專利名稱：：tau蛋白的制作方法tau蛋白本申請是分案申請，母案的申請?zhí)枮?2805313.3(國際申請?zhí)朠CT/EP02/00897)，申請日為2002年01月29日，發(fā)明名稱為"tau蛋白"。本發(fā)明涉及阿爾茨海默病(Alzheimer，sdisease)和其它tauo病(tauopathies)。阿爾茨海默病(AD)是最常見的慢性神經(jīng)變性疾病，其在臨床上的特征在于進(jìn)行性和不可逆的認(rèn)知和行為功能喪失。這種疾病可能持續(xù)10年以上，從輕度癥狀開始到極其嚴(yán)重的表現(xiàn)。AD危害了約10%的65歲以上人群和20°/。的80歲以上人群。隨著西方社會的不斷增長，患病人數(shù)正在上升僅在美國就已經(jīng)有500萬患者，且截至到2000年年底，世界上大約有1800萬人患癡呆。在他們中，認(rèn)為有大約三分之二的病例、即1200萬人將成為阿爾茨海默病。它是心臟病、癌癥和中風(fēng)之后的西方世界中的第四大殺手?；及V呆的人的數(shù)量正在快速增加。到2025年，在發(fā)達(dá)國家患癡呆的人的數(shù)量將會為1980年的2倍。護(hù)理這些患者的社會成本是巨大的。例如，據(jù)估計(jì)美國社會用于診斷和控制AD、主要是用于監(jiān)護(hù)的成本目前每年在800億美元。目前，既沒有AD癥狀發(fā)生前的診斷試驗(yàn)、也不能治愈AD。因此，在臨床上是在癥狀發(fā)生而基本上排除其它形式的癡呆后才能診斷該病。巴伐利亞精神病學(xué)家AloisAlzheimer在93年前的1907年觀察到的AD大腦中的傳統(tǒng)指征老年(神經(jīng)炎)斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的累積仍然保留為AD的神經(jīng)病理學(xué)特征。胞內(nèi)神經(jīng)原纖維結(jié)構(gòu)(神經(jīng)原纖維纏結(jié)、營養(yǎng)不良性軸突和神經(jīng)纖維網(wǎng)絲)的常見共同特征在于成對螺旋纖絲(PHFs)。PHFs的主要蛋白亞單位是異常高磷酸化形式的微管結(jié)合蛋白tau(Grundke-Iqbal等:1986;Wischik等，1988a，b)。帶有神經(jīng)原纖維改變的神經(jīng)元變性，且這種變性的程度直接與受侵害個(gè)體的癡呆程度有關(guān)(Blessed等，1968)。正常tau是主要分布至軸突的微管結(jié)合蛋白。tau蛋白參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元且可能是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體中的微管(MT)裝配、空間結(jié)構(gòu)和特性(Drewes等，1998;Drubin和Kirschner,1986;LoPresti等，1995)。tau蛋白由位于第17染色體上的單一基因編碼，且在來自成人大腦的組織提取物中以多同種型(isoform)被檢測到(Goedert等，1989;HimmlerA.,1989;Kosik等，1989)。tau蛋白的異質(zhì)性部分是由于可選剪接所導(dǎo)致的，從而在成人大腦中產(chǎn)生6個(gè)同種型。這些不同的同種型的區(qū)別在于在氨基末端區(qū)上存在或不存在29-或58-氨基酸插入片段，以及在稱作微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域的tau羧基末端區(qū)上添加或缺失了銜接重復(fù)(可以重復(fù)3或4次)。該區(qū)由不完全重復(fù)的31或32個(gè)氨基酸殘基組成。在人體中，最小的tau同種型在MT結(jié)合結(jié)構(gòu)域上含有帶有三個(gè)銜接重復(fù)的352個(gè)氨基酸殘基且不含氨基末端插入片段，而最長同種型含有441個(gè)殘基，帶4個(gè)重復(fù)片段和兩氨基末端插入片段。為簡便起見，在本專利申請中所有的編號均指的是含有Goedert等(1989)的全部插入片段(441個(gè)氨基酸長)的最長人tau蛋白同種型htau40。已知許多神經(jīng)疾病帶有含微管結(jié)合蛋白tau的絲狀細(xì)胞包涵體，這些神經(jīng)疾病例如有阿爾茨海默病(AD)、進(jìn)行性核上麻瘠(PSP)、皮質(zhì)基底(corticobasal)的變性(CBD)、皮克病(Pick，sdisease)(PiD)和共同稱作帶有與第17染色體相關(guān)的帕金森綜合征的額顳癡呆的一組相關(guān)疾病(FTDP-17)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)、拳擊性癡呆(dementiapugilistica)(DP)、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinkerdisease)(GSSD)、雷維小體病和亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease)(Dickinson等，1998;DiFiglia等，1997;Forno，1986;Hirano和Zimmerman,1962;Nishimura等，1995;Prusiner1996;Reed等，1998;Roberts,1998;Schmidt等，1996;Shankar等，1989;Spillantini等，1998)。盡管這些疾病中包含的病因?qū)W、臨床癥狀、病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和生化組成不同，但是出現(xiàn)的證據(jù)提示涉及正常細(xì)胞蛋白聚集成各種絲狀包涵體的機(jī)制相差無幾。認(rèn)為啟動生成用于纖絲裝配的核心或種子的微管結(jié)合蛋白tau的最初構(gòu)象改變是關(guān)鍵特征。該過程可以受到正常蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、某些基因的突變或缺失和結(jié)合正常蛋白質(zhì)且由此改變其構(gòu)象的因素的影響。tau蛋白是極為親水性的?？梢砸子趶拇竽X組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取它。比較而言，提取自阿爾茨海默病態(tài)大腦組織的絲狀tau是相對不溶性的。不溶性和正?？扇苄缘膖au在翻譯后修飾的程度不同，除磷酸化外，還包括糖基化、糖化、遍在蛋白化和外消旋化(Kenessey等，1995;Ko等，1999;Mori等，1987;Wang等，1996;Yan等，1994)。尚不了解修飾tau蛋白以參與AD中纖絲形成的機(jī)制。tau是已知的最可溶性蛋白之一(Cleveland1977a，b;Lee等1988)，且由此AD中它的聚集特別令人費(fèi)解。tau的磷酸化影響了tau形成聚集物的可能性，從而產(chǎn)生了刺激或抑制作用，推斷這取決于磷酸化位點(diǎn)(Crowther等，1994;Schneider等，1999)。許多體外研究證明在有還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、不飽和游離脂肪酸類、RNA或糖胺聚糖類存在的情況下，正常tau可以被轉(zhuǎn)化成纖絲(Goedert等，1996;K卿ers等，1996;Perez等，1996;Wilson和Binder,1997)。此外，通過Cys322上氧化生成的交聯(lián)tau的存在也可以加速^f絲形成過程(Schweers等，1995)。不同纖絲裝配研究中不同的參數(shù)已經(jīng)包括了tau蛋白濃度、pH，而溫育的離子強(qiáng)度高于生理?xiàng)l件下存在于胞質(zhì)中的離子強(qiáng)度許多倍。掃描透射電鏡(STEM)對體外形成的tau纖絲進(jìn)行的檢驗(yàn)顯示這些纖絲不同于天然成對螺旋纖絲(Ksiezak-Reding,1998)。在沒有聚糖或RNA存在的情況下，在含有未磷酸化或磷酸化野生型tau、正常tau的樣品中沒有可檢測到的PHF-樣纖絲。對化學(xué)交聯(lián)的肝素處理的tau的研究表明肝素處理誘導(dǎo)tau蛋白中的構(gòu)象改變(Paudel和Li，1999)。與體外數(shù)據(jù)共同提示(a)微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)au纖絲裝配而言是重要的;和(b)tau纖絲的形成要求tau的構(gòu)象改變。這些研究同時(shí)表明所述的tau修飾中沒有一種能夠單獨(dú)誘導(dǎo)與阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成。對引起導(dǎo)致疾病情況中纖絲形成的tau改變而言重要的因素的確定和描述對開發(fā)癥狀發(fā)生前的診斷標(biāo)記和干預(yù)tauo病進(jìn)展的治療劑而言是重要的。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于阿爾茨海默病或其它tauo病中的早期治療干預(yù)的可靠藥物靶物。此外，希望提供能夠特異性檢測該藥物靶物并與之發(fā)生相互作用的特異性單克隆抗體。這種抗體不僅應(yīng)適合于在癥狀發(fā)生前檢測所述分子、而且也應(yīng)適合于抑制和消除該分子，由此適合于阿爾茨海默病或其它tauo病的癥狀發(fā)生前的診斷、治療和預(yù)防。使用本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這些目的，而本發(fā)明在一個(gè)方面中涉及對構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對正常tau蛋白而言是非特異性的。這類tau蛋白的異常形式代表一族新的分子，它們是在構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性的、優(yōu)選異常截短的形式(Novak等，1991,1993)。使用本發(fā)明可以證實(shí)這些構(gòu)象不同形式的在本說明書中稱作"tauons"的tau蛋白是種子、即與阿爾茨海默病臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成的自我繁殖過程中的成核中心，由此tauons是阿爾茨海默病的重要治療靶物。本發(fā)明的tauons可以是異常截短的tau蛋白。使用本發(fā)明的抗體可以在體外和神經(jīng)元內(nèi)抑制tauons的生物活性。這些抗體具有在AD癥狀發(fā)生前的I、II和III期中對存在的tauons進(jìn)行染色的能力，從而使它們適合于該病的癥狀發(fā)生前的診斷。對本發(fā)明的抗體而言，關(guān)鍵是僅不同構(gòu)象形式的tau蛋白(即"tauon")由這種抗體識別，而正常的tau蛋白不與本發(fā)明的抗體結(jié)合。在本發(fā)明的過程中，將微管結(jié)合蛋白tau的AD截短形式純化至同質(zhì)且證實(shí)是來自阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元的絲狀tau分離物的主要部分。氨基酸序列數(shù)據(jù)顯示tauons的主鏈與蛋白質(zhì)tau的主鏈沒有區(qū)別，而tauons在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau的方面可能在于本發(fā)明構(gòu)象特異性單克隆抗體所揭示的不同構(gòu)象。這類抗體的具體實(shí)例是由在2000年8月22日保藏在歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)、保藏號為00082216的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體DC-ll和在2000年8月22日保藏在ECACC、保藏號為00082215的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll/I產(chǎn)生的單克隆抗體DC-11/I。由本發(fā)明提供的該族單克隆抗體通過識別tauon-特定構(gòu)象而不識別正常人可溶性tau來確定。與正常人tau相比不同的構(gòu)象在病理學(xué)上是由迄今為止來自阿爾茨海默病患者測試樣品中tau分子N-末端或C-末端或兩末端上的異常截短所導(dǎo)致的。令人關(guān)注的是不同構(gòu)象與tau同種型和磷酸化水平無關(guān)。這種使tauons獲得典型構(gòu)象的不可缺少的病理學(xué)要求是存在大量脯氨酸和微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域和截短側(cè)翼區(qū)。此外，tauons區(qū)別于正常人tau的方面可能在于其病理活性，即tauons代表啟動tau聚集和由正常tau和微管蛋白裝配的tauons解裝配微管的種子、即成核中心。與本發(fā)明抗體、尤其是DC-11族單克隆抗體一起預(yù)保溫的tauons沒有表現(xiàn)出解裝配的能力或由正常tau和微管蛋白裝配微管。此外，tauons在對分化的人神經(jīng)元微注射時(shí)明顯導(dǎo)致由微管結(jié)合的tau部分取代內(nèi)源性tau、神經(jīng)元收縮并使細(xì)胞變性。如果將tauons與本發(fā)明的單克隆抗體一起微注射，那么在分化的神經(jīng)元中沒有觀察到神經(jīng)變性改變。