專利名稱：表達(dá)阿耳茨海默氏tau蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的制作方法
神經(jīng)變性疾病是一組異類的遺傳性和獲得性神經(jīng)學(xué)疾病，導(dǎo)致嚴(yán)重的和進(jìn)行性的認(rèn)知和運(yùn)動損傷，在中年和老年發(fā)作(1)。癡呆的最常見原因是阿耳茨海默氏病。在少于5％的病例中涉及阿耳茨海默氏病遺傳因子，其余病例是散發(fā)性的。
tau蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)，而且通過穩(wěn)定胞內(nèi)微管網(wǎng)絡(luò)而在神經(jīng)元構(gòu)造中發(fā)揮關(guān)鍵作用。截短、超磷酸化、或六種天然存在tau同種型(isoform)之間平衡的破壞對tau蛋白生理學(xué)作用的損害導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle)(NFT)、營養(yǎng)不良神經(jīng)突、和神經(jīng)纖維絲(neuropil thread)的形成。這些結(jié)構(gòu)是阿耳茨海默氏病的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)亞基是與微管相關(guān)蛋白tau(2、3)。在AD患者尸檢中發(fā)現(xiàn)的NFT數(shù)量與包括智力衰退在內(nèi)的臨床癥狀有關(guān)。因此，tau蛋白在AD病理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于tau基因中特定突變和與17號染色體連鎖的帕金森氏病額顳癡呆疾病(FTDP-17)的共分離的最近發(fā)現(xiàn)證實(shí)了tau蛋白中的某些異常可能是患病個體中神經(jīng)變性和癡呆的主要原因(4、5)。然而，沒有實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蛑苯犹岢鲫P(guān)于tau蛋白在AD發(fā)病機(jī)理中的作用的細(xì)節(jié)。
最近的AD轉(zhuǎn)基因模型是基于發(fā)生或未發(fā)生突變的與FAD(APP、PS1、ApoE等)有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。它們包括單基因和多基因人化動物。然而，沒有哪個模型能夠再現(xiàn)AD的這兩種特點(diǎn)，它們通常不顯示神經(jīng)原纖維病理，而且都不具有研究環(huán)境致病因素的功能的可能性，而它們在AD的發(fā)展中發(fā)揮主要作用。
最近得到的顯示有些神經(jīng)原纖維變化的動物模型只是基于衍生自與第17號染色體連鎖的額顳癡呆(FTDP17)的突變型tau的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這一類的典型范例是JNPL3轉(zhuǎn)基因小鼠(6)。最近，Goedert和Spillantini(7)發(fā)表了關(guān)于突變型tau作用的另一項(xiàng)證據(jù)。
在另一個轉(zhuǎn)基因動物模型中，研究了含四重復(fù)的tau蛋白的過度表達(dá)。報(bào)道了大腦和脊髓中的突出軸突病理學(xué)(axonopathy)，而且顯示含四重復(fù)的tau蛋白同種型的過度表達(dá)足以改變神經(jīng)元生理學(xué)。在該模型中，證明了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中軸突擴(kuò)張及神經(jīng)原纖維積累，然而沒有神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成(8)。
還可以為了檢驗(yàn)tau的正常細(xì)胞功能及其在發(fā)病機(jī)理中的作用而生成轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)基因組tau轉(zhuǎn)基因，還有taucDNA轉(zhuǎn)基因。兩種模型的比較顯示了tau的分布在兩種轉(zhuǎn)基因系中是相似的。在cDNA小鼠脊髓中發(fā)現(xiàn)tau免疫反應(yīng)性軸突膨脹，這與后肢異常有關(guān)，而在基因組小鼠中沒有觀察到神經(jīng)病理學(xué)(9)。
盡管大鼠作為神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖鄬τ谛∈蟮膬?yōu)點(diǎn)，令人驚訝的是尚未生成神經(jīng)原纖維病理學(xué)的tau轉(zhuǎn)基因模型。一般而言，至今生成的神經(jīng)變性的轉(zhuǎn)基因大鼠模型的數(shù)量相當(dāng)?shù)?。它們都不能概述tau病理學(xué)，而它對于AD而言是典型的。
Czech C等人(12)描述了在編碼早衰素(presenilin)1(PS1)的基因中包含突變的轉(zhuǎn)基因大鼠模型。PS1被認(rèn)為是大多數(shù)家族性阿耳茨海默氏病早期發(fā)作病例的原因，然而已發(fā)表的模型未顯示AD相關(guān)病理學(xué)的足夠病征。Echeverria V和Cuello AC(13)評論了β-淀粉狀蛋白胞內(nèi)積累的作用和胞內(nèi)β-淀粉狀蛋白積累在阿耳茨海默氏病中的可能神經(jīng)病理學(xué)作用。他們提出了來自海馬和皮層的神經(jīng)元中具有A-β-片段胞內(nèi)積累的表型但無斑和NFT形成的大鼠轉(zhuǎn)基因模型的觀察結(jié)果。因此，對于在轉(zhuǎn)基因研究中第二最常用的動物大鼠，情況與小鼠相同科學(xué)文獻(xiàn)中尚未描述表達(dá)截短tau蛋白并顯示NFT形成的轉(zhuǎn)基因大鼠。
至今尚無可用于研究結(jié)合與AD有關(guān)的高血壓或其它致病因素像糖尿病和異常脂血癥(dislipidemia)的AD的病因?qū)W的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)基因動物的遺傳背景在合適轉(zhuǎn)基因模型的開發(fā)中發(fā)揮作用。
眾所周知AD與某些環(huán)境致病因素有關(guān)。流行病學(xué)研究顯示，血管病和中風(fēng)的致病因素與認(rèn)知損傷和阿耳茨海默氏病有關(guān)；此外，腦血管病的存在強(qiáng)化了阿耳茨海默氏病臨床癥狀的存在和嚴(yán)重性(14)。Rotterdam研究(15)指出了高血壓與AD型癡呆之間的聯(lián)系。
因此，重要的是要開發(fā)AD的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，它將模擬疾病的主要病理學(xué)特征，同時能夠表達(dá)與AD病因?qū)W有關(guān)的環(huán)境因素。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供盡可能貼切的反映AD特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停€有用于治療、預(yù)防、和診斷AD的物質(zhì)的測定系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因動物大腦中表達(dá)編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的cDNA的轉(zhuǎn)基因非人動物。這些動物在大腦中表現(xiàn)有NF病理學(xué)活性。本發(fā)明還涉及可以作為篩選測定系統(tǒng)用于鑒定改進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶、抑制神經(jīng)變性和降低大腦中神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的形成和清除速率的物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。這些動物可用于鑒定用于預(yù)防、治療、和診斷神經(jīng)變性疾病的物質(zhì)，優(yōu)選tau病理(tauopathy)和AD。轉(zhuǎn)基因動物還可用于研究AD相關(guān)致病因素對AD發(fā)展的影響。這些動物的另一種用途在于藥物靶的鑒定。
