yōu)選通過離心；d)重懸細菌沉淀；e)超聲處理所述細菌；f)通過凝膠過濾將所述經(jīng)過超聲處理的細菌分級；并g)通過微管裝配實驗監(jiān)測得到的級分的活性，從而鑒定I型和II型tau分子的不同活性。
10.依照權利要求9的方法，特征是截短如權利要求1-8任一項的定義。
11.依照權利要求9或10的方法，特征是微管裝配實驗活性如權利要求1-8任一項的定義。
12.用于制備依照權利要求1-8任一項的分子的方法，特征是通過下列步驟a)提供阿耳茨海默氏患病大腦組織；b)將所述患病大腦組織在緩沖液尤其是Tris緩沖液中勻漿；c)將所述經(jīng)過勻漿的大腦組織進行硫酸銨沉淀；d)重新溶于PIPES緩沖液；e)通過凝膠過濾將所述重新溶解的材料分級；并f)通過微管裝配實驗監(jiān)測得到的級分的活性，從而鑒定I型和II型tau分子的不同活性。
13.依照權利要求12的方法，特征是微管裝配實驗活性如權利要求1-8任一項的定義。
14.用于測試有效分解依照權利要求1或2的分子(IA型分子)與微管蛋白的復合物的物質的方法，包括下列步驟h)容許IA型分子與微管蛋白之間形成蛋白質復合物；并i)將蛋白質復合物與待測物質一起保溫，并鑒定那些抑制IA型分子和/或容許野生型tau的微管裝配促進能力和微管的正常功能恢復的物質。
15.用于測試在表達野生型tau的細胞系統(tǒng)中有效抑制依照權利要求1或2的分子(IA型分子)起動與微管蛋白形成復合物的物質的方法，包括下列步驟a)將編碼IA型分子的功能基因導入表達正常tau蛋白的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；b)容許IA型分子與微管蛋白分子之間形成蛋白質復合物；c)將待測物質施加到包含所述復合物的細胞上；并d)檢驗所述物質對權利要求1中定義的IA型生物活性的作用。
16.用于將微管體外轉變成病理狀態(tài)的方法，特征是將野生型tau蛋白與依照權利要求5或6的IIA型一起在容許所述IIA型分子與微管相互作用的生理條件下保溫而生成病理微管。
17.用于對能夠中和依照權利要求5或6的IIA型分子的病理作用的物質篩選它們消除和/或中和IIA型分子并恢復由II型分子引起的生理微管參數(shù)和功能的特性的方法，包括下列步驟a)依照權利要求16在存在IIA型分子和微管蛋白下形成病理微管；b)將物質、IIA型和微管蛋白的混合物與待測物質一起保溫；并c)檢驗在減少由IIA型分子引起的病理微管形成方面的結果。
18.用于測試在表達IIA型分子的細胞系統(tǒng)中有效抑制依照權利要求5或6的IIA型分子在促進異常微管形成方面的體內(nèi)活性和功能的物質的方法，包括下列步驟a)將編碼IIA型分子的功能基因導入表達野生型tau的細胞，處于合適調控區(qū)的控制之下；b)容許IIA型tau分子與微管之間形成復合物，由此所述復合物參與病理微管的形成；c)將待測物質施加到包含所述復合物的細胞上；并d)檢驗所述物質對IIA型生物活性的作用，尤其是對微管網(wǎng)絡及其相關功能的修飾。
19.表達依照權利要求1-8任一項的分子的轉基因動物。
20.依照權利要求19的轉基因動物作為阿耳茨海默氏病的動物模型的用途，尤其是用于篩選和測試治療阿耳茨海默氏病的藥物。
21.包含依照權利要求1-8任一項尤其是依照權利要求1、2、5、或6的分子和制藥學可接受載體尤其是佐劑的疫苗。
22.依照權利要求1或2的分子與微管蛋白形成復合物起動的抑制劑。
23.依照權利要求22的抑制劑，特征是它包含結合部分，如以保藏號02060767保藏于歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，Porton Down，Salisbury，英國的單克隆抗體DC44。
全文摘要
本發(fā)明描述了新型N端和C端雙重截短tau分子(“IA、IB、IIA、和IIB型tau分子”)，以及由重組和生物這兩種來源提供這些分子的方法。此外，還提供了結合阿耳茨海默氏病的診斷和治療方法使用這些分子的篩選方法。
文檔編號G01N33/68GK1668641SQ03816647
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權日2002年7月12日
發(fā)明者E·康特賽克瓦 申請人:阿克松神經(jīng)科學研究和發(fā)展股份有限公司