需要獲得快速，流水線化且自動化檢測特定分析物的方法。在醫(yī)學(xué)環(huán)境中，這樣的方法將促進(jìn)諸如藥物、激素、信號傳導(dǎo)試劑和氨基酸等分析物的檢測。在農(nóng)業(yè)和公眾健康的情況下，抗生素、殺蟲劑或其它污染物的殘留水平的檢測也是我們食用的食物和飲用的水的安全性中不可或缺的部分。此外，近來食品標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的變化，例如"無激素"或"有機"也導(dǎo)致了農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中流線測試的需要。兒茶酚胺是維持人體健康狀態(tài)重要的必需激素或神經(jīng)遞質(zhì)。神經(jīng)疾病(例如帕金森氏病或阿爾茨海默病)常常改變血液中這些物質(zhì)的水平。變腎上腺素類(兒茶酚胺的衍生物)水平升高可指示某些癌癥，例如嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)生。類似地，變腎上腺素類(變腎上腺素和去甲變腎上腺素(normetanephrine))，甲狀腺激素(甲狀腺素T4，3,5,5'-三碘甲腺原氨酸T3，和3,3',5-三碘甲腺原氨酸rT3)，雌激素(雌酮、固醇、雌二醇和雌三醇)，δ-9-四氫大麻酚(THC)，其衍生物和代謝產(chǎn)物等，是對于臨床醫(yī)師確定患者狀態(tài)來說重要的許多其他生物學(xué)有意義的分析標(biāo)記物。傳統(tǒng)上，經(jīng)由放射免疫分析(RIA)來進(jìn)行兒茶酚胺的臨床定量。近年來，由于質(zhì)譜領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，測試平臺從RIA逐漸轉(zhuǎn)移至液相色譜質(zhì)譜(LCMS)。通常，基于LCMS的分析可提供快速、靈敏、分析物特異性讀數(shù)，這些是RIA分析可能缺少的。然而，兒茶酚胺是難以檢測的，因為它們易于被氧化降解。此外，現(xiàn)有技術(shù)兒茶酚胺/變腎上腺素的定量常常涉及復(fù)雜且繁瑣的提取過程，提取回收率不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致結(jié)果往往是不可靠的，并且具有高的定量下限(LLOQ)；例如LLOQ＞10ng/mL。而且，現(xiàn)有的提取過程不能提供可靠的樣品用于衍生化。藥物包括非法和合法藥物及其代謝物或衍生物。檢測這些化合物對于法醫(yī)或處方順應(yīng)性是非常重要的。此外，這些藥物可能在體液中不穩(wěn)定，因此檢測可能困難。在任何情況下，非常需要一種完全自動化和簡化的檢測/定量方法，該方法能使人為介入或誤差的空間最小。發(fā)明概述本發(fā)明提供了可用于測量生物樣品中的兒茶酚胺(多巴胺，腎上腺素，去甲腎上腺素)，變腎上腺素類(變腎上腺素和去甲變腎上腺素)，甲狀腺激素(T4，T3和rT3)，雌激素(雌酮，雌二醇，雌三醇)，大麻素如δ-9-四氫大麻酚(THC)，5-羥色胺，氨基酸，BPA以及許多其它含伯胺和仲胺、或者含酚的分子的水平的材料和方法。所需分析物可以通過質(zhì)譜(包括串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù))選擇性地、靈敏地檢測和測量。整個定量過程包括樣品的制備過程，采用固相提取以捕獲分析物，然后進(jìn)行分析物的化學(xué)衍生化，然后通過LC-MS/MS技術(shù)定量，如本文所述。在該工作期間發(fā)現(xiàn)，固相提取與Fmoc氯化物的化學(xué)衍生化和LC-MS/MS的組合提供血漿/血清樣品中10pg/ml或更低的兒茶酚胺水平的分析物特異性、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定且穩(wěn)健的測量。定量變腎上腺素類和甲狀腺激素的方法也被開發(fā)成具有相似的靈敏度和準(zhǔn)確性。敏感和準(zhǔn)確地測量這些分析物在臨床環(huán)境相關(guān)的水平是有用的，特別是在低皮克/毫升的范圍內(nèi)，在小樣本大小(100μl或更少的血漿/血清樣品)，用易于配置成自動化的簡單方法，且具有分析物特異性結(jié)果，而不會產(chǎn)生在其它分析技術(shù)，例如放射免疫測定法(RIA)中常見的任何分析物交叉。附圖的簡要說明圖1A和1B呈現(xiàn)了實施例數(shù)據(jù)，顯示內(nèi)標(biāo)當(dāng)量100pg(圖1A)和兒茶酚胺摻雜的血漿(圖1B)的色譜圖。圖2A和2B顯示了在10和100pg/ml每種兒茶酚胺獲得的數(shù)據(jù)。圖3提供了變腎上腺素類的色譜圖：頂部是變腎上腺素(659.210/268.400)，中間是去甲變腎上腺素(645.100/166.100)，下方是變腎上腺素(659.210/268.400)。圖4A,4B,4C,4D和4E顯示了變腎上腺素和去甲變腎上腺素中各種位移的圖譜。圖5A,5B,5C和5D顯示了甲狀腺激素每個位移的各個峰：具有5ng/ml當(dāng)量的血漿(圖5A)，血漿空白(圖5B)，血漿1ng/ml(圖5C)以及含1ng/ml的200μLBSA(圖5D)。圖6A,6B和6C顯示了甲狀腺激素T3在31.3pg/ml(圖6A)，rT3在31.3pg/mL(圖6B)，T4在31.3pg/ml(圖6C)各自的數(shù)據(jù)。圖7A,7B和7C提供了尿中11–去甲-9-羧基-δ-9-四氫大麻酚的定量的線性數(shù)據(jù)；1,000pg/ml(圖7A),100pg/ml(圖7B),10pg/ml(圖7C)。圖8A和8B提供了尿中11–去甲-9-羧基-δ-9-四氫大麻酚的定量的回收數(shù)據(jù)：回收-1,000pg/rxn標(biāo)準(zhǔn)品(圖8A)，回收1,000pg/rxn提取的峰(圖8B)。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法涉及提取、衍生化、檢測和/或定量來自樣品的分析物的方法。本發(fā)明的方法采用通過固相提取(SPE)、化學(xué)衍生過程結(jié)合檢測或定量感興趣的分析物的樣品清理(clean-up)過程以獲得分析物特異性、穩(wěn)健、快速、靈敏和準(zhǔn)確的結(jié)果。