本發(fā)明描述了通過特定轉(zhuǎn)基因誘發(fā)AD變化的轉(zhuǎn)基因動物的遺傳工程，類似這些動物中的阿耳茨海默氏病。這為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)藥物和診斷方法以及進(jìn)一步研究正常和患病tau蛋白的體內(nèi)作用提供了研究工具。
本發(fā)明依賴僅僅通過在轉(zhuǎn)基因動物大腦中表達(dá)阿耳茨海默氏tau蛋白而在動物大腦中誘發(fā)NF病理學(xué)活性。這些動物具有AD的特點(diǎn)，傾向于誘發(fā)與AD病因?qū)W有關(guān)的致病因素，這是本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)。
除非特別說明，優(yōu)選實(shí)施方案的描述中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的通常理解相同的含義。本發(fā)明描述了細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、和核酸化學(xué)的優(yōu)選方法、實(shí)驗(yàn)流程、和材料，但是本發(fā)明的測試中可以使用相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧稀τ谙裰亟M核酸制備、生化分析、細(xì)胞培養(yǎng)、和轉(zhuǎn)基因摻入等流程(像電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、和顯微注射)使用了標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
術(shù)語“阿耳茨海默氏tau”指經(jīng)過遺傳工程改造而相應(yīng)于那些AD患病大腦中專門存在的tau蛋白的一組特定截短同種型。阿耳茨海默氏tau能夠自身或者聯(lián)合大腦中的其它分子來誘發(fā)NF活性。在用于本文時，術(shù)語阿耳茨海默氏tau蛋白指AD患病人大腦組織中存在的一組截短tau形式。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”在用于本文時描述人工插入細(xì)胞特別是哺乳動物細(xì)胞的基因組中用于植入存活動物的遺傳材料。對于特定國家，可能必需由這個方面專門排除某些主題，諸如人全能干細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞或?qū)е逻@些細(xì)胞的過程被歸入EC指令98/44/EC的6(1)和(2)條。
“阿耳茨海默氏病”(本文縮寫為“AD”)指與神經(jīng)原纖維纏結(jié)和β-淀粉狀斑形成以及學(xué)習(xí)和記憶二者損傷有關(guān)的狀況?！癆D”在用于本文時意欲涵蓋AD以及AD型病理(即具有與AD相似的癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)二者。
“神經(jīng)原纖維活性”(本文縮寫為“NF”活性)指與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成有關(guān)且具有與AD相似的癥狀的狀況。
“與AD相似的癥狀”和“與AD有關(guān)的現(xiàn)象”指與AD有關(guān)的結(jié)構(gòu)、分子、或功能事件，特別是易于在動物模型中評估的事件。這些事件包括但不限于神經(jīng)原纖維病理、學(xué)習(xí)和記憶缺乏、和其它AD相關(guān)特征。
“轉(zhuǎn)基因動物”指在其部分細(xì)胞中具有非內(nèi)源(即異源)核酸序列作為染色體外元件或穩(wěn)定整合到其生殖系DNA(即其大多數(shù)或所有細(xì)胞的基因組序列)中的非人動物，通常是哺乳動物(如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)。通過對例如宿主動物胚胎的遺傳操作將異源核酸導(dǎo)入這些轉(zhuǎn)基因動物的生殖系。
“構(gòu)建體”指可操作連接組織特異性或普通啟動子的重組核酸序列，通常是重組DNA序列，生成它是為了在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)特定核苷酸序列，或用于構(gòu)建其它重組核苷酸序列。
本發(fā)明提供了用于生成DNA構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)、序列和方法，所述DNA構(gòu)建體用于制備轉(zhuǎn)基因動物，特征在于下列特點(diǎn)DNA構(gòu)建體包含編碼N端和C端截短tau分子的cDNA分子，其中-如GeneBank序列編號NM_173727所示，該分子相對于分別編碼含四重復(fù)(4-repeat)和含三重復(fù)(3-repeat)的tau蛋白的全長tau cDNA序列而言截短了起始密碼子下游至少30個核苷酸并截短終止密碼子上游至少30個核苷酸；-最低限度截短tau核心包含由第744-930位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)片段(SEQ ID NO.9；編號依照tau蛋白同種型43)；-所述DNA構(gòu)建體編碼在動物大腦細(xì)胞中表達(dá)時具有神經(jīng)原纖維(NF)病理生成活性的蛋白質(zhì)。
可以通過每個選定大腦區(qū)域的神經(jīng)原纖維纏結(jié)計(jì)數(shù)對此NF病理生成活性定量，如使用立體學(xué)方法。或者，神經(jīng)行為測試可以用于學(xué)習(xí)記憶任務(wù)中認(rèn)知得分的可靠評估。
依照本發(fā)明特別優(yōu)選的tau cDNA分子包含選自SEQ ID NO1-14的核苷酸序列。序列描繪于

圖1中。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述cDNA分子是一組N端和C端雙重截短cDNA，它包含如下核苷酸序列(來自四重復(fù)的tau(tau43)的衍生物標(biāo)以R4，而來自三重復(fù)的tau(tau43)的衍生物標(biāo)以R3)。此處所用編號來自Goedert等人(24)描述的全長tau cDNA
SEQ ID NO1(91-1059，R4)ATGCACCAAGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTG-GAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGT-CAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATG-GTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGC-CAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGT-GAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCG-GCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTG-GCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGC-CCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCT-GAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCT-TAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCG-GCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCT-CATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCT-TGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATATCACCCACGTCCCTG-GCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGC-CAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGG-GACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCSEQ ID NO2(205-999，R4)ATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATG-GTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGC-CAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGT-GAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCG-GCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTG-GCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGC-CCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCT-GAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCT-TAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCG-GCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCT-CATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCT-
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ATGCACCAAGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTG-GAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGT-CAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATG-GTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGC-CAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGT-GAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCG-GCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTG-GCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGC-CCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCT-GAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGT-GACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTG-GAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTG-GACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCT-GACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGC-CAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCSEQ ID NO11(205-906，R3)ATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATG-GTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGC-CAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGT-GAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCG-GCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTG-GCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGC-CCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCT-GAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGT-GACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTG-GAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTG-GACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCT-GACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGSEQ ID NO12(277-906，R3)ATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAG-GATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAAT-CAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCAGC-CGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTG-GTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGCCCCCGTGC-CCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGC-CGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGT-GTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCT-GAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATATCAC-
CCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGC-CAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGSEQ ID NO13(205-996，R3)ATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATG-GTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGC-CAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGT-GAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCG-GCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTG-GCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGC-CCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCT-GAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGT-GACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTG-GAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTG-GACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCT-GACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGC-CAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCG-GCAGCATCGACATGGTAGACSEQ ID NO14(277-996，R3)ATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAG-GATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAAT-CAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCAGC-CGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTG-GTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGCCCCCGTGC-CCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGC-CGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGT-GTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCT-GAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATATCAC-CCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGC-CAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGG-GACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGAC
可以將截短tau序列適應(yīng)構(gòu)建體將轉(zhuǎn)染的特定宿主細(xì)胞(密碼子使用、密碼子偏愛性、同系物適應(yīng)即用宿主細(xì)胞密碼子交換一種或多種人類密碼子，如果存在差異的話)而進(jìn)行改造。
構(gòu)建體的優(yōu)選特征將上文cDNA序列連接調(diào)控序列以驅(qū)動截短tau蛋白在大腦中的表達(dá)。進(jìn)行對Thy-1基因(25)的修飾，以刪除指導(dǎo)在T細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列，而將截短cDNA序列導(dǎo)入SpeI和XhoI限制性位點(diǎn)之間。將經(jīng)修飾的構(gòu)建體剝?nèi)ピ诵蛄校⑼ㄟ^顯微注射導(dǎo)入雄性前核。任何功能性啟動子或啟動子-增強(qiáng)子復(fù)合物都可用于上述截短tau cDNA的表達(dá)。
依照另一個方面，本發(fā)明提供了用于制備和測試依照本發(fā)明的分子的方法，特征是下列步驟(a)構(gòu)建攜帶雙重截短tau分子編碼序列的重組原核克隆質(zhì)粒，其中刪除覆蓋三或四重復(fù)的tau cDNA分子的至少最前面30個和最后30個核苷酸；(b)構(gòu)建攜帶用于大腦表達(dá)或普遍表達(dá)的合適啟動子和截短tau分子的各自cDNA序列及其組合的真核表達(dá)質(zhì)粒；(c)培養(yǎng)包含所述質(zhì)粒的細(xì)菌，大量擴(kuò)增并提取質(zhì)粒；(d)將所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，并使用Western印跡技術(shù)對其進(jìn)行分析；(e)基因構(gòu)建體的分離和純化，從而排除所有原核序列，并將轉(zhuǎn)基因在緩沖液中稀釋至適于顯微注射的濃度(參見實(shí)施例1)；(f)確認(rèn)意欲用于顯微注射的基因構(gòu)建體。
這是通過限制性分析、基因測序、和在瞬時轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后的蛋白質(zhì)分析進(jìn)行的，然后評估蛋白質(zhì)的正確大小和它們與特異性單克隆抗體的反應(yīng)性(見實(shí)施例1，圖2b)。
因此，本發(fā)明提供了其生殖細(xì)胞和/或體細(xì)胞包含編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物，它可以用作阿耳茨海默氏病的合適動物模型。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供其所有生殖細(xì)胞和/或體細(xì)胞都包含人截短tau cDNA分子的轉(zhuǎn)基因非人動物?？寺〉娜税⒍暮Ｄ蟭aucDNA序列連接指導(dǎo)阿耳茨海默氏tau以組織特異方式或普遍表達(dá)的啟動子序列。
使用眾所周知的常規(guī)顯微注射方法導(dǎo)入一日齡大鼠雌性胚胎的前核來構(gòu)建本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物。還可以通過本領(lǐng)域已知的其它方法將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ゼ?xì)胞，包括轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、和借助逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者通過其它手段。然后，可以將攜帶轉(zhuǎn)基因的胚胎植入假孕動物。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供用于新生動物基因分型的方法。為此目的采用PCR分析，其中使用能夠擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因靶序列的特異性寡核苷酸。設(shè)計(jì)用于基因分型的寡核苷酸，從而能夠最終通過PCR產(chǎn)物的DNA測序來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(包括ATG密碼子和Kozak序列)(引物對A)。此外，一條引物與異源啟動子退火，另一條引物與編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的核苷酸序列退火。將類似設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于終止密碼子(引物對B)。因此，可以通過這種方法來監(jiān)測轉(zhuǎn)基因的完整性。診斷性寡核苷酸的序列如下引物對A有義5′-GTGGATCTCAAGCCCTCAAG-3′反義5′-GATCCCCTGATTTTGGAGGT-3′PCR產(chǎn)物的期望大小是235個核苷酸。
引物對B有義5′-AAGGTGACCTCCAAGTGTGG-3′反義5′-GGTATGCATGGAGGGAGAAG-3′PCR產(chǎn)物的期望大小是438個核苷酸。
因此，PCR片段的存在對于轉(zhuǎn)基因整合到基因組中的動物是特異的(見實(shí)施例2)。
生成動物(founder animal)可用于與野生型動物交配以生成F1代動物，它們對于轉(zhuǎn)基因而言是雜合的。在其它實(shí)施方案中，可以將這些雜合動物近交以獲得能存活的轉(zhuǎn)基因胚胎，它們的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞對于編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的基因而言是純合的。
本發(fā)明的另一個方面是提供其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞瞬時或穩(wěn)定表達(dá)編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的所述DNA構(gòu)建體并在大腦中展示NF病理的非人動物。本發(fā)明的優(yōu)選動物是大鼠，其中由所述DNA分子編碼的蛋白質(zhì)在大腦中表達(dá)。
本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案是轉(zhuǎn)基因非人動物，其中由所述DNA分子編碼的阿耳茨海默氏tau蛋白在動物大腦中表達(dá)。如實(shí)施例3所描述和圖3所證明的，通過幾種單克隆抗體檢測到阿耳茨海默氏tau的表達(dá)。圖4證明了蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因譜系不同大腦區(qū)域中的表達(dá)。
