本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料制造技術(shù)，具體涉及聚吡咯/生物素納米結(jié)構(gòu)的制備方法。

背景技術(shù)：

由于納米材料的納米尺寸效應(yīng)，導(dǎo)電聚吡咯納米材料表現(xiàn)出優(yōu)異的化學(xué)性質(zhì)。此外，納米材料和塊狀材料不同的電學(xué)和物理特性在導(dǎo)電聚吡咯納米材料的構(gòu)建中起到至關(guān)重要的作用。導(dǎo)電高分子納米材料的特性在許多方面具有廣泛的應(yīng)用。目前，研究者發(fā)明了各種導(dǎo)電高分子納米材料的制備方法。雖然研究者發(fā)明了一些簡單新穎的制備方法，先進(jìn)的控制導(dǎo)電高分子納米材料的性能的技術(shù)方法仍然是一種挑戰(zhàn)。

生物素(biotin)廣泛分布于生物體中，是動物機(jī)體內(nèi)維持正常生理機(jī)能所必需的維生素之一。生物素和卵白素具有極強(qiáng)的親和力，比體內(nèi)的抗原-抗體結(jié)合力強(qiáng)很多倍，是自然界中目前發(fā)現(xiàn)的具有最強(qiáng)親和力的物質(zhì)。生物素與親合素之間的極強(qiáng)的特異性結(jié)合發(fā)展了一種生物素－親合素系統(tǒng)(biotin-avidin—system，bas)技術(shù)。因此，采用生物素?fù)诫s聚吡咯并且調(diào)控聚吡咯納米結(jié)構(gòu)具有深遠(yuǎn)的研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。人們一般采用模板法制備生物素?fù)诫s聚吡咯納米結(jié)構(gòu)材料。但是該方法涉及去除模板的過程，該過程一般通過堿去除模板，對材料表面的生物分子的活性有著較大的影響，同時(shí)該方法比較復(fù)雜，同時(shí)制備的納米結(jié)構(gòu)容易倒伏。

本發(fā)明制備導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的過程簡單，無污染，材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本發(fā)明采用電化學(xué)方法在在塊狀材料表面構(gòu)建不同納米結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素膜層?；诩{米效應(yīng)，該材料有望用于高效捕獲和釋放循環(huán)腫瘤癌細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的制備方法。本發(fā)明通過電化學(xué)方法將生物素?fù)诫s于聚吡咯，在導(dǎo)電基材表面構(gòu)建了不同納米結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素膜層。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的基于導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

為了達(dá)到發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基于導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)導(dǎo)電基材表面電沉積氯摻雜的聚吡咯；

選用三電極模式，導(dǎo)電金屬為對電極，導(dǎo)電基材為工作電極，電解質(zhì)溶液為包含吡咯和氯離子的溶液，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，氯摻雜的聚吡咯沉積在導(dǎo)電基材表面；

(2)工作電極表面沉積納米結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電聚吡咯/生物素材料；

選用三電極模式，導(dǎo)電金屬為對電極、步驟(1)制備的沉積有氯摻雜的聚吡咯的導(dǎo)電基材為工作電極，電解質(zhì)為包含吡咯和生物素的緩沖溶液，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，納米結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素材料沉積在工作電極上，即得到基于導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料；所述緩沖溶液為中性時(shí)，工作電極表面沉積有納米錐結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素材料；所述緩沖溶液為酸性或堿性時(shí)，工作電極表面沉積有納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素材料。

步驟(1)所述氯離子的源為鹽酸或氯化鉀，優(yōu)選鹽酸。

步驟(1)和(2)中所述導(dǎo)電金屬為鉑電極或銅電極，優(yōu)選為銅電極。

步驟(1)中所述電解質(zhì)溶液中氯離子的濃度為0.1～0.3mol/l，吡咯的濃度為0.1～0.3mol/l；

步驟(1)中所述電化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間為10～50s。

步驟(1)中所述電化學(xué)反應(yīng)的電壓為0.7～1.2v，優(yōu)選為0.8v；所述導(dǎo)電基材為鈦、導(dǎo)電玻璃等。

步驟(1)中所述氯離子最佳濃度是0.25mol/l，吡咯的最佳濃度是0.2mol/l，最佳反應(yīng)時(shí)間是20秒。

步驟(2)中所述電化學(xué)反應(yīng)的電流為0.5～2.0ma/cm²；

步驟(2)中所述電化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間為10～50min。

步驟(2)中所述吡咯的濃度為0.1～0.3mol/l，生物素的濃度為0.05～0.2mol/l。

步驟(2)中所述吡咯的最佳濃度是0.2mol/l，生物素的最佳濃度是0.1mol/l，最佳反應(yīng)時(shí)間是40min。

步驟(2)中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液；所述緩沖溶液的ph為3.0～5.5時(shí)，聚吡咯/生物素材料的結(jié)構(gòu)是1-50nm的納米顆粒；所述緩沖溶液的ph為6.8～7.2時(shí)，聚吡咯/生物素材料的結(jié)構(gòu)是納米錐；所述緩沖溶液的ph為7.8～8.5時(shí)，聚吡咯/生物素材料的結(jié)構(gòu)是200-1000nm的納米顆粒。

所述基于導(dǎo)電基材的納米結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料通過上述方法制備得到。

所述復(fù)合材料用于制備高效捕獲和釋放循環(huán)腫瘤癌細(xì)胞的材料。

本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：

(1)在導(dǎo)電基材采用無污染快捷可控的電化學(xué)方法構(gòu)建不同納米結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電聚吡咯/生物素膜層，實(shí)現(xiàn)生物素?fù)诫s于聚吡咯；