感興趣的分析物的衍生化將分析物從可能潛在地與樣品中的其他生物試劑重疊的區(qū)域轉(zhuǎn)移出去。因此，在檢測過程中，通常會妨礙準(zhǔn)確定量檢測感興趣的分析物的其它生物分子或污染物是在顯著不同的光譜范圍內(nèi)檢測(或者被完全洗脫)，允許精確定量感興趣的分析物。這種分析物檢測是有用的，例如在臨床、獸醫(yī)、法醫(yī)和/或環(huán)境設(shè)定中。本發(fā)明的方法可包括感興趣分析物的衍生化以及通過色譜和/或質(zhì)譜中至少一種確定一種或多種分析物的量。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法還包括從生物樣品固相提取(SPE)分析物。在一個方面中，推薦使用基于陽離子交換的SPE來俘獲含有胺的分析物。對于不含胺的分析物，采用基于反相二氧化硅吸附劑的SPE和蛋白碰撞，包括或不包括除去磷脂的過程，所述吸附劑可以是C4-C18烷基結(jié)合的二氧化硅，或者苯基結(jié)合的二氧化硅，或者聯(lián)苯基結(jié)合的二氧化硅。在其他實施方式中，可使用具有高pH(8≤pH≤14)的最終洗脫緩沖液從陽離子交換固相洗脫含胺的分析物，任選地原位衍生化含胺的感興趣的分析物，干凈地制備用于檢測和/或定量的分析物的衍生物。在另外的實施方式中，不含胺的分析物可通過非醇、水不混溶的有機溶劑(例如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等)從SPE吸附劑洗脫下來，然后在pH緩沖條件下直接衍生化分析物。在優(yōu)選的實施方式中，用于檢測含胺分析物的本發(fā)明方法包括陽離子交換SPE，從陽離子交換吸附劑洗脫高pH的含胺分析物，通過LC-MS/MS直接定量，或者原位衍生化，然后通過感興趣分析物的LC-MS定量；允許生物樣品在線轉(zhuǎn)換成初步分析物提取以檢測和/或定量。類似地，在檢測含非胺的分析物的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法包括基于反相SPE，有機洗脫，然后在高pH緩沖條件下直接衍生化，然后通過LC-MSMS定量。或者，在另一實施方式中，可采用基于陰離子交換SPE檢測具有羧基官能團的分析物，高pH洗脫緩沖液混合合適的有機溶劑如乙腈、DMF、丙酮、1,4-二噁烷、THF、NMP、DMSO等，接著分析物在pH緩沖條件下直接衍生化。還提供了用于檢測和/或定量分析的試劑盒。這些試劑盒可包括SPE柱(藥筒)和衍生化反應(yīng)試劑。任選地，這種試劑盒可還包括SPE調(diào)理溶劑，加樣緩沖液，洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，單獨或者一起，以及HPLC柱。本發(fā)明方法可廣泛檢測各種分析物的存在。分析物是感興趣樣品中發(fā)現(xiàn)的任何感興趣的化合物或組合物。更具體說，感興趣的分析物是具有伯胺或仲胺基團和/或酚基團的化合物。本文所述的分析物可以是藥物(非法和FDA批準(zhǔn)的)及其衍生物或代謝物，殺蟲劑及其衍生物或代謝物，環(huán)境污染物及其衍生物或代謝物，或生物化合物如激素、細(xì)胞因子、信號傳導(dǎo)試劑、氨基酸、膽固醇或其衍生物之一、脂肪酸或糖脂，以及它們的衍生物或代謝物。在一個實施方式中，分析物是單胺神經(jīng)遞質(zhì)，或其衍生物或代謝物。單胺的例子包括兒茶酚胺類[多巴胺(DA)、腎上腺素(EP)、去甲腎上腺素(NEP)]，或其衍生物或代謝物：變腎上腺素類[變腎上腺素(MNE)、甲變腎上腺素(NMN)]，其他痕量胺3-甲氧基酪胺(3-MT)、p-奧克巴胺、昔奈福林、酪胺、3,4-二羥基芐胺、3,4-二羥基扁桃酸、二羥基苯基乙二醇、DOPAL、DOPAC、高香草酸、羥基酪醇、3-甲氧基-4-羥基苯基二醇、MOPET、或去甲變腎上腺素、香草基扁桃酸、兒茶酚、多巴、組胺、5-羥色胺(5-HT)、3-碘代類甲腺質(zhì)(3-iodothyronamine)、β-苯乙胺、N-甲基苯乙胺、色胺、N-甲基色胺。在另一實施方式中，分析物是雌激素，包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌四醇(Estetrol)(E4)。在另一實施方式中，分析物是植物雌激素，包括黃豆苷元、芒柄花黃素、染料木黃酮(genistein)、鷹嘴豆素A(biochaninA)、擬雌內(nèi)酯(coumestrol)、4'-甲氧基擬雌內(nèi)酯、瑞索(repensol)、川服靈(trifoliol)或17-β-雌二醇。在另一實施方式中，分析物是大麻素或其衍生物或代謝物之一。大麻素或其衍生物或代謝物之一的例子包括大麻葛讓酚類(Cannabigerol-type)(CBG)大麻素，例如大麻葛讓酚、大麻葛讓酚單甲基醚、大麻橙花叔酸A(CannabinerolicacidA)、次大麻葛讓酚(Cannabigerovarin)、大麻葛讓酚酸A(CannabigerolicacidA)、大麻葛讓酚酸A單甲基醚和次大麻大麻葛讓酚酸A(CannabigerovarinicacidA)；大麻色烯類(Cannabichromene-type)(CBC)大麻素，例如(±)-大麻色烯、(±)-大麻色烯酸A、(±)-大麻次色烯(Cannabivarichromene)、(±)-次大麻色烯(Cannabichromevarin)或(±)-次大麻色烯酸A(CannabichromevarinicacidA)；大麻二醇類(Cannabidiol-type)(CBD)大麻素，例如(-)-大麻二醇、大麻二醇單甲基醚、大麻二醇-C4、(-)-次大麻二醇(Cannabidivarin)、大麻二醇可爾(Cannabidiorcol)、大麻二醇酸(Cannabidiolicacid)、次大麻二醇酸(Cannabidivarinicacid)；大麻諾醇類(Cannabinodiol-type)(CBND)大麻素，例如大麻諾醇(Cannabinodiol)或次大麻諾醇(Cannabinodivarin)；四氫大麻酚類(THC)大麻素，例如Δ9-四氫大麻酚、Δ9-四氫大麻酚-C4、Δ9-四氫次大麻酚、Δ9-四氫大麻可爾(Tetrahydrocannabiorcol)、Δ9-四氫-大麻酚酸A(cannabinolicacidA)、Δ9-四氫-大麻酚酸B