這一結(jié)果表明本發(fā)明的抗體、尤其是DC-11單克隆抗體抑制神經(jīng)元內(nèi)tauons活性，且由此可以用作胞內(nèi)藥物(例如用作胞內(nèi)治療抗體、即內(nèi)體(intrabodies))。在免疫組織學(xué)方面，正如使用本發(fā)明抗體所觀察到的，tauons已經(jīng)在AD的transenthorinal和enthorinal區(qū)中的前-a-神經(jīng)元內(nèi)的癥狀發(fā)生前I、II和III期出現(xiàn)，因此，在適當(dāng)偶聯(lián)示蹤物后，可以將本發(fā)明的抗體用于活體的AD癥狀發(fā)生前的診斷。優(yōu)選本發(fā)明的抗體與抗體DC-ll相比表現(xiàn)出對tau的構(gòu)象不同形式("tauon")至少50%、優(yōu)選至少90%的特異性?？梢酝ㄟ^任意用于檢測抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測特異性，例如ELISA試驗(yàn)、放射性免疫測定、使用懸臂連接的結(jié)合配偶體的原子力顯微術(shù)等。一般來說，與構(gòu)象不同的tau蛋白、尤其是其異常截短形式發(fā)生特異性反應(yīng)而不與正?？扇苄詔au反應(yīng)的所有抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。8優(yōu)選地，認(rèn)為本發(fā)明的抗體與分子發(fā)生〃特異性反應(yīng)〃，條件是它能夠與分子結(jié)合而由此使該分子與所述抗體偶聯(lián)。術(shù)語〃表位〃指的是可以由抗體識別和結(jié)合的抗原部分?？乖梢詭в幸粋€(gè)或一個(gè)以上的表位。〃抗原〃能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原表位的抗體。上述所指的特異性反應(yīng)指的是該抗原可以以高度選擇性方式與其相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，而不與由其它抗原產(chǎn)生的眾多其它抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明特別優(yōu)選的抗體來源于保藏的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll(ECACC保藏號00082216)和DC-11/1(ECACC保藏號00082215)，它們表現(xiàn)出高度特異性和選擇性，且與tau的構(gòu)象不同形式(〃tauon〃)反應(yīng)而不與正常的可溶性tau反應(yīng)。可以通過任意用于檢測抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測特異性，例如ELISA試驗(yàn)、放射性免疫測定等。本文所用的〃抗體〃用以指包括完整分子及其片段及其合成和生物衍生物，諸如例如不含F(xiàn)ab、F(ab')2和FY片段，游離或例如在pill或pVIII或其它表面蛋白上的絲狀噬菌體表面或細(xì)菌表面上表達(dá)，其能夠結(jié)合抗原。Fab、F(ab')2和Fv片段缺乏完整抗體的F。片段、從循環(huán)中更為快速地清除，且可以具有較低的非特異性抗體組織結(jié)合能力。此外，易于改造Fy抗體(通常稱作小抗體(minibody))以在其C-末端上攜帶特異性示蹤物，并用于AD的活體早期癥狀發(fā)生前診斷，這是因?yàn)橛杀景l(fā)明抗體識別的AD的I、II和III期與智力下降無關(guān)。在本發(fā)明中，優(yōu)選單克隆抗體或單克隆抗體片段。因此，本發(fā)明在另一個(gè)方面中還涉及產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本申請中所用的術(shù)語〃tau〃指的是如M.Goedert等1989所述的含有全部可選的剪接插入片段的人微管結(jié)合蛋白tau的最長同種型。按照本申請的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及屬于tau蛋白的構(gòu)象不同形式的tau蛋白的異常截短形式，所述的tau蛋白的構(gòu)象不同形式可由本發(fā)明的抗體特異性識別。因此，本發(fā)明涉及一族新的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性異常截短形式的tau蛋白，它們在構(gòu)象上不同于正常的tau且稱作"tauons"?！╰auons〃由此是可以由本發(fā)明所述抗體特異性識別的tau蛋白的構(gòu)象不同形式。用于本發(fā)明的tauons包括SEQIDNo.1的序列，且可以進(jìn)一步側(cè)翼接有其它氨基酸(參見SEQIDNo.2、3)。tauons適宜在約100-400個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，且在該范圍內(nèi)代表tau蛋白的截短形式。本發(fā)明的tauons可以在N-或C-末端或兩末端被異常截短(參見附圖2-13)。本文所用的術(shù)語〃異常截短的〃指的是用本發(fā)明提供的tauon特異性單克隆抗體在患病的AD神經(jīng)元中鑒定的tau肽("tauons"。可以通過使用許多任意眾所周知的合成重組技術(shù)來制備人tau蛋白的異常截短形式tauons.簡單地說，在本領(lǐng)域中廣泛實(shí)施了用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、構(gòu)建載體、提取信使RNA、制備cDNA文庫的大部分技術(shù)，且大部分本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知描述具體條件和步驟的標(biāo)準(zhǔn)來源資料。然而，為方便起見，將下面的段落用作指導(dǎo)原則。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的最常用原核生物系統(tǒng)為大腸桿菌(E.coli)，然而，也可以使用其它微生物菌抹，諸如芽孢桿菌屬(Bacilli),例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);假單胞菌屬(Pseudomonas)的不同種類；或其它細(xì)菌菌抹。在這類原核系統(tǒng)中，使用了含有來源于與宿主相容的種類的復(fù)制位點(diǎn)和控制序列的質(zhì)粒載體。常用的原核控制序列包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動子，可選的操縱子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。目前各種真核宿主也用于產(chǎn)生重組外源蛋白質(zhì)。當(dāng)在細(xì)菌中時(shí)，可以用直接產(chǎn)生所需蛋白的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化真核宿主，但更常見的情況是提供信號序列來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分泌。真核系統(tǒng)具有另外的優(yōu)點(diǎn)，即它們能夠加工可以在編碼高級生物體蛋白質(zhì)的基因組序列中出現(xiàn)的內(nèi)含子。真核系統(tǒng)還提供了各種加工機(jī)制，這些機(jī)制例如使某些氨基酸殘基糖基化、氧化或發(fā)生衍生作用、構(gòu)象控制等。常用的真核系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和高級植物細(xì)胞。所列實(shí)例并未窮盡。合適的啟動子是可得到的，它們對用于這些宿主類型中的每一種而言是相容性和可搡作的，且是終止序列和增強(qiáng)子，諸如例如桿狀病毒多角體啟動子。如上所述，啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。例如，在哺乳動物系統(tǒng)中，可以通過添加重金屬離子來誘導(dǎo)MTII啟動子。用于構(gòu)建適合于所需宿主的表達(dá)系統(tǒng)的具體實(shí)例對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。為了所述蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)，將編碼它的DNA適當(dāng)連入所選擇的表達(dá)系統(tǒng)，然后將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入相容的宿主細(xì)胞，隨后在發(fā)生外源基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)和維持該細(xì)胞。通過裂解該細(xì)胞或從培養(yǎng)基中回收這種方式產(chǎn)生的本發(fā)明tauons,這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？梢酝ㄟ^首先用連接混合物轉(zhuǎn)化適宜的宿主來證實(shí)用于質(zhì)粒構(gòu)建的正確連接。正如本領(lǐng)域中可理解的，用氨芐青霉素、四環(huán)素或其它抗生素抗性或使用其它標(biāo)記來篩選成功的轉(zhuǎn)化體，這取決于質(zhì)粒的構(gòu)建方式。本發(fā)明由此涉及tauons制品、尤其是基本上不含其它蛋白的來白人或重組來源的tauons制品、尤其是來自正常tau蛋白的tauons制品?？梢酝ㄟ^一定方法來提供這類制品，所述的方法包括使用本發(fā)明抗體進(jìn)行免疫親和的步驟。優(yōu)選本發(fā)明的制品在總蛋白中含有80%以上的ta讓s、尤其是95%以上的tauons。此外，本發(fā)明還涉及用于檢測阿爾茨海默病腦組織樣品或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式tauons的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的抗體和用于裝載所迷探針的適宜容器。能夠在試劑盒中提供所述抗體以用于檢測或分離tauons。借助于本發(fā)明抗體可以檢觀Jtauon蛋白，并從包括transenthoriiml、enthorinal區(qū)和海馬的阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元在內(nèi)的各種來源中分離它?？梢詫凑者@種方式分離的tauons進(jìn)一步用作例如對小鼠進(jìn)行免疫接種的免疫原，以便構(gòu)建產(chǎn)生針對tauons而不識別正常全長tau的特異性單克隆抗體的雜交瘤。該方法包括下列步驟筌定來自阿爾茨海默病態(tài)腦組織transenthorinal、enthorinal和海馬區(qū)的神經(jīng)元并使其釋放入防止tauons異常構(gòu)象的溶液中。在制備和純化后，將tauons用作免疫原，每隔一個(gè)月經(jīng)皮下注入小鼠。將來自這些動物的脾臟用于構(gòu)建產(chǎn)生針對tauons的單克隆抗體的雜交瘤。使用首先由K(ihler和Milstein介紹的充分建立的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)這些雜交瘤(參見M.K6hler和C.Milstein,"分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)"("ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPre-DefinedSpecificity〃)，《自然》(Nature)，256，pp.495-497,1975)。在足夠長時(shí)間的免疫接種后，從動物的脾臟、淋巴結(jié)或外周血液中得到產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞.優(yōu)選這些淋巴細(xì)胞獲自脾臟。然后通常在有諸如聚乙二醇(PEG)這樣的融合劑存在的情況下使脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將任意數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞系用作融合配偶體；例如P3-NS1/1-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞系。隨后使包含所需雜交瘤的所得細(xì)胞生長在諸如HAT培養(yǎng)基這樣的選擇培養(yǎng)基中，其中未融合的親本骨髓瘤或淋巴細(xì)胞最終死亡。僅雜交瘤細(xì)胞存活，且可以在限制條件下生長至得到分離的克隆。例如，通過使用已經(jīng)用于免疫接種的抗原的免疫測定技術(shù)篩選雜交瘤上清液中存在的具有所需特異性的抗體。然后在有限稀釋條件下或在軟瓊脂上亞克隆陽性克隆，且可以分離產(chǎn)生的單克隆抗體。可以使用本領(lǐng)域中所公知的技術(shù)使按照這些方法生產(chǎn)的雜交瘤在體外或體內(nèi)增殖(腹水中)。用于純化(purfying)單克隆抗體的常用方法包括硫酸銨沉淀、離子交換、層析法和親和層析法(例如，參見H.Zola等，"用于單克隆抗體產(chǎn)生和性質(zhì)鑒定的技術(shù)"("TechniquesfortheProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodies")-《單克隆雜交瘤抗體技術(shù)與應(yīng)用》(MonoclonalHybridomaAntibodies:TechniquesandApplications),J.G.R.Hurell(編輯),pp.51-52(CRCPress1982"。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所迷構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具。優(yōu)選次級抗體、尤其是特異性標(biāo)記的次級抗體。此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以使用磁珠技術(shù)以及應(yīng)用抗體的其它蛋白質(zhì)鑒定方法。該方法包括在來自人的測試樣品中筌定異常截短的tau蛋白tauon的步驟。本文所用的〃測試樣品〃指的是來自懷疑含有tauons的人的生物樣品。測試樣品可以包括含異常截短的tau蛋白的腦組織，諸如海馬組織或額皮質(zhì)組織；或所述的測試樣品可以包括腦脊液(CSF)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的測試樣品包括CSF,且所鑒定的蛋白是CSF-tauon。異常截短的tau蛋白tauons的鑒定適宜包括鑒定測試樣品中的抗原的步驟，該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1)，且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長度在約100-400個(gè)氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon的特異構(gòu)象；或該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1),且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長度在約100-400個(gè)氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon特異構(gòu)象。tauon的存在表明與AD患者和其它患tauo病(tauopathies)的患者體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病.本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及患者體液中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測方法，該方法包括下列步驟將所述體液與本發(fā)明的抗體混合、檢測所述抗體與構(gòu)象不同的tau蛋白(tauon)之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。tauon的存在表明包括AD和其它tauo病(tauopathies)在內(nèi)的疾病的人體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病。患者的體液可以是來自懷疑含有tauons的人的任意生物測試樣品。這種體液可以包括腦組織，諸如海馬組織或額組織或皮質(zhì)組織或腦脊液(CSF)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的體液包括CSF且所筌定的蛋白質(zhì)是CSF-tauons。正如本領(lǐng)域中可以理解的，可以通過生化或細(xì)胞化學(xué)方法或通過諸如許多免疫測定生產(chǎn)商的手冊中所迷的酶免疫測定法便利地完成這種對tauons的鑒定。當(dāng)使用生化方法時(shí)，優(yōu)選使用0.01-10g、尤其是0.5-1g的含有患病tau蛋白的組織；使其在凝膠上遷移并通過Western印記來鑒定。認(rèn)為這類技術(shù)確實(shí)適于在沒有已經(jīng)證實(shí)不與本發(fā)明抗體反應(yīng)的年齡匹配的對照組的情況下進(jìn)行。細(xì)胞化學(xué)方法染色已經(jīng)證實(shí)與正常組織無反應(yīng)性。通過ELISA檢測來自患AD的患者和患非-AD神經(jīng)性疾病以及正常受試者的CSF以便對tauons的水平進(jìn)行定量。與患非AD神經(jīng)性疾病的患者和對照組相比，AD患者體內(nèi)的CSFtauon水平顯著增加。在AD中，發(fā)現(xiàn)這種顯著增加與發(fā)作的年齡、載脂蛋白E基因型和臨床階段無關(guān)。對ADCSF蛋白的Western印記顯示了幾種具有與異常截短的tau蛋白一致的50-15kD的表觀分子量免疫反應(yīng)帶。這些結(jié)果表明CSF-tauons反映出由AD進(jìn)展導(dǎo)致的患病tau漸進(jìn)累積。本發(fā)明的抗體在另一個(gè)方面中可以用于制備治療阿爾茨海默病患者的藥物。可以將該抗體以生物技術(shù)方式修飾成裝配有耙向序列的單鏈分子，其能夠?qū)⑺龅姆肿愚D(zhuǎn)運(yùn)入表達(dá)tauons的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。在本AD細(xì)胞模型內(nèi)，抗體結(jié)合tauons并干擾其病理作用(正常tau的結(jié)合)，且增加tau蛋白的異常截短形式的降解。使用異常截短的tau蛋白及其與阿爾茨海默病嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行的體外試驗(yàn)(tau蛋白結(jié)合、纖絲裝配、微管解裝配)證實(shí)它們是重要的藥物把物。通過下列實(shí)施例和附圖來更具體地描述本發(fā)明，但它們不應(yīng)用來限制本發(fā)明。附圖l表示tauon制備的概述；附圖2表示tauon氨基酸序列的總示意圖附圖3表示最小tauon;附圖4表示C-末端截短的tauon;附圖5表示N-末端截短的tauon;附圖6表示tau的示意圖；附圖7表示人tau37;附圖8表示人tau39;附圖9表示人tau40;附圖10表示人tau43;附圖11表示人tau44;附圖12表示人tau46;且附圖13表示大鼠的大tau。實(shí)施例實(shí)施例1對tauons具有特異性的DC11族單克隆抗體的制備作為免疫接種用抗原的可溶性和不溶性tauons的制備(附圖1)為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(postmortemdelay)(PMD)的ADI.-III.Braak，s階段改變特征的人大腦。選擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁挑體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基(Gibco)中。將組織精細(xì)切碎并壓過150nm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個(gè)等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMp-巰基乙醇、5mMEGTA、ImMEDTA、5mMMgS04、5mM千脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5pg/ml亮抑酶肽、1.5ng/ml胃酶抑制劑和2pg/ffll抑酶肽中處理并在4"C下以25000xg離心35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時(shí)且然后對100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二辟u蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM笨甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時(shí)。通過以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇透析、且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級分離。使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用20ml線性梯度的NaCl(0-1M)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過Western印跡評價(jià)用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過真空離心蒸發(fā)濃縮(speedvacuum)設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個(gè)體積的冷緩沖液(IOmMTRIS，1mMEGTA，0.8MNaCl，10%蔗糖，pH7.4)中。在4t:下以27000xg離心30分鐘后，保留上清液并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來自兩次離心的27000xg上清液、調(diào)節(jié)至1%(wtArol)N-月桂?；“彼岷?%(vol/vol)p-巰基乙醇，并在37"C下的搖動器上保溫3小時(shí)。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補(bǔ)充了1%巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過0.45jim濾膜過濾。將濾液以35000rpm離心l小時(shí)。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2.5%甲酸萃取2分鐘，且然后以10000xg離心10分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。在4C下將上清液對pH7.4的10mMTris透析過夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液(級分II),并通過SDS-PAGE、隨后通過Western印跡評價(jià)。保留來自用2.5%甲酸萃取后含有不溶性tauons(級分III)的樣品B的沉淀并用于免疫接種和斑點(diǎn)試驗(yàn)。合并級分(I、II和III)中的Tauons，并用作對小鼠進(jìn)行免疫接種的抗原(參見附圖1)。產(chǎn)生DC-11族單克隆抗體的雜交瘤的制備將6周齡Balb/c小鼠分成3組(A,B，C)。使前2組(A，B)接觸溶于弗氏完全佐劑(Sigma)的50ng抗原，且間隔3周加強(qiáng)接種5次溶于弗氏不完全佐劑的50pg相同抗原(Ag)。在A組中，將所有劑量注入足墊，在B組中經(jīng)皮下給予Ag的劑量。對第3組小鼠僅將溶于PBS中的一個(gè)劑量直接注入脾(脾內(nèi)免疫接種)，并在該接觸抗原后的1周將脾用于融合。融合前3天時(shí)經(jīng)靜脈內(nèi)對A組和B組中的小鼠注射50jig溶于PBS的免疫原。按照Kontsekova等1988的方法使來自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞與NS/0骨髓瘤細(xì)胞融合。將108個(gè)脾細(xì)胞與2x107個(gè)NS/0骨髓瘤細(xì)胞混合(比例5:1)，并在補(bǔ)充了10%二甲亞砜的不含血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)內(nèi)的lml50%PEG1550(Serva)中融合1分鐘將融合的細(xì)胞以2.5x105個(gè)脾細(xì)胞/孔的密度重新懸浮于96-孔平板上的DMEM中，該DMEM含有20%馬血清、L-谷氨酰胺(2mM)、次黃嘌呤(O.1mM)、氨基蝶呤(0.004mM)、胸苷(0.016mM)和艮他霉素(40U/ml)'將細(xì)胞在37"C下保溫10天，并通過ELISA和免疫組織化學(xué)篩選用于產(chǎn)生抗-tauon特異性單克隆抗體的生長的雜交瘤。通過ELISA進(jìn)行抗ta謹(jǐn)s抗體篩選將ELISA用于檢測針對tauons的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體。使用如上所迷制備且具有下列改變的tauons作為固相。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳從級分中分離真空離心蒸發(fā)濃縮的合并物，并通過按照Donofrio等(1986)的方法經(jīng)電洗脫回收tau蛋白的截短形式，且通過SDS-PAGE評價(jià)。在4C下用異常截短的tau蛋白PBS溶液將微量滴定板包被過夜(10pg/ml，50pl/孔)。在用1%脫脂奶粉封閉以減少非特異性結(jié)合后，將該平板用PBS-0.05%TVeen20洗滌，并在37"下與50jil/孔的培養(yǎng)物上清液一起保溫1小時(shí)。用與辣根過氧化物酶(DAKO)綴合的綿羊抗小鼠Ig檢測結(jié)合的單克隆抗體。用鄰苯二胺溶液作為過氧化物酶底物使反應(yīng)顯色，并用50nl2MH2S04終止該反應(yīng)。使用MultiscanMCC/340ELISA讀出器(Labsystems)測定492nm處的吸收度。將至少兩倍于陰性對照值的讀取值看作是陽性的。按照Kontsekova等1991的步驟在軟瓊脂上進(jìn)一步亞克隆陽性培養(yǎng)物。