因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其中編碼阿耳茨海默氏tau蛋白的DNA分子穩(wěn)定整合到所述動物的基因組中或以其它方式存在細(xì)胞核中以獲得轉(zhuǎn)錄。所述動物的特征在于-轉(zhuǎn)基因依照孟德爾法則傳遞給下一代動物，形成轉(zhuǎn)基因譜系(見實(shí)施例4)；-遺傳得到的轉(zhuǎn)基因在生成動物和后代大腦中表達(dá)截短型蛋白質(zhì)(實(shí)施例3，圖4)。
因此，本發(fā)明提供了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中表現(xiàn)神經(jīng)原纖維病理的轉(zhuǎn)基因非人動物。所述動物的特征在于-截短tau蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)原纖維病理的形成(實(shí)施例5)；-PHF 1免疫反應(yīng)性NFT顯示內(nèi)源正常大鼠tau參與NFT的形成(實(shí)施例5)；-神經(jīng)原纖維纏結(jié)表現(xiàn)為CNS神經(jīng)元中的胞內(nèi)包涵體和細(xì)絲，而且與人AD患病大腦中的NFT是同源的；-免疫熒光揭示了與在潛伏期(pre-clinical)阿耳茨海默氏病人大腦組織中觀察到的那些相似的小棒樣結(jié)構(gòu)的存在(實(shí)施例5)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動物展示對甲酸敏感的諸如神經(jīng)原纖維纏結(jié)、ghost纏結(jié)、和神經(jīng)細(xì)絲等神經(jīng)病理學(xué)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)由神經(jīng)元內(nèi)的細(xì)絲異常積累組成。纏結(jié)成分包括阿耳茨海默氏tau以及正常tau分子。這些轉(zhuǎn)基因動物作為合適模型系統(tǒng)用于研究阿耳茨海默氏病和治療性、預(yù)防性、和診斷性物質(zhì)的開發(fā)。
本發(fā)明提供了發(fā)展NF病理且具有能夠誘發(fā)與AD有關(guān)的致病因素的遺傳背景從而擔(dān)當(dāng)人的疾病模型的轉(zhuǎn)基因動物。
因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，其遺傳背景是其中DNA分子穩(wěn)定整合到自發(fā)高血壓動物的基因組中或以其它方式存在于細(xì)胞核中從而在特定遺傳背景中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的另一個方面是提供包含遺傳因素和下列與AD有關(guān)的其它致病因素的組合的動物模型-高血壓，這是AD的最常見致病因素；-糖尿病，這可以通過飲食誘發(fā)(糖尿病是AD的最重要致病因素)；-高膽固醇血癥，這可以通過飲食誘發(fā)(AD的另一個重要致病因素)。
所述病理學(xué)狀況可以在提供的動物模型中容易的誘發(fā)。合適范例先前在文獻(xiàn)中有報(bào)道(如26、27、28)。
此外，提供的動物模型是在SHR遺傳背景上表達(dá)神經(jīng)原纖維病理的第一個動物模型。
依照另一個方面，本發(fā)明提供了擔(dān)當(dāng)散發(fā)性阿耳茨海默氏病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膭游?，所述模型能夠評估與AD發(fā)展有關(guān)的致病因素的作用。致病因素在絕大多數(shù)AD病例中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，認(rèn)為該模型是占到所有AD神經(jīng)變性病例90％的散發(fā)性AD的模型。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防、和診斷阿耳茨海默氏病的物質(zhì)的篩選測定系統(tǒng)，包括-通過下列方法評估物質(zhì)·在所述動物中檢測神經(jīng)原纖維病理的變化；·在轉(zhuǎn)基因動物中測量神經(jīng)行為的變化；·在轉(zhuǎn)基因動物中測量認(rèn)知得分；·在動物組織和體液中通過生物化學(xué)方法測量AD特異標(biāo)記；
-用于治療和預(yù)防tau病理優(yōu)選AD的物質(zhì)的確認(rèn)系統(tǒng)；-用于開發(fā)用于檢測tau病理優(yōu)選AD的診斷性標(biāo)記和探針的確認(rèn)系統(tǒng)；-用于治療結(jié)合tau病理優(yōu)選AD的高血壓、糖尿病、異常脂血癥、和高膽固醇血癥的物質(zhì)的確認(rèn)系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明提供了用于評估物質(zhì)或療法特別是NFT減少或預(yù)防療法的功效的體內(nèi)測定法。所述動物可用于篩選用于神經(jīng)變性疾病的物質(zhì)或療法，特別是tau病理，優(yōu)選AD和伴隨神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的其它神經(jīng)變性疾病。
因此，本發(fā)明提供了模型系統(tǒng)，由可用于研究阿耳茨海默氏病的病因?qū)W和治療方法的轉(zhuǎn)基因動物、細(xì)胞、和測定法組成。所述測定法還可用于篩選抑制神經(jīng)原纖維病理形成的物質(zhì)和物質(zhì)的其它治療性效果。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物及由其衍生的動物細(xì)胞用于篩選化合物在使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)治療阿耳茨海默氏病中的潛在效果。以一段時間和各種劑量將化合物施用于動物或?qū)肱囵B(yǎng)基，然后對動物和動物細(xì)胞分別檢驗(yàn)組織病理學(xué)和阿耳茨海默氏tau表達(dá)中的變化。另外，對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行神經(jīng)行為測試的能力使之能夠在用潛在治療劑治療后監(jiān)測認(rèn)知功能。化合物的篩選導(dǎo)致用于預(yù)防、治療、或診斷阿耳茨海默氏病的特定試劑的選擇。篩選方法的許多變化對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是已知的，而且可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物模型還可用于解開導(dǎo)致神經(jīng)變性和阿耳茨海默氏病事件的分子級聯(lián)反應(yīng)，從而可能鑒定治療靶。
本發(fā)明的還有一個方面是提供基于衍生自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞系或衍生自轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎的細(xì)胞系的體外測定法，其中所述測定法作為篩選和確認(rèn)工具用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)阿耳茨海默氏診斷方法和標(biāo)記。所述體外測定法基于細(xì)胞系，而且還可作為篩選和確認(rèn)工具用于發(fā)現(xiàn)抗阿耳茨海默氏治療性和預(yù)防性藥物。
展示下面的實(shí)施例是為了作為例示，而且因?yàn)楦鞣N其它實(shí)施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，下面的實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
圖的簡述圖1用于基因表達(dá)構(gòu)建體的基因工程的阿耳茨海默氏tau蛋白cDNA的示意圖，它用于生成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物。
圖2用于生成轉(zhuǎn)基因動物的基因構(gòu)建體的制備和確認(rèn)。轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建是通過包含阿耳茨海默氏tau編碼序列的克隆基因構(gòu)建體的前核顯微注射進(jìn)行的。通過限制性分析和使用轉(zhuǎn)基因特異性引物的PCR(小圖A，PCR擴(kuò)增得到的DNA片段的瓊脂糖凝膠)以及通過DNA測序來確認(rèn)基因構(gòu)建體，來控制潛在突變。確認(rèn)之后純化基因構(gòu)建體(小圖B，純轉(zhuǎn)基因片段的瓊脂糖凝膠)并瞬時轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中(小圖C，Western印跡確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá))。完成測定后，去掉構(gòu)建體的原核序列并注射到一日齡大鼠胚胎中。底部的流程圖顯示了轉(zhuǎn)基因動物生成的簡化流程。
圖3轉(zhuǎn)基因生成動物和轉(zhuǎn)基因動物F1代的基因分型。小圖A顯示了基因分型實(shí)驗(yàn)的對照(+C，陽性對照；NAC，無擴(kuò)增對照；NTC，無模板對照)。小圖B顯示PCR基因分型的結(jié)果。樣品編號12是一只轉(zhuǎn)基因陽性動物。小圖C概述了用于確認(rèn)生成動物的繁殖實(shí)驗(yàn)。此外，小圖顯示了依照孟德爾法則將轉(zhuǎn)基因傳遞給下一代的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因系。
圖4阿耳茨海默氏tau蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠大腦中的表達(dá)。左圖描繪了Western印跡分析，右圖展現(xiàn)了每道加載的蛋白質(zhì)總量。阿耳茨海默氏tau蛋白以35kD的大小遷移(第1道，箭頭)，通過泛tau單克隆抗體DC 25檢測。為了Western印跡，采用ECL技術(shù)，并在曝光1分鐘后觀察到特異信號。加載了由轉(zhuǎn)基因動物大腦裂解物提取的7.5μg總蛋白(第1道)，而加載了來自野生型對照動物的25μg蛋白質(zhì)。M，分子量標(biāo)記。
圖5阿耳茨海默氏tau蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠不同大腦區(qū)域中的表達(dá)。來自轉(zhuǎn)基因大鼠大腦區(qū)域的總蛋白裂解物的Western印跡分析。第1道，生成動物(F0代)的全大腦裂解物-10μg蛋白質(zhì)；第2道，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因動物的全大腦裂解物；第3-6道，來自F2代轉(zhuǎn)基因動物的蛋白質(zhì)裂解物3-海馬，4-皮層下區(qū)域，5-大腦皮層，6-脊髓和髓質(zhì)；第7-8道是來自F2代對照非轉(zhuǎn)基因同窩幼仔的大腦大腦裂解物7-皮層，8-小腦(第2-8道每道加載20μg總蛋白)。
圖6來自轉(zhuǎn)基因動物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找吧蛣游锏拇竽X切片的銀染。在轉(zhuǎn)基因大鼠CNS的神經(jīng)元中檢測到胞內(nèi)包涵體和神經(jīng)原纖維細(xì)絲(小圖B和C，轉(zhuǎn)基因動物)。野生型大鼠在同源大腦區(qū)域中不顯示這些結(jié)構(gòu)(A，野生型對照)。放大倍數(shù)200倍(A和B)，400倍(C)。
圖7在轉(zhuǎn)基因動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中使用泛tau單克隆抗體DC 25對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的檢測。mAb DC 25識別AD患者神經(jīng)元中的NFT。在轉(zhuǎn)基因大鼠大腦中識別了等同結(jié)構(gòu)(小圖B和D)。野生型大鼠在同源大腦區(qū)域中不顯示任何相似結(jié)構(gòu)(A、C)。放大倍數(shù)100倍(A、B)，200倍(C、D)。
圖8在轉(zhuǎn)基因動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中通過單克隆抗體PHF-1對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的檢測。PHF-1是tau磷酸化的特異標(biāo)記。與這種抗體的免疫反應(yīng)性顯示了阿耳茨海默氏tau的表達(dá)涉及NFT形成過程中的內(nèi)源tau。另外，免疫熒光染色顯示了與在潛伏期阿耳茨海默氏病大腦組織中觀察到的那些相似的小棒樣結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)100倍(A)、200倍(B)、1000倍(C、D)。
圖9作為篩選測定系統(tǒng)用于鑒定治療指引和候選藥物的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)物可以在體外培養(yǎng)后用于此目的，而且可以使用視頻顯微鏡檢查術(shù)來評估候選藥物對線粒體運(yùn)輸?shù)挠绊?。體外培養(yǎng)3天后(3DIV)顯示荷載活體染料(如Mito-trek)的皮層(Cx)和海馬(Hipp)神經(jīng)元。顯現(xiàn)了線粒體(MT)。
圖10阿耳茨海默氏病的組織病理學(xué)特征，在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物中再現(xiàn)。所示神經(jīng)原纖維病理是阿耳茨海默氏病的主要特點(diǎn)之一。圖10顯示了通過Gallyas銀技術(shù)(A、C)和通過免疫組化(E)在AD患者大腦中檢測到的神經(jīng)原纖維纏結(jié)與在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物中觀察到的等同病理結(jié)構(gòu)的比較。免疫化學(xué)染色是使用識別串聯(lián)重復(fù)區(qū)(29)中的普通tau表位的單克隆抗體7.51進(jìn)行的。
實(shí)施例實(shí)施例1包含編碼阿耳茨海默氏tau蛋白-人截短tau基因的DNA序列的基因構(gòu)建體的設(shè)計(jì)；基因構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因動物中的普遍性和組織特異性表達(dá)的工程和確認(rèn)構(gòu)建阿耳茨海默氏tau表達(dá)載體的方法包括下列步驟-圖1顯示了編碼序列尤其是缺失和截短的設(shè)計(jì)；-使用校正型DNA聚合酶和含有合適限制性序列的寡核苷酸，PCR擴(kuò)增這些tau基因片段，使得它們能夠克隆到真核表達(dá)載體中，位于常規(guī)或組織特異性啟動子之下，克隆使用標(biāo)準(zhǔn)方法在普通細(xì)菌菌株中進(jìn)行；-進(jìn)行克隆基因的確認(rèn)以檢查插入基因的取向，其通過限制性消化和/或PCR分析確認(rèn)(圖2A)。另外，將構(gòu)建體部分測序以排除可能的突變形式；-純化意欲用于顯微注射的片段(圖2B)；-確認(rèn)通過將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)，主要是COS-7和C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并通過Western印跡法分析蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的表達(dá)(圖2C)。
所有方法描述于下面的指南Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，(14)。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因大鼠的生成將包含阿耳茨海默氏tau編碼序列的克隆基因構(gòu)建體注射到一日齡胚胎的雄性前核中。使用常規(guī)技術(shù)(15)在分開的實(shí)驗(yàn)中由SHR供體雌性抽取受精卵。顯微注射DNA后，將合子在CO2溫箱中體外培養(yǎng)大約12小時，并移植到假孕養(yǎng)母的輸卵管中。通過對基因組DNA中轉(zhuǎn)基因特異性靶序列的PCR來鑒定生成者。為了測定tau基因型，由采自每只大鼠的大約0.5cm尾巴純化基因組DNA。通過PCR分析來鑒定包含轉(zhuǎn)基因的后代。設(shè)計(jì)用于診斷性PCR篩選的寡核苷酸，從而能夠容易的測定轉(zhuǎn)基因的完整性。為了測定整合到大鼠基因組中的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，進(jìn)行實(shí)時PCR分析。