、Δ9-四氫-大麻酚酸-C4A、Δ9-四氫-大麻酚酸-C4B、Δ9-四氫-次大麻酸A(cannabivarinicacidA)、Δ9-四氫-大麻酚醛酸A、Δ9-四氫-大麻酚醛酸B、(-)-Δ8-反-(6aR,10aR)-Δ8-四氫大麻酚、(-)-Δ8-反-(6aR,10aR)-四氫大麻酚酸A、(-)-(6aS,10aR)-Δ9-四氫大麻酚；大麻酚類(Cannabinol-type)(CBN)大麻素，例如大麻酚(Cannabinol)、大麻酚-C4、次大麻酚(Cannabivarin)、大麻酚-C2(Cannabinol-C2)、大麻酚可爾(Cannabiorcol)、大麻酚酸A(CannabinolicacidA)、大麻酚甲基醚；大麻三醇類(Cannabitriol-type)(CBT)大麻素，例如(-)-(9R,10R)-反-大麻三醇、(+)-(9S,10S)-大麻二醇、(±)-(9R,10S/9S,10R)-大麻二醇、(-)-(9R,10R)-反-10-O-乙基-大麻三醇、(±)-(9R,10R/9S,10S)-大麻三醇-C3、8,9-二羥基-Δ6a(10a)-四氫大麻酚、大麻二醇酸A大麻三醇酯(CannabidiolicacidAcannabitriolester)、(-)-(6aR,9S,10S,10aR)-9,10-二羥基-六氫大麻酚(cannabinol)、(-)-6a,7,10a-三羥基-Δ9-四氫大麻酚、10-氧-A6a(10a)-四氫大麻酚；大麻伊索因類(Cannabielsoin-type)(CBE)大麻素，例如(5aS,6S,9R,9aR)-大麻伊索因、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-大麻伊索因、(5aS,6S,9R,9aR)-大麻伊索因酸A、(5aS,6S,9R,9aR)-大麻伊索因酸B、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-大麻萜酚酸B、大麻葛根多爾-C3(Cannabiglendol-C3)、脫氫大麻呋喃(Dehydrocannabifuran)或大麻呋喃(Cannabifuran)；異大麻素，例如(-)-A7-反-(1R,3R,6R)-異四氫大麻酚、(±)-Δ7-1,2-順-(1R,3R,6S/1S,3S,6R)-異四氫次大麻酚或(-)-A7-反-(1R,3R,6R)-異四氫次大麻酚；大麻環(huán)酚類(Cannabicyclol-type)(CBL)大麻素，例如(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-大麻環(huán)酚、(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-大麻環(huán)酚酸A或(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-次大麻環(huán)酚(Cannabicyclovarin)；大麻西川類(Cannabicitran-type)(CBT)大麻素，例如大麻西川；以及大麻二氫色原酮類(Cannabichromanone-type)(CBCN)大麻素，例如大麻二氫色原酮、大麻二氫色原酮-C3或大麻二氫苯并呋喃酮(Cannabicoumaronone)。在另一實施方式中，分析物是甲狀腺激素或其衍生物或代謝物之一。甲狀腺激素或其衍生物或代謝物之一的例子包括3,3',5-三碘甲腺原氨酸T3)，3,5,5'-三碘甲腺原氨酸(rT3)，甲狀腺素(T4)。在另一實施方式中，分析物是阿片類試劑、阿片樣物質(zhì)或其衍生物或代謝物之一。阿片類試劑或阿片樣物質(zhì)或其衍生物或代謝物之一的例子包括天然存在的芐基異喹啉類生物堿(嗎啡和東罌粟堿)，半合成衍生物(氫嗎啡酮和羥嗎啡酮)，合成類阿片樣物質(zhì)(例如，丁丙諾啡、埃托啡，噴他佐辛)。在另一實施方式中，分析物是芳基環(huán)己胺或其衍生物或代謝物之一。芳基環(huán)己胺的例子包括替來他明、3-甲氧他胺(3-Methoxetamine)(MXE)、甲氧氯胺酮(Methoxyketamine)、N-乙基諾勒他明(norletamine)(愛科他明(Ethketamine))。在另一實施方式中，分析物是安非他明。安非他明的例子是安非他明(本身)、甲基安非他明(methamphetamine)、麻黃堿、卡西酮、3,4-亞甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，"迷幻劑")和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或"STP")。在另一實施方式中，分析物是氨基酸、人造氨基酸或小肽。氨基酸的例子包括但不限于：甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，GABA，色氨酸，半胱氨酸，絲氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，精氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，脯氨酸和蘇氨酸。在另一實施方式中，分析物是雙酚A(BPA)。本說明書的各方面部分公開了測試樣品。測試樣品是指可能含有感興趣的分析物的任何樣品。測試樣品可以是生物樣品，即，從任何生物來源獲得的樣品，如動物，植物，真菌，微生物，細(xì)胞培養(yǎng)物，器官培養(yǎng)物等。在本實施例的各方面，生物樣品包括血液樣品包括全血樣品，干燥的血液樣品，血漿樣品，血清樣品，唾液樣品，淚樣品，精液樣品，尿樣，腦脊髓液樣品，膽汁樣品，胚胎液樣品，組織樣品，或其它任何從生物來源獲得、提取或分離的樣品。這種生物樣品可以在醫(yī)療和臨床環(huán)境中從患者獲得；即，有生命的人，男性或女性，其將自己置于臨床環(huán)境中用于診斷、預(yù)后或治療疾病或病癥。樣品優(yōu)選地從患者獲得，例如，血漿樣本。血漿樣品可以使用或不使用抗凝劑采取。這樣的生物樣品可以從以下途徑獲得，例如在獸醫(yī)環(huán)境中，從動物，即寵物動物，農(nóng)場動物，或家畜，魚，或者任何其它生活在淡水、海洋或海中的動物，雄性或雌性，其將自己呈現(xiàn)在獸醫(yī)環(huán)境中用于診斷、預(yù)后，預(yù)防或治療疾病或病癥。