重新篩選用于產(chǎn)生特異性抗-tauon單克隆抗體的分離的亞克隆?？箃auon抗體的免疫組織化學(xué)篩選如下在AD大腦組織上重新篩選在抗-tauonELISA中鑒定為陽性而對正常tau鑒定為陰性的單克隆抗體的特異性在冠狀板上將尸解時(shí)取出的AD患者的大腦切成lcin間隔的切片并儲存在-20X:下。將海馬、enthorinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4C的4%緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動切片機(jī)上切一系列額切片(50pm)并儲存在4"C下的PBS(pH7.0)中。用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機(jī)切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37"C下將切片與ELISA(如上所述)中陽性的單克隆抗體一起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)笨胺-4HC1(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含100^1H202的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello等，1993,Thorpe和Kerr,1994)。實(shí)施例2使用DC-11族單克隆抗體對異常截短的tau蛋白(tauons)進(jìn)行的定量測定如上所述分離tauons。單克隆抗體DC30(識別正常和病理性tau)與DC-11族單克隆抗體(對異常截短的tau具有特異性)的組合對由AD-大腦制備的測試樣品中的tauons進(jìn)行量化。通過蛋白質(zhì)A柱層析法從不含血清的培養(yǎng)基中純化抗體。在4K下用濃度為10ng/ml(50nl/孔)的DC-11單克隆抗體混合物的PBS溶液將高結(jié)合微量滴定板(Nunc)的孔包被過夜。通過加入200^11%的脫脂奶粉的磷酸緩沖鹽水(PBS)在室溫下60分鐘而將孔中的非特異性結(jié)合飽和。將該平板用PBS-0.05%Tween20(v/v)洗3次。加入含濃度為100-1000pg/ml的重組tauons的PBS液的連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和含有50jil用量的AD-tauons測試樣品。在37C下保溫60分鐘后，洗滌平板，并加入在PBS中1/5000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的抗體DC加(soni/孔)、在37X:下持續(xù)60分鐘。在最終的洗滌后，向各孔中加入50nl的鄰笨二胺溶液和0.003%H202，并將平板在黑暗中保溫20分鐘。用50jil的2MH2S04使反應(yīng)終止。用ELISA讀出器MultiscanMC344(Ubsystems,Finland)上讀取492nm處的吸收度。根據(jù)獲得的數(shù)值構(gòu)建重組tauons的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測試樣品中tauons的相應(yīng)濃度。實(shí)施例3通過Western印跡、使用單克隆抗體DC-ll檢測tauons。使純化的重組全長人tau和異常截短的tau蛋白tauons上樣5-2096梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠，并使其在Laemmli(1970)的變性條件下遷移。SDS-PAGE后，在pH12的10mMCAPS緩沖液中，將轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜(Milipore)上的步驟在350mA、冷卻下進(jìn)行1小時(shí)。印記后在PBS中洗滌該膜，并在室溫下用1%脫脂奶粉PBS液封閉1小時(shí)。將轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)與單克隆抗體DC-ll—起在4t:下保溫過夜。在用PBS-0.05%Tween20(v/v)洗滌后，使用按1/1000稀釋的用辣根過氧化物酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白并在室溫下保溫1小時(shí)。然后將該膜在PBS-Tween20中洗滌4次、用底物溶液(12mg4-氯-1-萘酚(naphtol)、4ml甲醇、16mlPB、0.03%v/v&02)使反應(yīng)顯色，并在H20中終止該反應(yīng)。結(jié)果表明抗體DC-11僅識別異常截短的tau即tauons,相反，單克隆抗體DC30是普遍識別所有已知來自許多種類(人、猴、牛、豬、大鼠、小鼠)的tau同種型的全tau抗體，而與其翻譯后修飾的狀態(tài)無關(guān)。實(shí)施例4tauons的免疫組織化學(xué)鑒定DC-ll族單克隆抗體適合于在不同類型免疫組織化學(xué)方法中使AD-大腦中的tauons顯色。光學(xué)顯微鏡標(biāo)記在冠狀板上將尸解時(shí)取出的患AD患者的大腦切成lcffl間隔的切片并儲存在-20"C下'將海馬、entorhinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4"C的4%緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動切片機(jī)上切一系列額切片(50nm)并儲存在4X:下的PBS(pH7.0)中。用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機(jī)切片預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37"C下將切片與單克隆抗體DC-ll—起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HC1(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含lOOfil&02的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。光學(xué)顯微鏡雙標(biāo)記用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機(jī)切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37TC下將切片與在封閉溶液(596馬血清、PBS、0.1%Triton)中按1:1000稀釋的第一種過氧化物酶綴合的單克隆抗體DC-11—起保溫60分鐘、在0.06%DAB、0.01%11202的PBS溶液(pH7.2)中展開。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)。在37TC下將相同切片與第二單克隆抗體一起保溫60分鐘在室溫下與生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和0.06%3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HC1(SIGMA)、0.01%H202、2.5%NiCl2(MERCK)的0.1M乙酸鹽緩沖液使免疫反應(yīng)顯色，并通過在0.1M乙酸鹽緩沖液中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello,1993)。使用快速甲酚紫(cresylviolet)進(jìn)行的復(fù)染在完成免疫組織化學(xué)染色后，將切片置于載玻片上并放入56C下的恒溫器中60分鐘。在保溫后將載玻片浸入蒸餾(destilled)水中5分鐘、在4r下用快速甲酚紫溶液染色5-10分鐘、用水沖洗并轉(zhuǎn)入96%乙醇，直到除去大部分甲酚紫染色、用二甲笨(xylen)凈化并用Entellan固定。免疫熒光染色用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機(jī)切片(30pm)預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。在37"C下將切片與第一種初級單克隆抗體DC-11—起保溫60分鐘，然后在室溫下與按照本領(lǐng)域中所用的標(biāo)準(zhǔn)方法與在PBS/Triton中按1:500稀釋的FITC-綴合的山羊抗體小鼠次級抗體(Immunotech)—起保溫30分鐘，在用PBS洗滌后，在37C下將切片與TRITC-綴合的初級抗體一起保溫60分鐘，并固定在0.1%對苯二胺/甘油溶液中實(shí)施例5使用tauons進(jìn)行的徵管裝配和微管結(jié)合試驗(yàn)微管蛋白純化通過溫度依賴性微管聚合與解聚循環(huán)、隨后通過磷酸纖維素(WatmanPll磷酸纖維素)離子交換層析法(Valee,1986)從自當(dāng)?shù)赝涝讖S獲得的鮮豬腦中分離微管蛋白。微管裝配試驗(yàn)在+4C下將純化的tauons(5mM)與預(yù)凈化的純化微管蛋白(10mM)和GTP(1mM)在裝配緩沖液(100mMPIPESpH6.9,2mMEGTA，1mMMgS04)中混合。該微管蛋白的濃度低于自發(fā)裝配的臨界濃度(Black,1987)。將樣品用移液管吸入預(yù)熱至37"C的石英池中。在熱穩(wěn)定控制的分光光度計(jì)(LKB)中以分光光度方式測定濁度的改變，并記錄為10s間隔的OD35。改變、持續(xù)30分鐘的期限。微管結(jié)合試驗(yàn)如上所述確定含微管的tauons的結(jié)合曲線(Gustke，1992)。在37"C下，在有GTP(1mM)和紫杉醇(20^M)存在的情況下，將純化的微管蛋白在結(jié)合緩沖液(IOOmMPIPESpH6.9、1mMEGTA、1mMMgS04、1mMDTT)中保溫10分鐘。用分別不干擾tauons或正常tau蛋白及其它MAPs結(jié)合的紫杉醇穩(wěn)定微管(Valee，1986;Wallis，1993),由此消除微管裝配的影響。加入濃度分別為2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM的Tauons。在37"下以43000xg離心35分鐘后，將沉淀重新懸浮于P緩沖液(50mMPIPESpH6.9、1mMEGTA、0.2mMMgCl2、5mMDTT、500mMNaCl)中。在SDS-PAGE凝膠上分析上清液與沉淀(Laemmli,1970)、用銀染色(Bloom,1987)。在HPScanJet(Hewlett-Packard)掃描儀上掃描凝膠，并應(yīng)用公共域NIHImage程序(美國國家健康研究所(U.S.NationalInstitutesofHealth)研發(fā)并可在國際互連網(wǎng)上獲得，網(wǎng)址http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)在Macintosh計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分析。使用內(nèi)標(biāo)法和校正曲線將帶強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成濃度。實(shí)施例6重組tauons的制備使用"EraseaBaseSystem"(Pro邁ega)、按照技術(shù)手冊制備tau蛋白的重組截短形式。該系統(tǒng)基于從5，突出端開始特異性消化插入DNA的外切核酸酶III。在恒溫下消化率是均勻的。通過Ndel-EcoRI限制位點(diǎn)將tau基因克隆入pET17b載體產(chǎn)生pET/T40向該基因的C-末端添加Kpnl限制位點(diǎn)和Kpnl位點(diǎn)的全部三個(gè)讀框下游中的三個(gè)終止密碼子。EcoRI酶留下5，突出端作為exoIII的底物。Kpnl留下耐exoIII消化的3'突出端。將用EcoRI、KpnI/NEB雙消化和乙醇沉淀的lpgpET/T40載體在20fUlxExoIII緩沖液中稀釋，并在37X:/消化率450個(gè)堿基/分鐘條件下用80uexoIII消化。在添加ExoIII后，就1份樣品而言，間隔30s將2.5ja1樣品轉(zhuǎn)入水上的7.5ja1Sl-核酸酶混合物/1.5uSl-核酸酶中。在室溫下將收集的樣品保溫30分鐘以除去剩余的單鏈尾。用KlenowDNA聚合酶形成鈍端。直接用樣品的連接混合物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過PstI-Xhol限制性酶切篩選亞克隆，并使用pET載體中T7-引物對合適的構(gòu)建體測序。重組tauons的表達(dá)、純化和定量在大腸桿菌BL21(DE3)(Studier，1986)中表達(dá)Tauons。將單細(xì)菌菌落接種入500ml的LBAMP(LB培養(yǎng)基，lOOpg/ml氨千青霉素)。使細(xì)菌培養(yǎng)物在37X:下的旋轉(zhuǎn)搖動器上生長，直到其0De。。達(dá)到0.6-0.8,然后通過添加IPTG(0.4mM終濃度)誘導(dǎo)。3小時(shí)后，通過在4"C下以5000g離心15分鐘使細(xì)菌細(xì)胞沉淀(Sigma6K15,轉(zhuǎn)子12500)，將細(xì)胞沉淀迅速冷凍在液氮中，且儲存在-70TC下至進(jìn)一步應(yīng)用為止。