例如，Tg系#318包含4個拷貝的轉(zhuǎn)基因，這是使用Sybre Green法和BioRad PCR儀通過實(shí)時PCR測定的。
實(shí)施例3胚胎移植到養(yǎng)母后出生動物的基因分型，轉(zhuǎn)基因動物的鑒定和轉(zhuǎn)基因傳遞到后代的評價由尾尖提取DNA使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)提取基因組DNA。
基因分型對衍生自轉(zhuǎn)基因動物親代的基因組DNA進(jìn)行編碼雙重截短tau形式的轉(zhuǎn)基因的特異性擴(kuò)增，顯示于圖3A和3B。對F1代基因組DNA的進(jìn)一步分析揭示了轉(zhuǎn)基因是可遺傳的，因?yàn)樗鼈冊谟H代的后代中也得到鑒定。因此，編碼阿耳茨海默氏tau的轉(zhuǎn)基因固定在動物的染色體DNA中。對兩只陽性對照(質(zhì)粒和TG陽性基因組DNA)和兩只陰性對照(無擴(kuò)增對照異源基因組DNA；無模板對照作為化學(xué)制品對照)進(jìn)行基因分型，如圖3A所示。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分析通過RT-PCR分析來評估衍生自轉(zhuǎn)基因的mRNA的表達(dá)，運(yùn)用公知方法，包括RT-PCR和凝膠電泳。由迅速冷凍的轉(zhuǎn)基因動物組織提取RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后是cDNA的特異性擴(kuò)增。
大鼠繁殖以及雜合和純合大鼠的生成將轉(zhuǎn)基因陽性大鼠與野生型SHR交配。在幾種系中實(shí)現(xiàn)了種系傳遞。在此實(shí)施例中顯示了Tg系#318。將雄性和雌性轉(zhuǎn)基因大鼠(每一只都包含4個拷貝的截短人tau蛋白基因)彼此交配和與野生型SHR大鼠交配以擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因群體。觀察轉(zhuǎn)基因在后代中的孟德爾分離比率(圖3C)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可用于與過度表達(dá)包含家族性阿耳茨海默氏病(FAD)突變的人APP或PS1(13)的轉(zhuǎn)基因動物雜交。由此得到的大鼠將表達(dá)APP和PS1二者，而且在高血壓遺傳背景上有或無FAD突變。可以在體內(nèi)和體外研究PS1和APP對NFT形成的影響。具體而言，可以通過免疫組織化學(xué)的手段來檢驗(yàn)AD相關(guān)病理的發(fā)作和嚴(yán)重性。
實(shí)施例4阿耳茨海默氏tau蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠大腦中的表達(dá)使用tau蛋白特異性單克隆抗體通過Western印跡分析來進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。我們分析了對轉(zhuǎn)基因而言在遺傳上陽性且能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因傳遞給下一代的大鼠的大腦組織。實(shí)驗(yàn)對照是同時分析來自轉(zhuǎn)基因陰性的年齡匹配大鼠和轉(zhuǎn)基因陰性同窩幼仔的大腦提取物。
組織樣品的制備將大約2mg新鮮分離的大腦組織在30μl含有完全不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的修改Hunt氏裂解緩沖液(20mM Tris pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5％Igepal CA630、0.5％Triton X-100)中機(jī)械勻漿。添加170μl裂解緩沖液，用注射器和針頭(22G)將勻漿液弄碎，并在液氮中冷凍。在冰上緩慢融化后，將裂解物超聲處理并以10000g于4℃離心15分鐘。使用Beckman分光光度計(jì)通過Bradford測定法測定樣品中的蛋白質(zhì)含量。
PAGE和Western印跡。在含0.1％(w/v)SDS的12％變性聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)。在Tris-甘氨酸緩沖液(25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1％SDS)中進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)分離后進(jìn)行半干印跡。使用Tris-甘氨酸-異丙醇緩沖液系統(tǒng)(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％異丙醇)。使用與mAb 7.51(29)以及mAb tau-1(21)同等識別tau蛋白的抗tau單克隆抗體DC 25將tau蛋白染色。使用抗小鼠HRP抗體通過ECL法測定陽性信號。通過Ponceau染色控制印跡流程的效率。蛋白質(zhì)分析揭示了阿耳茨海默氏tau蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠大腦總蛋白提取物中的特異性表達(dá)(圖4)，以及阿耳茨海默氏tau蛋白在轉(zhuǎn)基因大鼠不同大腦區(qū)域中的表達(dá)(圖5)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因大鼠大腦的免疫組織化學(xué)分析為了對轉(zhuǎn)基因大鼠進(jìn)行免疫組化分析，使用幾種tau蛋白和阿耳茨海默特異性單克隆抗體。這些研究中所采用的單克隆抗體的簡短描述包括識別磷酸化表位Ser 396-Ser 404的PHF 1；識別不依賴磷酸的表位Lys 347-Ile 353的mAb DC 25；識別磷酸化表位Ser 198-Ser 202的mAb AT 8；識別非磷酸化表位的mAb tau 1；識別不依賴磷酸的表位的mAb tau 5(15、16、17、18、19、20、21、22)。
光學(xué)顯微鏡和免疫熒光如下制備組織并切片。用乙醚麻醉轉(zhuǎn)基因動物和對照動物并立即心臟內(nèi)灌注經(jīng)過緩沖的4％多聚甲醛，切除大腦，用20％蔗糖防凍，快速冷凍，并在低溫恒溫器中切片，厚度50μm。在染色前，將一些切片用70％甲酸短暫預(yù)處理。將大鼠大腦組織切片在溶于PBS的1％H2O2中保溫，并通過在封閉液(PBS、0.1％Triton)、5％正常馬血清)中保溫來封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。使用上文所列抗體進(jìn)行免疫染色，然后與生物素化馬抗小鼠抗體一起保溫，隨后是親和素-生物素復(fù)合物保溫，并用VIP和DAB溶液顯現(xiàn)。將組織切片放置在明膠包被載玻片上，干燥，用分級乙醇、二甲苯處理，并用Entellan蓋片。
銀染調(diào)整先前描述的Gallyas銀染法(23)適用于自由漂浮的50μm切片，用金調(diào)色。
免疫熒光染色為了進(jìn)行間接免疫熒光標(biāo)記，將切片用1％NaHBO4預(yù)處理30分鐘以減少大腦組織的自身熒光。然后用一抗于4℃染色過夜，與馬抗小鼠生物素化抗體一起保溫，隨后是與鏈霉親和素Alexa488綴合物保溫。
圖10描繪了在AD患者大腦中看到的NF病理與在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物中觀察到的那些NF病理的比較。
實(shí)施例6用于治療和預(yù)防阿耳茨海默氏病的藥物指引和藥物候選的篩選測定系統(tǒng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可以作為細(xì)胞來源用于細(xì)胞培養(yǎng)。動物和細(xì)胞都可以用于本發(fā)明的測定法。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)來培養(yǎng)表達(dá)截短tau基因的大腦組織的細(xì)胞。動物和培養(yǎng)細(xì)胞可以作為體內(nèi)和體外系統(tǒng)用于研究候選藥物對細(xì)胞構(gòu)造、細(xì)胞分裂、和凋亡以及原代培養(yǎng)神經(jīng)元的形態(tài)、原代培養(yǎng)物中神經(jīng)突發(fā)芽、軸突分支、和軸突延長的作用，還用于研究細(xì)胞器運(yùn)動(圖9)。它們還可作為測試系統(tǒng)用于測試物質(zhì)的神經(jīng)營養(yǎng)效果。