樣品優(yōu)選地從動物獲得，例如，血漿樣本。血漿樣本可以使用或不使用抗凝劑采取測試樣品可以從以下途徑獲得，植物或任何植物來源，在農(nóng)業(yè)或環(huán)境設(shè)置中，從葉，或花，或莖，或果實，或種子，或芽，或樹皮或根等。測試樣品可以從以下途徑獲得，死亡的人體或死亡的動物，或死亡植株，或者曾經(jīng)活體的殘留，如取證環(huán)境，或在農(nóng)業(yè)環(huán)境中，或在環(huán)境設(shè)置或在考古環(huán)境中。測試樣品可以是血液樣品，或干燥的血液樣品，或任何其它體液樣品，或者任何其它干燥的體液樣品，或取自身體的任何地方的身體組織樣品或死亡的人，動物，或植物的殘留。測試樣品可以是環(huán)境樣品。環(huán)境樣品是從污物，植物物質(zhì)或流體源(如地下水，海洋或河流等)獲取的樣品。污物(也叫做"土樣")可以從農(nóng)業(yè)場所或具有環(huán)境意義的位置獲取，可提取分析物，包括除去微粒物質(zhì)。樣品可以通過任何已知方式獲取。樣品可以通過保存或預(yù)處理以確保感興趣分析物的穩(wěn)定性。這種保存可以通過化學(xué)(例如水解或pH調(diào)節(jié))或物理過程(例如冷藏或冷凍)實現(xiàn)。如果樣品是固體或組織，可以研磨、或提取、或純化、或過濾、或離心以從干擾組分分離感興趣的分析物?；蛘?，如果樣品是液體，優(yōu)選地，溶解、或懸浮在pH范圍從弱堿性到中性到弱酸性的溶液(或“加樣緩沖液”)中，例如pH為10-3，或者優(yōu)選9-4，或者優(yōu)選8-5，或者更優(yōu)選7-6，取決于感興趣的分析物和吸附劑化學(xué)性質(zhì)?？梢垣@得任意樣品體積，只要它有足夠的體積適用于本發(fā)明所述的方法。在本實施方式的各方面，樣品體積可以是，例如，約10μL、約25μL、約50μL、約75μL、約100μL、約125μL、約150μL、約175μL、約200μL、約225μL、約250μL、約275μL、約300μL、約325μL、約350μL、約375μL、約400μL、約425μL、約450μL、約475μL或約500μL。在本實施方式的其他方面，樣品體積可以是，例如，至少10μL、至少25μL、至少50μL、至少75μL、至少100μL、至少125μL、至少150μL、至少175μL、至少200μL、至少225μL、至少250μL、至少275μL、至少300μL、至少325μL、至少350μL、至少375μL、至少400μL、至少425μL、至少450μL、至少475μL、或至少500μL。在本實施方式的其他方面，樣品體積可以是，例如，至多10μL、至多25μL、至多50μL、至多75μL、至多100μL、至多125μL、至多150μL、至多175μL、至多200μL、至多225μL、至多250μL、至多275μL、至多300μL、至多325μL、至多350μL、至多375μL、至多400μL、至多425μL、至多450μL、至多475μL、或至多500μL。在本實施方式的甚至其他方面，樣品體積可以是，例如，約10μL到約至多100μL、約10μL到約至多200μL、約10μL到約至多300μL、約10μL到約至多400μL、約10μL到約至多500μL、約10μL到約至多600μL、約10μL到約至多700μL、約10μL到約至多800μL、約10μL到約至多900μL、約10μL到約至多1000μL、約50μL到約至多100μL、約50μL到約至多200μL、約50μL到約至多300μL、約50μL到約至多400μL、約50μL到約至多500μL、約50μL到約至多600μL、約50μL到約至多700μL、約50μL到約至多800μL、約50μL到約至多900μL、約50μL到約至多1000μL、約100μL到約至多200μL、約100μL到約至多300μL、約100μL到約至多400μL、約100μL到約至多500μL、約100μL到約至多600μL、約100μL到約至多700μL、約100μL到約至多800μL、約100μL到約至多900μL、或約100μL到約至多1000μL?？杉兓疚乃龅臏y試樣品。如本文所用，術(shù)語“純化的”、“純化”或“進(jìn)行純化”不是指從樣品中除去除了感興趣分析物之外的所有材料。相反，純化是指一種過程，其富集了一種或多種感興趣的分析物相對于可能干擾感興趣的分析物的檢測的樣品中的其它組分的量。通過多種方法純化樣品能夠相對減少一種或多種干擾物質(zhì)，例如，可能或可能不干擾所選擇的分析物的母離子或子離子的質(zhì)譜選擇的一種或多種物質(zhì)。所使用的術(shù)語相對減少并不要求需要純化的材料中任何與感興趣的分析物一起存在的物質(zhì)通過純化完全去除。當(dāng)檢測尿樣中的某些分析物(尤其是藥物)時，可能需要水解以除去可能阻止分析物的溶解和提取的葡萄糖醛酸苷鍵合。這種純化技術(shù)通常通過尿液的酶或酸水解來進(jìn)行?；蛘撸コ⒘Ｎ镔|(zhì)(例如，通過離心或過濾)，包括或不包括磷脂除去的蛋白質(zhì)沉淀(任選地通過“蛋白碰撞”方法)，可能是有用的純化技術(shù)。也可以進(jìn)行純化以產(chǎn)生或制備適用于衍生化反應(yīng)的反應(yīng)性氨基或酚基。這些方法包括酯或胺的水解，或糖的酸水解。這種通過預(yù)處理的純化不受限制，但用來制備用于固相提取的樣品。如本文所用，術(shù)語“固相提取”或“SPE”是指一種過程，在該過程中，基于溶解或懸浮在溶液(即流動相)中的組分對溶液通過或圍繞的固體(即固相)的親和力，化學(xué)混合物被分離成各組分。在某些情況下，當(dāng)流動相通過或繞過固相，流動相中不希望的組分被固相截留，導(dǎo)致流動相中分析物的純化。在其它情況下，分析物被固相截留，使得流動相中不希望的組分通過或圍繞固相。在這些情況下，使用第二流動相將保留的分析物從固相洗脫用于進(jìn)一步處理或分析。采用利用離子交換提取過程的SPE從樣品提取感興趣的分析物。這種分析物可以在某些緩沖液的pH范圍內(nèi)離子化。SPE可以采用基于分析物適合的各種特征進(jìn)行。諸如單胺神經(jīng)遞質(zhì)、或兒茶酚胺、或變腎上腺素、或氨基酸、或甲狀腺激素、或羧酸等分析物可以通過基于SPE的離子交換提取法進(jìn)行提取、保留或純化。更具體說，可采用強至弱的陽離子交換。