為了制備細(xì)胞裂解物，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于緩沖液A中(20mMPIPESpH6.9、50mMNaCl、1mMEGTA、1mMMgS04、2mMDTT、0.1niMPMSF)，通過在水上超聲處理6分鐘使細(xì)胞破碎，并通過在+2TC下以45000rpm離心15分鐘而除去細(xì)胞碎片(轉(zhuǎn)子TLA-120.2，BeckmamiOptimaTLX),通過0.22,濾膜(Millipore)過濾上清液，并立即在磷酸纖維素柱(磷酸纖維素WhatmanPll)上通過離子交換層析純化tauons。在使樣品上柱后，用10個(gè)床體積的緩沖液A洗滌該柱。用20ml線性梯度的NaCl(50mM-0.5M)緩沖液A洗脫Tauons。收集1ml級分，并在SDS-PAGE上鑒定含有蛋白質(zhì)的那些級分。合并含有tauons的級分，并在4匸下對PBS透析3x60分鐘。將來自透析液的等分部分真空干燥(SpeedVac)并儲存在-20iC下。通過PAGE、使用連續(xù)稀釋的牛血清白蛋白(BSA)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記對重組tauons進(jìn)行定量。用考馬斯藍(lán)染色凝膠、干燥并使用ScionImage(Beta3b,ScionCorp.)計(jì)算BSA和tau帶的強(qiáng)度。構(gòu)建BSA的校正曲線并用于對tauons定量。實(shí)施例7從人AD-大腦中分離tauons為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新的方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(PMD)的ADI.-III.Braak，s階段改變特征的人大腦。逸擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁糸fe體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基中(Gibco)。將組織精細(xì)切碎并壓過150nm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個(gè)等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMp-巰基乙醇、5mMEGTA、lmMEDTA、5mMMgS04、5mM節(jié)脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5ng/ml亮抑酶肽、1.5pg/ml胃酶抑制劑和2ng/ml抑酶肽中處理并在4"C下以25000xg離心35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時(shí)，且然后對100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二辟u蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM笨甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時(shí)。通過以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二疏蘇糖醇透析，且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級分離.使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用線性梯度的NaCl(O-lM)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過Western印跡評價(jià)用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個(gè)體積的冷緩沖液(IOmMTRIS,1mMEGTA,0.8MNaCl,10%蔗糖，pH7.4)中。在4tl下以27000xg離心30分鐘后,保留上清液，并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來自兩次27000xg離心的上清液、調(diào)節(jié)至1%(wt/vol)N-月桂酰基肌氨酸和1%(vol/vol)p-琉基乙醇，并在37TC下的搖動器上振動保溫3小時(shí)。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補(bǔ)充了1%巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過0.45nm濾膜過濾。將濾液以35000rpm離心1小時(shí)。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2,5%甲酸萃取2分鐘，然后以10000xg離心IO分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。將上清液對pH7.4的10mMTris在4t:下透析過夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液，并通過SDS-PAGE、隨后通過Western印跡評價(jià)。實(shí)施例8從人、豬和牛大腦組織中純化正常tau通過對Lindwall和Cole.,1984方法進(jìn)行修改的方法純化tau。將大腦組織(lmg/ml)在0.1mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEGTA、1MNaClpH6.5中勻化，并在4"C下以100000xg離心90分鐘。將上清液制成0.5%(v/v)2-巰基乙醇溶液、在100X:下加熱5分鐘并在4X:下以20000xg離心30分鐘。將該第二次的上清液制成45%的(NH4)2S04飽和溶液，且如上所述以20000xg離心，并將所得沉淀重新懸浮于不含NaCl的MES緩沖液中。在用2.5%(v/v)高氯酸沉淀并進(jìn)一步以20000xg離心后，將最終的上清液對pH7.4的5mMTris4C透析過夜。實(shí)施例9由tauons逐漸導(dǎo)致的正常tau結(jié)合和聚集成纖絲纏結(jié)將量逐漸增加的正常tau(5-100jig/100ul)與固定量的分離自級分I的(10ng/100ul)tauons混合。使該反應(yīng)在100ml終體積的結(jié)合緩沖液(含有2mMEGTA、2%牛血清白蛋白、0.5mMMgCl2、1jiM抑酶肽和20[iM亮抑酶肽的pH7.6的100mMMES)中進(jìn)行。在室溫下使該混合物發(fā)生相互作用45分鐘，然后置于150nl80%蔗糖結(jié)合緩沖液溶液，以100000xg離心1小時(shí)。除去上部的150pl，并對剩余部分超聲處理以便通過放射性免疫-斑點(diǎn)-印記測定法測定tauons與正常tau之間的相互作用。蔗糖層中存在tau表明tauon結(jié)合了健康的tau。實(shí)施例10DC-11族單克隆抗體抑制神經(jīng)元變性將神經(jīng)元母細(xì)胞瘤細(xì)胞和生長因子一式三份置于培養(yǎng)皿上。第一組僅接受ta,s,而第二組接受tauons和DC-ll單克隆抗體的混合物。用免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染的tauons在室溫下將細(xì)胞在含有80mMPIPES、1mMMgCl2、1mMEGTA，pH6.6的0.2%TritonX100中透化5分鐘。在相同緩沖液中用2%低聚甲醛將細(xì)胞水上固定15分鐘。通過間接免疫熒光抗生物素蛋白羅丹明檢測系統(tǒng)(Sigma)檢測Tauons。神經(jīng)元分化早期抑制的檢測使細(xì)胞與分化誘導(dǎo)因子一起生長。評價(jià)分化水平。帶有tauons而不含抗體的該組細(xì)胞具有的分化能力顯著下降。然而，用tauons和抗體混合物處理的組分化至與來自用無關(guān)蛋白處理的對照組的細(xì)胞相差無幾的水平。本發(fā)明進(jìn)一步如下進(jìn)行描述1.對構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對正常tau蛋白是非特異的。2.段落1的抗體，該抗體來源于在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll和DC-11/I。3.段落1或2的抗體，該抗體與由所述在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體相比，對所述tau的構(gòu)象上不同形式具有至少50%的特異性，尤其是具有至少90%的特異性。4.段落l-3中任意一項(xiàng)的抗體，其特征在于它是合成抗體。5.產(chǎn)生段落l-4中任意一項(xiàng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。6.構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式，所述tau蛋白的構(gòu)象上不同形式可由段落1-4中任意一項(xiàng)的抗體特異性識別。7.段落6的tau蛋白形式，其特征在于該蛋白質(zhì)與正常tau相比在N-末端或C-末端或兩末端上被異常截短，且所述的tau蛋白形式至少包括正常tau蛋白質(zhì)序列中的100個(gè)氨基酸-400個(gè)氨基酸。8.用于檢測或分離腦組織或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的試劑盒，該試劑盒包括段落1-4中任意一項(xiàng)的抗體和用于裝載探針的適宜容器。9.段落8的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具，優(yōu)選二抗，尤其是特異性標(biāo)記的二抗。10.段落8或9的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于對所述構(gòu)象不同的tau蛋白定量的工具，尤其是構(gòu)象不同的tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)制-口011.患者腦組織或體液中構(gòu)象不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測方法，該方法包括下列步驟將所述的體液與段落1-4中任意一項(xiàng)的抗體混合，檢測所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。12.段落1-4中任意一項(xiàng)的抗體在制備用于治療阿爾茨海默病患者的藥物中的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)BlackMM(1987)Comparisonoftheeffectsofmicrotubule-associatedprotein2andtauon也epackingdensityofinvitroassembledmicrotubulesProcNatlAcadSciUSA84:7783-7787BlessedG，TomlisonBE,RothM(1968)Theassociationbetweenqualitativemeasauresofdementiaandsenilechangeincerebralgreymatterofelderlysubjects.BrJPsychiatry114:797-811.BloomH，BeierH,GrossHS(1987)Improvedsilverstainingofplantproteins,RNAandDNAinpolyacrylamidegels.Electrophoresis8:93-99.ClevelandDW,HwoSY，KirschnerMW(1977a)Ps>^icalandchemicalpropertiesofpurifiedtaufactorandtheroleoftauinmicrotubuleassembly.JMolBiol116:227-247ClevelandDW,HwoSYKirschnerMW(1977b)Purificationoftauamicrotubule-associatedprotein也atinducesassemblyofmicrotubulesfrompurifiedtubulin.JMolBiol1.16:207-225CrowtherRA^OlesenOF，SmithMJ，JakesRGoedertM(1994)AssemblyofAlzheimer-likefilamentsfromfoll-lengthtauprotein.FEBSLetter337:135-138CuelloAC,Cot6SL,Ribeiro-Da-SilvaA(1993):Currentprotocolsforlightmicroscopyimmunohistochemistry.ImmunohistochemistrynJohnWileyandsonsCichester，148-167.DicksonDW，F(xiàn)eanyMB,YenS-H，MattiaceLA;DaviesP(1998)Cytoskeletalpathologyin加n-Alzheimerdegener-ativedementia:newlesionsindiffiiseLewybodydisease,Pick'sdisease,andcorticobasaldegeneration.JNeuralTransm47:31~46DiFigliaM，SappE，ChaseKO，DaviesSW，BatesGP，VonsattelJP,AroninN(1997)Aggregationofhuntingtiiiinneuronalintra-加clearinclusionsanddystrophicneuritesinbraiiijScience277:1990-1993DonofrioJC，CoonrodJD，KarathanasisV，CoelinghKV(1986)ElectroelutionforpurificationofinfluenzaAmatrixproteinforuseinimmunoassay.13:107-120DrewesG，EbnethA,MandelkowEM(1998)MAPsMARKsandmicrotubuledynamics.TrendsBiochemSci23:307-311DrubinDG，KirschnerMW(1986)Tauproteinfonctioninlivingcells.JCellBiol103:2739-2746FomoLS(1986)TheLewybodyinParkinson'sdisease,In:YahrMD，BergmannKJ(eds)Paridnson'sDisease,AdvancesinNeurology,Vol.45，RavenPress:NewYorkpp.35~43GoedertM，SpillantiniMG，JakesRRutherfordD，CrowtherRA(1989)Multipleisofonnsofhumanmicrotubule~associatedproteintau:sequencesandlocalizationinNeurofibrillarytanglesofAlzheimer^disease.Neuron3:519-526GoedertM,JakesRjSpillantiniM，HasegawaM，Sm他MJ，CrowtherRA(1996)Assemblyofmicrotubul^associatedproteintauintoAlzheimerlikefilamentsinducedbysulfatedglycosaminoglyc咖.Nature383:550-553GreenbergSH，DaviesP(1990)ApreparationofAlzheimerpairedhelicalfilamentsthatdisplaysdistincttauproteinsbypolyacrylamidegelelectrophoresis.ProcNatl_A^adSciUSA87:5827-5831GrandkeJqbalIIqbalKTungY-C,Quinl旭MWisniewsidHM，BinderLI.(1986)AbnormalphosphoiylationofthemicrotubuleassociatedproteintauinAMieimercytoskeletalpathology.ProcNatlAcadSciUSA83:4913-17.GustkeN，SteinerB,MandelkowEM,BiematJ，MeyerHE，GoedertM，MandelkowE(1992)TheAlzheimer-likephosphorylationoftauproteinreducesmicrotubulebindingandinvolvesSer-ProandThr-Promotifs.FEBSLett307:199-205.HimmerA(1989)Structureofthebovinetaugene:alternativelysplicedtranscriptsgeneratesaproteinfamily.MolCellBiol9:1389-1396HiranoA,ZimmermanHM(1962)Alzheimer'sneurofibrillarychanges.ArchNeurol7:73-88KampersT，F(xiàn)riedhoffP，BiernatJ，MandelkowEMMandelkowE(1996)RNAstimulatesaggregationofmicrotubule-associatedproteintauintoAlzheimer-likepairedhelicalfilaments.FEBSLett399:344-349Kenessey入YenS-H，LiuW長YangX-民DunlopDS(1995)DetectionofD-鄉(xiāng)artateintauproteinsassociatedwithAlzheimerpairedhelicalfilaments.BrainRes675:183-189KissAPalkovitsM，SkirbollLR(1988)Lightmicroscopictriple-coloredimmunohistodiemicalstainingonthesamevibratomesectionusingtheavidin-biotin-peroxidasecomplextechnique.Histochem88:353-356KopkeE，TungY-ChShaikhS，AlonsoAC,IqbalGrundkeJqbalI(1993)Microtubule-associatedproteintauabnormalphosphorylationofanon-pairedhelicalfilamentpoolinAlzheimerdisease,JBiolChem268:24374-24384Kontsekov4E,NovdkM，KontsekP，Bornck^L，LessoJ.(l訴8)TheeffectofpostfUsioncelldensityonestablishmentofhybridomas.FoliaBiol(Praque)34:18-22KontsekoviE，Nov能M，Mdcikov反I，KontsekP.(1991)One-stepmethodforestablishing8-azaguanine-resistanthybridomassuitablefor也epreparationoftrioiruis,JImmunolMethods145:247-250KosikKS，OrecchioLD,BakalisS，NeveRL(1989)Developmentallyregulatedexpressionofspecifictausequence.Neuron2:1389-1397Ksiezak-RedingHYangG，SimonM,WallJS(19訴)Assembledtaufilam幼tsdifferfromnativepairedhelicalfilamentsasdeterminedbyscanningtransmissionelectronmicroscopySTEM,BrainRes.814:86-98.LaemmliUK(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685LindwallG，ColeRD(1984)ThepurifictionoftauproteinandtheOccurrenceoftwophosphorylationstatesoftauinbrain.JBiolChem:259:12241-12245KoLW,KoEC,NacharajuP，Liu,ChangE，Kenesse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AlaAlaAlaGinProHisThrGlu859095lieProGluGlyThrThrAlaGluGj_uAlaGlylieGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAsp'GluAlaAlaGlyHi$ValThrGinAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAsp.GlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly13'0135140AlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160.GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLy6.ThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180185i90AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer.ProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys2102152.20LysValAlaValValArgTh'rProProLysSerProSer.SerAlaLys225230235240SerArgLeuGinThrAlaProValProMetProAspLeu'LysAsnVal24525tt25535<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>505560Pro.GlyGlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArg65707580.GluAsriAlaLys'AlaLys'ThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLys85■.9095SerProValVal.SerGly-Asp-ThrSerProArgHisLeuSerAsnVal100105110SerSerThrGly5erlieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThr115120'125LeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu130135140<2;0>'4<211>381<212>PRT<213>人類<400>.4.MetA^aGluProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAla|Gly15-1015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyxThrMetHis2025■-30GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGly.LeuLysGl'uSerProLeu.354045Gin.ThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer5055.60AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlylieGly6570—-■"7580Asp'ThrPro.SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAla859095ArgMetVal.SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110.AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAla11512012'5AlaProPro.GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAla130135140LysThrProProAlaProLys—ThrProProSerSerGlyGluProPro-145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys'SerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGinThr—AlaProValProMetProAspLeu210.215220LysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGin22523023540ProGlyGlyGlyLysValGinlieValTyrLysProValAspLeu.Sei:245250255LysValThrSerLjrsCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysPro■260265270GlyGlyGlyGinValGluValLys.SerGluLysLeuAspPheLysAsp275280285ArgValGinSertyslieGlySerLeuAspAsnlieThrHisValPro290295300GlyGlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGlu305310315320AsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSer325330335ProValValSerGlyAspThrSerProAtgHisLeuSerAsnValSer340345350SerThrGlySeflieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeu355360365AlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu37037&'380'<210>5<211>410<212>PRT<213>人類<400>5MetAlaGluProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GinThrProThrGluAspGly.$erGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProTh^AlaGluAspValThrAlaProLeuVal.65707580Asp(SluGlyAlaProGlyLysGinAlaAlaAlaGinProHisThrGlu859095lieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlylieGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAlaArgMetVal115120125SerLysSprLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135"0AlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAlaA^aProPro145150155160GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGly'GluProProLysSerGly180185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200.205ArgSerArgT"hrProSerLe'uProTl^rProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSer'AlaLys225230235240SerArgLeuGinThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuIiysHisGinProGlyGly260'265270GlyLysValGinlieValTyrLy.sProValAspLeuSerLysValThr275280285SerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGlyGlyGly290295300GinValGluValLysSerGluLysleuAspPheLysAspArgValGin305310315320Ser'LyslieGlySerL_euAspAsnlieThrHisValProGly<31y'Gly325.330335AsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsnAlaLys'340345350AlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSerProValVal355360365SerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGly370375380SerlieAspMetValAspSerProGinl>euAlaThrLeuAlaAspGlu3.85390395400ValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu405410<210>6<211>441<212>PRT<213>人類<400>6MetAlaGluProArgGinGluPh&GluValMetGluAspHisAlaGly151615ThriyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGibGlyGlVTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSer^roLeu354045GinThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560Asp-AlaLysSerThrProThrAlaGluAspValThrAlaProLeuVal65707580AspGluGlyAlaProGlyLysGinAlaAlaAlaGinProHisThrGlu859095lieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlylieGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135140AlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180.185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSerAlaLys225230235240SerArgLeuGinThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGinPjcoGlyGly260265270GlyLysValGinlielieAsnLy'sLysLeuAspLeuSerAsnValGin275280285SerLysCysGlySerLysAspAsnlieLysHisValProGiyGlyGly290-295300SerValGinlieValTyrLysProValAspLeuSerLysValThrSer305310315320LysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGlyGlyGlyGin325330335ValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArgValGinSer340345350LyslieGlySerLeu'AspAsnlieThrHisValProGlyGlyGlyAsn355360365LysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGlu'AsnAlaLybAla370375380LypThrAspHisGlyAla'GlulieValTyrLysSerPro.ValValSer385390395400GlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGlySer405410415lieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeuAlaAspGluVal420425430SerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu435440<210>7<211>383<212>PRT<213>人類<400>7MetAlaG'luProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly15.1015ThrTyrGlyL>euGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGiuGlyAspThrAspAlaGlyI<euLysAlaGluGluAla35.404SGlylieGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal505560ThrGinAlaArgMetValSerLys6570lieProAlaLysThrProProAla115120SerLysAs^>GlyThrGlySerAsp7580LyslieAlaThrPro95AlaAsnAlaThrArg110ProLysThrProProSerSerGly125AspLysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThr8590ArgGlyAlaAlaProProGlyGinLysGlyGin100105GluProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer130135"0ProGlyTip:ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro"5150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArglieuGinThrAlaProValProMet180185190Pr)AspLeuLysAsnValLysSer.LyslieGlySerThrGluAsnLeu195200205LysHisGinProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeu210215220AspLeuSerAsnValGinSerLysCysGlySerLysAspAsnlieLys225230235240HisValProGlyGlyGlySerValGinlieValTyrLysProValAsp245250255LeuSerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHis260265270LysPyoGlyGlyGlyGinValGluValLysSerGluLyslieuAspPhe275280285LysAspArgValGinSerLyslieGlf-SerLeuAspAsnlieThrHis29029'5300ValProGiyGlyGlyAsnLysI*ys305310ArgGluAsn,AlaLys-AlaLysThf.325LysSerProValValSerGlyAsp340ValSerSerThrGlySerlieAsp355360ThrLeuAlaAspGluValSerAla370375lieGluThrHisLysLeuThrPhe315320AspHisGlyAlaGlulie/alTyr330335ThrSerProArgHisLeu.SerAsn345350MetValAspSerProGinLeuAla365SerLeuAlaLysGinGlyLeu380<210>8<211>35.2<212>PRT<213>人類<400>8MetAla<31u'ProArgGinGluPheGluValM^.tGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysAlaGluGluAla354045GlylieGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal50S560ThrGl'nAlaArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAsp65707580Asp'LysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrPro859095ArgGlyAlaAlaProProGlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArg100105110lieProAlaLysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGly115120125<51uProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer13013514ttProGlyThrProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro145150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrPro.ProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArgLeuGinThrAlaProValProMet180185190ProAspLeuLysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeu1^5200205LysHisGinProGlyGlyGlyLysValGinlieValTyrLysProVal210215220AspteuSerLysValThrSer.LysCysGlySerLeuGlyAsnlieHis225230235240.His'LysProGly.Gly.GlyGinValGluValLys'SerGiuLysLeuAsp245250255PheLysAspArgValGinSerLyslieGlySerLeuAspAsnlieThr'260265270HisValProGlyGlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThr275280285PheArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieVal29029.5300TyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSer305310315320AsnValSerSerThrGlySerlieAspMetValAspSerProGinLeu325330335AlaThrLeuAlaAspGluValSer'AlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu34i)345350<210>9<211>412<212>PRT<213>人類<400>9MetAlaGluProArgGin5GluPheGluVal'Met10GluAspHisAlaGly15ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GinThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlylieGly65707580AspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAla859095ArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAla115120125AlaProProGlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAla-130135140LysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProPro145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLy.sLysValAlaValValArgThrProProLysSerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGJLnThrAlaProValProMetProAspLeu210215220LysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGin225230235240ProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeuAspLeuSerAsnValGinSerLysCysGlySer"LysAspAsnlieLysHisValPro260265270GlyGlyGlyS^rVal'GinlieValTyrLysProValAspLeuSerLys275280285ValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGly290295300GlyGlyGinValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArg305310315320ValGinSerLyslieGlySerLeuAspAsnlieThrHisValProGly325330335GlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArg(lu'Asn■3-0345350AlaLysAliLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSerPro355360365ValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnVal'SerSer370375380ThrGlySerlieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeuAla385330395400AspGluVal'SerAlaSer'LeuAlaLysGinGlyLeu405410<210>10<211>686<212>PRT<213>大鼠<400>10MetAlaGluProArgGinGluPheAspThrMetGluAspGinAlaGly151015AspTyrThrMet-LeuGinAspGinGluGlyAspMetAspHisGly-Leu20.2530LysGluSerProProGinProProAlaAspAspGlySerGluGluPro354045GlySerGluThrSerAspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspVal505560ThrAlaProLeuValGluGluArgAlaProAspLysGinAlaThrAla65707580GinSerHisThrGlulieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGly859095lieGlyAspThrProAsnMetGluAspGinAlaAlaGlyHisyalThr100105110GinGluProGinLysValGlulie.PheSerGinSerLeuLeuValGlu115120125ProGlyArgArgGluGlyGinAlaProAspSerGlylieSerAspTrp130135140ThrHisGinGinValProSerMetSerGlyAlaProLeuProProGin"5150155160GlyLeuArgGluAlaThrH'isGinProLeuGlyThrArgProGluAsp165170175ValGluArgSerHisProAlaSer.GluLeuLeuTrpGinGluSerPro180185190GinLysGluAlaTrpGlyLysAspArgLeuGlySerGluGluGluVal195200205AspGluAsplieThrMetAspGluSerSerGinGluSerProProSer21<j215220GinAlaSerLeuAlaProGlyThrAlaThrProGinAlaArgSerVal225230235240SerAlaSerGlyValSerGlyGluThrThrSerlieProGlyPhePro245250255AlaGluGlySerlieProLeuProAlaAspPhePheSerLysValSer260265270AlaGluThrGinAlaSerProProGluGlyProGlyThrGlyProSer275'280285GluGluGlyHisGluAlaAlaProGluPheThrPheHisValGlulie29029'5300LysAlaSerAlaProLysGluGinAspLeuGluGlyAlaThrValVal305310315320GlyAlaProAlaGlu.GluGinLysAlaArgGlyProSerValGlyLys325330335GlyThrLysGluAlaSerLeuLeuGluProThrAspLysGinProAla340345350AlaGlyLeuProGlyArgProValSerArgValProGinLeuLysAla355360365ArgValAlaGlyValSerLysAspArgThrGlyAsnAspGluLys.Lys370375380AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrGlyAlaLyslieAlaThrPro-Arg385390395400GlyAlaAlaThr.ProGlyGinLysGlyThrSerAsnAlaThrArglie4.0$410415ProAlaLysThrThrProSerProLysThrProProGlySerGlyGlu420425'430ProProLysSerGlyGluArgSerGlyTyrSer^erProGlySerPro435440445GlyThrProGlySerArgSerArgThrProSe;:LeuProThrProPro450455460ThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLysSer465470475480ProSerAlaSerLysSerArgLeuGinThrAlaProValProMetPro485490495AspLeuLysAsnValArgSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLys500505510HisGinProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeuAsp515520'525LeuSerAsnValGinSerLysCysGlySerLysAspAsnlie'LysHis530535540ValProGlyGlyGlySerValHislieValTyrLysProValAspLeu545550555560SerLysValThrSerLysCysGly565'ProGlyGlyGlyGinVal.GluVal580AspArgValGinSerLy.slieGly595600ProGlyGlyGlyAsnLysLyslie610615SerLeu(SlyAsnlieHisHisLys570575LiysSerGluLysI*euAspPheLys585590SerLeuAspAsnlieThrHisVal605GluThrHisLy6LeuThrPheArg620GluAsnAlaLysAlaLysThrAsp625630SerProValValSerGlyAspThr645SerSerThrGlySerlieAspl^et660LeuAlaAspGluValSerAlaSer675680HisGlyAlaGlulieValTyrLys635.640SerProArgHisLeuSerAsnVal650655ValAspSerProGinLeuAlaThr665670LeuAlaLysGinGlyLeu68權(quán)利要求1.對在N-末端上或在N-和C-末端兩者上被截短的人tau蛋白的截短形式具有特異性的抗體，所述截短形式通過與由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11或DC-11/I產(chǎn)生的抗體結(jié)合而在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau，并且所述截短形式至少包括由441個(gè)氨基酸組成的最長人tau同種型中的第300位氨基酸到第400位氨基酸殘基，所述抗體不與正常tau蛋白結(jié)合，并且所述抗體對所述人tau蛋白的截短形式是特異性的。2.權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，所述抗體對所述人tau蛋白的截短形式的特異性依賴于所述人tau蛋白的磷酸化水平。3.由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和保藏號00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體。4.產(chǎn)生權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。5.在N-末端上或在N-和C-末端兩者上被截短的人tau蛋白的截短形式，所述截短形式通過與由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體結(jié)合而在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau。6.權(quán)利要求5的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式通過其作為用于啟動tau聚集的成核中心的能力而進(jìn)一步區(qū)別于正常人tau。7.權(quán)利要求5或6的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式通過其從正常人tau中解裝配微管的能力而進(jìn)一步區(qū)別于正常人tau。8.權(quán)利要求5-7的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式至少包括由441個(gè)氨基酸組成的最長人tau同種型中的第300位氨基酸到第400位氨基酸殘基。9.用于檢測或分離腦組織或體液樣品中權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的人tau蛋白的截短形式的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的抗體和用于裝載所述樣品的適宜容器。10.權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于，它進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所述人tau蛋白的截短形式之間結(jié)合情況的工具，其優(yōu)選地是二抗，特別是被特異性標(biāo)記的二抗。11.權(quán)利要求9或10的試劑盒，其特征在于，它進(jìn)一步含有用于對所述人tau蛋白的截短形式定量的工具，其特別是所述人tau蛋白的截短形式的標(biāo)準(zhǔn)制品。12.患者腦組織或體液樣品中權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的人tau蛋白的截短形式的體外檢測方法，該方法包括下列步驟將所述樣品與權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體混合，檢測所述抗體與所述人tau蛋白的截短形式之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的所述人tau蛋白的截短形式的量。13.權(quán)利要求1-3的抗體在制備用于治療阿爾茨海默病患者的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及對在構(gòu)象上不同于正常tau且不與正常tau蛋白結(jié)合的異常截短形式的tau蛋白具有特異性的抗體、在構(gòu)象上不同的tau蛋白(“tauons”)和與阿爾茨海默病和相關(guān)tauo病(tauopathies)有關(guān)的診斷和治療方面。文檔編號G01N33/53GK101307107SQ20081010815公開日2008年11月19日申請日期2002年1月29日優(yōu)先權(quán)日2001年2月2日發(fā)明者M(jìn)·諾瓦克申請人:阿克松神經(jīng)科學(xué)研究和發(fā)展股份有限公司