(2)本發(fā)明的方法簡單，成本較低，可大面積制備和生產(chǎn)；

(3)所制備的復(fù)合材料中納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無去模板的步驟，不會影響生物活性分子的活性。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備的基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖；

圖2為實(shí)施例2制備的基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖；

圖3為實(shí)施例3制備的基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)片狀導(dǎo)電基材鈦規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，鹽酸的濃度為0.25mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，鈦電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和鹽酸，得到沉積有聚吡咯的鈦電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的鈦電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為6.8，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為1.5ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米錐結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，得到基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例1制備的基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖如圖1所示。從圖中可以看出，鈦電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為高密度的納米錐結(jié)構(gòu)，且垂直于鈦電極表面生長。納米錐結(jié)構(gòu)頂端外徑75nm，垂直高度500nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例2

(1)片狀導(dǎo)電基材(導(dǎo)電玻璃)規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，鹽酸的濃度為0.25mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，導(dǎo)電玻璃電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和鹽酸，得到沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為8.2，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為0.9ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例2制備的基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖如圖2所示。從圖中可以看出，導(dǎo)電玻璃電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為200-1000nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例3

(1)片狀導(dǎo)電基材鈦規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，鹽酸的濃度為0.25mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，鈦電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和鹽酸，得到沉積有聚吡咯的鈦電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的鈦電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為5.2，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為2.0ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例3制備的基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料的sem圖如圖3所示。從圖中可以看出，鈦電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為1～50nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例4

(1)片狀導(dǎo)電基材導(dǎo)電玻璃規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，氯化鉀的濃度為0.2mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，導(dǎo)電玻璃電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和氯化鉀，得到沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為5.2，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為0.7ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例4制備的基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料中，導(dǎo)電玻璃電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為1～50nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例5

(1)片狀導(dǎo)電基材鈦規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，氯化鉀的濃度為0.2mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，鈦電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和氯化鉀，得到沉積有聚吡咯的鈦電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為5.2，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為1.5ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例5制備的基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料中，鈦電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為1～50nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例6

(1)片狀導(dǎo)電基材鈦規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，氯化鉀的濃度為0.2mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，鈦電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和氯化鉀，得到沉積有聚吡咯的鈦電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為6.8，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.1mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為0.9ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米錐結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米錐結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

實(shí)施例7

(1)片狀導(dǎo)電基材(導(dǎo)電玻璃)規(guī)格為10×10×1mm³，分別用去離子水、99.7％無水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分鐘；

(2)選用三電極模式，導(dǎo)電基材為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l，氯化鉀的濃度為0.2mol/l，采用計(jì)時(shí)電流法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電位(相對于參比電極)為0.8v，反應(yīng)時(shí)間為20秒，導(dǎo)電玻璃電極上沉積一層致密均勻黑色的聚吡咯，將其浸泡在去離子水中以除去表面沒有反應(yīng)的吡咯和鹽酸，得到沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極；

(3)選用三電極模式，沉積有聚吡咯的導(dǎo)電玻璃電極為工作電極，銅片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，電解質(zhì)溶液為吡咯和生物素的緩沖溶液(溶液的ph為7.8，pbs)，電解質(zhì)溶液中吡咯的濃度為0.2mol/l和生物素的濃度為0.2mol/l，采用計(jì)時(shí)電位法控制電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)電流為1.5ma，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘，納米顆粒結(jié)構(gòu)的聚吡咯/生物素復(fù)合物沉積在工作電極表面，即得到基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料。

實(shí)施例7制備的基于導(dǎo)電基材的納米顆粒結(jié)構(gòu)聚吡咯/生物素復(fù)合材料中，導(dǎo)電玻璃電極表面沉積的材料的結(jié)構(gòu)為納米顆粒結(jié)構(gòu)，粒徑為200-1000nm。本實(shí)施例制備的復(fù)合材料納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

應(yīng)用：

實(shí)施例1制備的材料浸泡在10ml的edc(0.095g)和nhs(0.061g)水溶液中，活化45分鐘之后用超純水沖洗3次。被活化的聚吡咯/生物素納米錐結(jié)構(gòu)膜浸泡在50μl的鏈霉親和素(20μg/ml)水溶液中常溫培養(yǎng)1小時(shí)，然后取出用超純水沖洗3次。最后接枝鏈霉親和素的聚吡咯浸泡在生物素改性的epcam抗體溶液(10μg/ml，1倍pbs為溶劑)中，在4℃環(huán)境中培養(yǎng)12個小時(shí)。用pbs溶液清洗3次之后，樣品浸泡于bsa蛋白質(zhì)溶液(1wt％，1倍pbs為溶劑)中室溫培養(yǎng)1小時(shí)，減少非特異性結(jié)合。最后用pbs洗三次。培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞hct-116、人乳腺癌細(xì)胞mcf7和宮頸癌細(xì)胞hela細(xì)胞的培養(yǎng)基包含體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清(fbs)的α-mem培養(yǎng)基。hct-116、mcf-7和hela細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5％co2的恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)溶液狀況，保持2天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞鋪展密度達(dá)到70-80％時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代或者接種于材料表面，細(xì)胞接種密度是2×105個/ml。共培養(yǎng)15分鐘之后，hct116細(xì)胞和mcf7細(xì)胞在材料表面大量粘附，hct116細(xì)胞在材料表面的細(xì)胞密度為260±25/mm²，mcf7細(xì)胞在材料表面的細(xì)胞密度為252±18/mm²。相反的，hela細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)很難粘附在epcam抗體功能化的聚吡咯納米錐結(jié)構(gòu)表面，在材料表面的細(xì)胞密度只有41±9/mm²。