采用陽離子交換的SPE是應(yīng)用于本發(fā)明從血漿樣品中提取感興趣分物析的方法的一個例子。具有基于二乙烯基苯-(DVB-)聚合物吸附劑的弱陽離子交換藥筒是兒茶酚胺類和變腎上腺素類的SPE的特別示例。采用基于強陽離子交換提取SPE的SPE也可用于從血漿樣品純化兒茶酚胺類和變腎上腺素類，使用填充DVB-基聚合物吸附劑的SPE藥筒，通過更強的洗脫溶劑。另外，基于二氧化硅的羧酸吸附劑可也用于從血漿樣品提取兒茶酚胺類或變腎上腺素類?；诙趸杌蛘咭环N或多種聚合物的強陽離子交換(磺酸化學(xué))吸附劑也可用于在SPE過程中提取兒茶酚胺類和變腎上腺素類。具有強陽離子交換吸附的SPE是甲狀腺激素(T3/rT3/T4)的SPE的特別示例。氨基酸分析物可以類似地用強陽離子交換吸附劑提取，不論是基于聚合物還是基于二氧化硅。陰離子交換聚合物可用于提取羧酸分析物、氨基酸分析物、或磺酸分析物、或膦酸分析物。本發(fā)明方法中用于提取兒茶酚胺類和變腎上腺素類的感興趣的具體的柱包括PWCX,1mL柱,10mg,96/Pk(目錄號6750-0101R)。對于甲狀腺激素，PSCX,1mL柱,10mg,96/Pk(目錄號687-0101R)是合適的。在另一些實施方式中，如果分析物不具有氨基，例如雌激素、或大麻素、或類黃酮，可采用反相基于二氧化硅的SPE柱或藥筒來提取、或純化、或保留選擇的分析物，。SPE/純化期間選擇的吸附劑可包括烷基結(jié)合的二氧化硅((C4,C8,C12和C18)，氰基結(jié)合的二氧化硅，苯基結(jié)合的二氧化硅，或聯(lián)苯基結(jié)合的二氧化硅。柱的尺寸可以變化，但具體是，柱體積可以優(yōu)選為50μL至3000μL，吸附劑加載為100μg至50mg。在另一實施方式中，更優(yōu)選的柱尺寸為100μL至2000μL，吸附劑加載為1mg至20mg。在另一實施方式中，更優(yōu)選的柱尺寸為200μL至1000μL，吸附劑加載為2mg至10mg。SPE柱(藥筒)的形狀和尺寸可以變化以適應(yīng)具體平臺。吸附劑的顆粒尺寸可進(jìn)一步有助于感興趣分析物的分離。在該實施方式的各方面，吸附劑的顆粒尺寸可具有0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、約30μm、約35μm、約40μm、約45μm、約50μm、約55μm、約60μm、約65μm、約70μm、或約75μm的平均直徑。在該實施方式的其他方面，吸附劑的顆粒尺寸可具有例如，至少0.5μm、至少1μm、至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、或至少75μm的平均直徑。在該實施方式的其他方面，吸附劑的顆粒尺寸可具有例如，至多0.5pm、至多1pm、至多5pm、至多10pm、至多15pm、至多20pm、至多25pm、至多30pm、至多35pm、至多40μm、至多45pm、至多50pm、至多55pm、至多60pm、至多65pm、至多70pm或至多75m的平均直徑。在該實施方式的其他方面，吸附劑的顆粒尺寸可具有，例如約0.5pm至約10pm、約0.5pm至約20pm、約0.5pm至約30μm、約0.5pm至約40pm、約0.5pm至約50pm、約0.5pm至約60pm、約0.5pm至約70pm、約0.5pm至約80pm、約1pm至約10pm、約1pm至約20μm、約1pm至約30pm、約1pm至約40pm、約1pm至約50pm、約1pm至約60pm、約1pm至約70pm、約1pm至約80pm、約5pm至約10pm、約5pm至約20pm、約5pm至約30pm、約5pm至約40pm、約5pm至約50pm、約5pm至約60pm、約5pm至約70pm、約5pm至約80pm、約10pm至約20μm、約10pm至約30pm、約10pm至約40pm、約10pm至約50pm、約10pm至約60pm、約10pm至約70pm、或約10pm至約80m的平均直徑。樣品可以與加載溶劑或加樣緩沖液一起加載到SPE柱上。加載溶劑可以是去離子水、或pH緩沖水溶液、或有機溶劑、或有機溶劑的混合物、或一種有機溶劑和去離子水的化合物、或多種有機溶劑和去離子水的混合物，或混有一種有機溶劑或有機溶劑的混合物的pH緩沖水溶液。pH緩沖水溶液可以是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、或磷酸鹽緩沖液、或碳酸鹽緩沖液、或琥珀酸鹽緩沖液、或酒石酸鹽緩沖液、或檸檬酸緩沖液、或甲酸緩沖液、或醋酸緩沖液、或另一種在典型的生化實驗室常用的緩沖溶液、或以下任意兩種或更多種的混合物，磷酸鹽緩沖液、或碳酸鹽緩沖液、或醋酸緩沖液、或甲酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、或琥珀酸鹽緩沖液、或酒石酸鹽緩沖液，或者，pH范圍從弱堿性到中性到弱酸性；例如具有pH范圍從10-3，更優(yōu)選9-4，或更優(yōu)選為8-5，或者甚至更優(yōu)選為7-6，濃度范圍為0.1mM-100mM，或更優(yōu)選為0.5mM-50mM，或更優(yōu)選為1mM-25mM，或更優(yōu)選為5-10mM。有機溶劑可選自乙腈、或丙酮，或1,4-二噁烷、或DMF、或四氫呋喃(THF)、或二乙醚、或乙酸乙酯、或乙酸甲酯、或甲酸乙酯、甲酸甲酯，或它們的混合物。在加載樣品至SPE柱時，流體被允許流過吸附劑，或通過重力或真空抽吸通過真空歧管，或氮氣或惰性氣體的壓力推動穿過正壓力歧管，伴有或不伴有空氣干燥過程。加載樣品的藥筒可以用溶劑進(jìn)一步洗滌。選擇的洗滌溶劑可以是去離子水，或pH緩沖水溶液，或有機溶劑，或有機溶劑的混合物，或有機溶劑與緩沖水溶液的混合物。有機溶劑可以是乙腈，或甲醇，或乙醇，或異丙醇，或丁醇，或乙醚，或丙酮，或1,4-二噁烷，或THF，或DMF，乙酸乙酯，或乙酸甲酯，或甲酸乙酯，或甲酸甲酯，或任何上述溶劑的混合物。一旦加載和洗滌，加載的藥筒可以用洗脫流體直接處理，或者首先通過干燥氮氣或者其他干燥惰性氣體通過藥筒進(jìn)行氣流干燥。本說明書的各方面部分公開了采用衍生化試劑原位衍生感興趣分析物。感興趣的分析物與衍生化試劑反應(yīng)以提供分析物的衍生物。該衍生物顯示改進(jìn)的HPLC行為，并顯著地改善了串聯(lián)MS/MS靈敏度。例如，本發(fā)明方法出人意料地實現(xiàn)了采用LC-串聯(lián)MS/MS技術(shù)，從血清樣品中定量兒茶酚胺、變腎上腺素、甲狀腺激素T3、rT3和T4時，接近或超過1000倍提高的檢測限和/或量化靈敏度。