可以設(shè)計(jì)研究來篩選可以通過測試物質(zhì)來調(diào)節(jié)的tau與微管蛋白的相互作用和與細(xì)胞器交通(trafficking)的相互作用的數(shù)量或質(zhì)量變化。
還可以設(shè)計(jì)研究來篩選在突觸連接構(gòu)建過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)或活性的化合物。
還可以設(shè)計(jì)研究來篩選能夠影響NFT形成或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物，它們最終能夠?qū)е翹FT形成的減緩、抑制、或消除，而且這可以作為有用測定法用于篩選對tau病理和其它神經(jīng)變性疾病優(yōu)選AD具有治療潛力的物質(zhì)。可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中也可以在體內(nèi)通過神經(jīng)病理學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、和行為分析的手段評估化合物對動物的效果。篩選方法的許多變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，而且可用于本發(fā)明的范圍。
這些實(shí)施例出于例示目的描述了本發(fā)明的特定方面和實(shí)施方案，而非限制下文權(quán)利要求所列的本發(fā)明范圍。
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1.包含編碼N端和C端截短tau分子的cDNA分子的DNA構(gòu)建體，其中-所述分子相對于如GeneBank序列編號NM_173727所示的分別編碼四重復(fù)和三重復(fù)的tau蛋白的全長tau cDNA序列而言截短起始密碼子下游至少30個核苷酸并截短終止密碼子上游至少30個核苷酸；-最低限度截短tau核心包含由第744-930位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)片段(SEQ ID NO.9；編號依照tau蛋白同種型43)；-所述DNA構(gòu)建體在動物大腦細(xì)胞中表達(dá)時編碼具有神經(jīng)原纖維(NF)病理生成活性的蛋白質(zhì)。
2.其生殖細(xì)胞和/或體細(xì)胞包含依照權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因非人動物。
3.其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞瞬時或穩(wěn)定表達(dá)依照權(quán)利要求1的所述DNA構(gòu)建體從而在大腦中展示NF病理的非人動物。
4.依照權(quán)利要求2或3的轉(zhuǎn)基因非人動物，優(yōu)選大鼠，其中由所述DNA分子編碼的蛋白質(zhì)在大腦中表達(dá)。
5.使用對依照權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因截短tau特異的寡核苷酸將依照權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因動物基因分型的方法。
6.依照權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因動物，它發(fā)展NF病理，而且具有能夠誘發(fā)與AD有關(guān)的致病因素的遺傳背景，從而擔(dān)當(dāng)人的疾病模型。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人動物，它擔(dān)當(dāng)AD的動物模型，而且能夠誘發(fā)作為AD的致病因素的高血壓。
8.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人動物，它擔(dān)當(dāng)AD的動物模型，而且能夠誘發(fā)作為AD的致病因素的糖尿病。
9.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因非人動物，它擔(dān)當(dāng)AD的動物模型，而且能夠誘發(fā)作為AD的致病因素的高膽固醇血癥。
10.用于治療、預(yù)防和診斷阿耳茨海默氏病的物質(zhì)的篩選測定系統(tǒng)和確認(rèn)系統(tǒng)，包括-通過下列方法評估物質(zhì)·在依照權(quán)利要求2-4和6-9任一項(xiàng)的動物中檢測神經(jīng)原纖維病理的變化；·在所述動物中測量神經(jīng)行為的變化；·在所述動物中測量認(rèn)知得分的變化；-用于治療和預(yù)防tau病理優(yōu)選AD的物質(zhì)的確認(rèn)系統(tǒng)；-用于開發(fā)用于檢測tau病理優(yōu)選AD的診斷性標(biāo)記和探針的確認(rèn)系統(tǒng)；-用于治療聯(lián)合tau病理優(yōu)選AD的高血壓、糖尿病、異常脂血癥、和高膽固醇血癥的物質(zhì)的確認(rèn)系統(tǒng)。
11.依照權(quán)利要求10的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)，它用于鑒定tau病理和相關(guān)神經(jīng)變性過程優(yōu)選AD中的新藥靶。
12.依照權(quán)利要求2-4和6-9任一項(xiàng)的動物作為體內(nèi)測定法用于測試物質(zhì)或療法的功效的用途，特別是神經(jīng)原纖維病理減少療法。
13.依照權(quán)利要求12的用途，其中所述物質(zhì)或療法用于神經(jīng)變性疾病，特別是tau病理，優(yōu)選AD和伴隨神經(jīng)原纖維病理的其它神經(jīng)變性疾病。
14.經(jīng)過依照權(quán)利要求1的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或衍生自權(quán)利要求2-4和6-9任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞系。
15.依照權(quán)利要求14的細(xì)胞系，特征是該細(xì)胞系是衍生自轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎的大鼠細(xì)胞系。
16.包含依照權(quán)利要求14或15的細(xì)胞系的體外測定法，其中所述測定法作為篩選和確認(rèn)工具用于發(fā)現(xiàn)阿耳茨海默氏病的治療性、預(yù)防性、和診斷性化合物以及標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含人類DNA序列的轉(zhuǎn)基因非人動物以及非人哺乳動物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞，所述序列編碼能夠在轉(zhuǎn)基因動物中誘發(fā)阿耳茨海默氏病(AD)病理的AD衍生tau蛋白。阿耳茨海默氏tau蛋白是在特定遺傳背景上表達(dá)的，它們也能夠模擬與神經(jīng)變性有關(guān)而且是AD發(fā)展的重要致病因素的不同人類疾病，包括高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物和細(xì)胞展示神經(jīng)原纖維病理，而且可以作為體內(nèi)和體外測定系統(tǒng)，用于篩選和開發(fā)tau病理和AD的治療性和預(yù)防性物質(zhì)以及診斷性標(biāo)記和探針。另外，這些轉(zhuǎn)基因動物及由其衍生的細(xì)胞系提供了神經(jīng)變性疾病的體內(nèi)和體外測定系統(tǒng)，優(yōu)選tau病理和AD，這是聯(lián)合其它疾病像高血壓和與神經(jīng)變性過程有關(guān)的其它代表性致病因素的結(jié)果。
文檔編號G01N33/68GK1668745SQ03816645
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者E·康特賽克瓦, P·菲利普斯克 申請人:阿克松神經(jīng)科學(xué)研究和發(fā)展股份有限公司