本文公開的衍生化試劑是可以與本文公開的分析物中的伯胺或仲胺、和/或酚羥基、和/或伯醇(羥基)基團、和/或芳基或烷基硫醇基團反應(yīng)的化合物。感興趣的衍生化試劑包括，但不限于，?；噭?，如化學(xué)式I所示。酰化試劑可包括酰氯或其他酰鹵。衍生化試劑也可以發(fā)熒光或參與比色反應(yīng)以助于結(jié)合的分析物的檢測。在一個實施方式中，采用FMoc氯化物或其變體進(jìn)行衍生化。術(shù)語“變體”在這里用來區(qū)分FMoc氯化物的變化形式，其例子部分地表現(xiàn)為式II。應(yīng)理解，F(xiàn)Moc氯化物的各種變體適用于根據(jù)本發(fā)明方法的分析物的衍生化。因此，下面討論的具體實施方式不是排他性的列舉。在一個實施方式中，本發(fā)明方法采用式II的FMoc氯化物：其中，各個R1,R2,R3和R4各自獨立地是H，鹵素原子，例如氟、氯、溴或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。在該實施方式的各方面，F(xiàn)MOC氯化物是：諸如上文方案1所示的FMoc氯化物的多重變體可用作平行衍生化試劑組，以在一個LCMS運行期間提供同時定量多種樣品的機會。在另一實施方式中，衍生化試劑可以是芐基碳酰氯(CBZ氯化物)或其變體(方案2)。一種變體是在苯環(huán)上具有取代基的CBZ氯化物，或者具有稠合環(huán)體系的取代的CBZ，其中，R1,R2,R3,R4,R5,R6和R7各自獨立地是H，鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。稠合環(huán)體系可以是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，例如萘、或苯并呋喃、或吲哚，具有5-7元稠合環(huán)，或者非芳香性的全碳環(huán)，或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)。適當(dāng)時稠合環(huán)可以被一種或多種以下基團取代：鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。在另一實施方式中，如方案3所示，衍生化試劑是苯甲酰氯或其變體。苯甲酰氯的變體是苯環(huán)上具有取代基的苯甲酰氯，或者具有稠合環(huán)體系的取代的苯甲酰氯，其中，R1,R2,R3,R4,R5,R6和R7各自獨立地是H，鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。稠合環(huán)體系可以是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，例如萘、或苯并呋喃、或吲哚，具有5-7元稠合環(huán)，或者非芳香性的全碳環(huán)，或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)。適當(dāng)時稠合環(huán)可以被一種或多種以下基團取代：鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。方案4中顯示的衍生化試劑的另一實施方式可以是苯磺酰氯或其變體。苯磺酰氯的變體可以是苯環(huán)上具有取代基的苯磺酰氯，或者具有稠合環(huán)體系的取代的苯磺酰氯，其中，R1,R2,R3,R4,R5,R6和R7各自獨立地是H，鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。稠合環(huán)體系可以是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，例如萘、或苯并呋喃、或吲哚，具有5-7元稠合環(huán)，或者非芳香性的全碳環(huán)，或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)。適當(dāng)時稠合環(huán)可以被一種或多種以下基團取代：鹵素原子如氟、或氯、或溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，低級烷基(直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基)，取代的乙烯基，直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。直鏈或支鏈C1-8烷基的例子包括例如，甲基、乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、己基、庚基、辛基等。在酰化試劑的另一實施方式中，可以是酰溴，酰氟，或4-硝基酚酯，或五氟酚酯，或?；溥?，或羥基琥珀酰亞胺酯(OSu)，或羥基琥珀酰亞胺鈉磺酸酯(磺基OSu)，或羥基苯并三唑酯(OBt)，或羥基-氮雜-苯并三唑酯(OAt)?；罨孽；噭┛梢栽谘苌磻?yīng)之前形成，或者可以在衍生化反應(yīng)過程期間通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適前體和活化試劑原位進(jìn)行。方案5提供的?；噭┦沁@些試劑范圍內(nèi)的一些例子，并不限制其范圍。其中，X是以下之一：Cl，Br，F(xiàn)，這些?；噭┛梢栽谘苌靶纬桑蛘咴谘苌陂g由合適的前體和偶聯(lián)試劑原位形成。方案5注意，多種?；噭┛梢云叫蟹绞绞褂靡匝苌喾N樣品中的相同分析物，然后合并成一個LCMS定量過程，這就叫做多路分析，以顯著提高設(shè)備操作效率并節(jié)約LC的溶劑。這些酰化試劑可以來自相同的化學(xué)類型或者來自不同的化學(xué)類型，如上所述。原位衍生化可以在以下節(jié)點進(jìn)行：從固相提取柱洗脫之前、洗脫期間、或剛好在洗脫后、或從臨洗脫前持續(xù)直到洗脫之后。洗脫可以用高pH洗脫溶液進(jìn)行。如本文所述，“高pH”包括具有堿性pH的洗脫溶液。在該實施方式的一個方面，洗脫溶液的pH為例如約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約10.5、約11、約11.5、約12、約12.5或約13。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的pH例如至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、至少10.5、至少11、至少11.5、至少12、至少12.5、或至少13。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的pH例如至多8、至多8.5、至多9、至多9.5、至多10、至多10.5、至多11、至多11.5、至多12、至多12.5或至多13。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的pH例如為約8至約9、約8至約9.5、約8至約10、約8至約10.5、約8至約11、約8至約11.5、約8至約12、約8至約12.5、約8至約13、約8.5至約9、約8.5至約9.5、約8.5至約10、約8.5至約10.5、約8.5至約11、約8.5至約11.5、約8.5至約12、約8.5至約12.5、約8.5至約13、約9至約9.5、約9至約10、約9至約10.5、約9至約11、約9至約11.5、約9至約12、約9至約12.5、約9至約13、約9.5至約10、約9.5至約10.5、約9.5至約11、約9.5至約11.5、約9.5至約12、約9.5至約12.5、約9.5至約13、約10至約10.5、約10至約11、約10至約11.5、約10至約12、約10至約12.5、約10至約13、約10.5至約11、約10.5至約11.5、約10.5至約12、約10.5至約12.5、約10.5至約13、約11至約11.5、約11至約12、約11至約12.5、或約11至約13。在另一實施方式中，洗脫采用較低的pH洗脫溶液進(jìn)行。如本文所用，“低pH”包括具有酸性pH的洗脫溶液。在該實施方式的一個方面，洗脫溶液的pH為例如約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6或約6.5。在該實施方式的另一方面，洗脫溶液的pH為例如至少2、至少2.5、至少3、至少3.5、至少4、至少4.5、至少5、至少5.5、至少6、或至少6.5。在該實施方式的另一方面，洗脫溶液的pH為例如至多2、至多2.5、至多3、至多3.5、至多4、至多4.5、至多5、至多5.5、至多6或至多6.5。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的pH為例如約2至約3、約2至約3.5、約2至約4、約2至約4.5、約2至約5、約2至約5.5、約2至約6、約2至約6.5、約2.5至約3、約2.5至約3.5、約2.5至約4、約2.5至約4.5、約2.5至約5、約2.5至約5.5、約2.5至約6、約2.5至約6.5、約3至約3.5、約3至約4、約3至約4.5、約3至約5、約3至約5.5、約3至約6、約3至約6.5、約3.5至約4、約3.5至約4.5、約3.5至約5、約3.5至約5.5、約3.5至約6、約3.5至約6.5、約4至約4.5、約4至約5、約4至約5.5、約4至約6、約4至約6.5、約4.5至約5、約4.5至約5.5、約4.5至約6、約4.5至約6.5、約5至約5.5、約5至約6、約5至約6.5、約5.5至約6、約5.5至約6.5、或約6至約6.5。在另一實施方式中，洗脫采用中性pH洗脫溶液進(jìn)行。在該實施方式的一個方面，洗脫溶液的pH為例如約6.5、約7、約7.5或約8。在該實施方式的另一方面，洗脫溶液的pH為例如至少6.5、至少7、至少7.5或至少8。在該實施方式的另一方面，洗脫溶液的pH為例如至多6.5、至多7、至多7.5或至多8。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的pH為例如約6.5至約7、約6.5至約7.5、約6.5至約8、約7至約7.5、約7至約8、或約7.5至約8。本文所公開的洗脫溶液可以采用具有堿性緩沖能力的任何緩沖劑緩沖。在該實施方式的各方面，本文公開的洗脫溶液可采用一種或混合的有機或無機緩沖劑，例如POPSO，TEA，磷酸緩沖。在該實施方式的其它方面，本文公開的洗脫溶液可以采用以下試劑緩沖，例如三烷基銨緩沖劑，包括例如，三烷基銨碳酸氫鹽，三烷基銨硼酸鹽，三烷基銨碳酸鹽，或三烷基銨磷酸鹽；銫緩沖劑，包括例如，碳酸氫銫，硼酸銫，碳酸銫，氫氧化銫，或二堿式磷酸銫，或三堿式磷酸銫；鉀緩沖劑，包括例如，碳酸氫鉀，硼酸鉀，碳酸鉀，氫氧化鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸鉀；鈉緩沖劑，包括例如，碳酸氫鈉，硼酸鈉，碳酸鈉，磷酸氫二鈉，磷酸三鈉，氫氧化鈉，或四硼酸鈉；四烷基銨緩沖劑，包括例如，四烷基銨碳酸氫鹽，四烷基銨硼酸鹽，四烷基銨碳酸鹽，或四烷基銨磷酸鹽，在水中，使用或不使用一種或多種如下的有機共溶劑，例如乙腈，或丙酮，或四氫呋喃(THF)，或1,4-二噁烷，或二甲基甲酰胺(DMF)，或N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或二甲亞砜(DMSO)，或六甲基磷酰胺(HMPA)，或乙醚，或異丙醇(IPA)，或叔丁醇，或2-丁醇等，以期望的比例，如處于/以下/或以上，5％或10％，或15％，或20％，或25％，或30％，或35％，或40％，或45％，或50％，或55％，或60％，或70％，或75％，或80％，或85％或90％，或95％的有機溶劑在水中。洗脫溶液中使用的緩沖劑的量可以是能夠有效維持緩沖劑的堿性緩沖能力的任意濃度。在該實施方式的各方面，緩沖劑的有效濃度為例如，約1.0mM、約5.0mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約200mM、約300mM、約400mM、約500mM、約600mM、約700mM、約800mM、或約900mM、或約1M。在該實施方式的其他方面，緩沖劑的有效濃度為例如至少1.0mM、至少5.0mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少200mM、至少300mM、至少400mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、或至少900mM或至少1M。在該實施方式的其他方面，緩沖劑的有效濃度為例如至多1.0mM、至多5.0mM、至多10mM、至多20mM、至多30mM、至多40mM、至多50mM、至多60mM、至多70mM、至多80mM、至多90mM、至多100mM、至多200mM、至多300mM、至多400mM、至多500mM、至多600mM、至多700mM、至多800mM、至多900mM或至多1M。在該實施方式的其他方面，洗脫溶液的有效濃度為例如約0.1mM至約10mM、約0.1mM至約25mM、約0.1mM至約50mM、約0.1mM至約75mM、約0.1mM至約100mM、約0.1mM至約200mM、約0.1mM至約300mM、約0.1mM至約400mM、約0.1mM至約500mM、約0.1mM至約1000mM、約1mM至約10mM、約1mM至約25mM、約1mM至約50mM、約1mM至約75mM、約1mM至約100mM、約1mM至約200mM、約1mM至約300mM、約1mM至約400mM、約1mM至約500mM、約1mM至約1000mM、約5mM至約25mM、約5mM至約50mM、約5mM至約75mM、約5mM至約100mM、約5mM至約200mM、約5mM至約300mM、約5mM至約400mM、約5mM至約500mM、約5mM至約1000mM、約10mM至約25mM、約10mM至約50mM、約10mM至約75mM、約10mM至約100mM、約10mM至約200mM、約10mM至約300mM、約10mM至約400mM、約10mM至約500mM、約10mM至約1000mM、約25mM至約50mM、約25mM至約75mM、約25mM至約100mM、約25mM至約200mM、約25mM至約300mM、約25mM至約400mM、約25mM至約500mM、約25mM至約1000mM、約50mM至約75mM、約50mM至約100mM、約50mM至約200mM、約50mM至約300mM、約50mM至約400mM、約50mM至約500mM、約50mM至約1000mM、約75mM至約100mM、約75mM至約200mM、約75mM至約300mM、約75mM至約400mM、約75mM至約500mM、約75mM至約1000mM、約100mM至約150mM、約100mM至約200mM、約100mM至約300mM、約100mM至約400mM、約100mM至約500mM、約100mM至約1000mM、約200mM至約300mM、約200mM至約400mM、約200mM至約500mM、約200mM至約1000mM、約250mM至約300mM、約250mM至約400mM、約250mM至約500mM、或約250mM至約1000mM。在另一實施方式中，洗脫緩沖劑的有效濃度為約5mM至約250mM。本文公開的洗脫溶液可包含本文公開的衍生化試劑。添加到本文所述洗脫溶液的衍生化試劑量是足以使得感興趣的分析物完全衍生化用于后續(xù)檢測的量。衍生化試劑可在洗脫之前與洗脫緩沖液混合，如原位衍生化過程那樣，它也可以剛好在洗脫之后加入洗脫液以進(jìn)行洗脫后衍生化過程。在一個實施方式中，通過對結(jié)合到固相吸附劑支持基質(zhì)的分析物施加包含衍生化試劑的高pH洗脫緩沖液可實現(xiàn)分析物的同時洗脫和衍生化。一旦施加洗脫溶液，發(fā)生將分析物轉(zhuǎn)化為其衍生物的衍生化反應(yīng)，然后當(dāng)分析物從固相支持基質(zhì)洗脫時，衍生物同時從吸附劑基洗脫。衍生化反應(yīng)可以在適合分析物的?；娜魏螚l件下進(jìn)行。在一個實施方式中，衍生化反應(yīng)在適合衍生化試劑連接到分析物的溫度條件下進(jìn)行。在該實施方式的各方面，衍生化反應(yīng)在以下溫度條件下進(jìn)行，約為或高于0℃至約為或低于100℃，更優(yōu)選約5℃至約90℃，更優(yōu)選地10℃至80℃，更優(yōu)選15℃至70℃，更優(yōu)選20℃至60℃，更優(yōu)選20℃至50℃。衍生化反應(yīng)在適合衍生化試劑連接到分析物的時間條件下進(jìn)行。在該實施方式的各方面，衍生化反應(yīng)以以下持續(xù)時間進(jìn)行，1分鐘至約24小時，更優(yōu)選3分鐘至約5小時，更優(yōu)選5分鐘至60分鐘，更優(yōu)選10分鐘至30分鐘。當(dāng)然，改變溫度可以改變反應(yīng)時間。例如，如果反應(yīng)加熱至(例如)40℃，反應(yīng)時間縮短。衍生化反應(yīng)可通過加入含有一種或多種緩沖劑的緩沖溶液淬滅。在一個實施方案中，緩沖劑是銨緩沖劑，如甲酸銨，或乙酸銨，或碳酸銨，或磷酸三銨，或硫酸銨，或硼酸銨，氫氧化銨，氯化銨，硫酸銨，碳酸氫銨，硫酸氫銨，雙銨磷酸酯等。在另一個實施例中，淬滅試劑也可以是緩沖的□-氨基酸溶液，如甘氨酸，丙氨酸，或緩沖的□-丙氨酸，或緩沖的伯胺溶液，例如濃度范圍從1mM至500mM，在水或水和有機溶劑的混合溶劑中，所述有機溶劑例如醇，例如，甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，或二醇，或丙三醇等等，或乙腈，或丙酮，或醚，或THF，或1,4-二噁烷，或DMF，或NMP，或DMSO，或HMPA。淬滅過程能夠中和洗脫溶液中仍然可能存在的大多數(shù)任意過量的衍生化試劑，也能夠通過降低反應(yīng)混合物的pH來穩(wěn)定產(chǎn)物。在該實施方式的各方面，包含衍生化分析物的洗脫劑的pH可降低至約4至約9.5。淬滅之后，包含衍生化分析物的反應(yīng)混合物可用于直接分析感興趣分析物的存在。這種分析可以是定性的或定量的性質(zhì)。在該實施方式的各方面，可采用例如色譜和/或質(zhì)譜檢測，直接分析含有衍生化分析物的洗脫劑中感興趣的分析物的存在。如本文所用，術(shù)語“色譜”是指這樣一種過程，化學(xué)混合物由液體或氣體攜帶，當(dāng)它們流經(jīng)或通過固定液相或固相時，基于化學(xué)實體的差別分布而分離成各組分。如本文所用，術(shù)語“液相色譜”或“LC”是指當(dāng)流體均勻滲濾通過細(xì)分物質(zhì)的柱或者通過毛細(xì)管道時，選擇性延遲流體溶液的一種或多種組分的過程。延遲是由于當(dāng)流體相對于固定相移動時，一種或多種固定相和本體流體(即流動相)之間混合物的各組分的分布導(dǎo)致的?！耙合嗌V”的例子包括反相液相色譜(RPLC)，高效液相色譜(HPLC)，超高壓液相色譜(UHPLC)和湍流液相色譜(TFLC)(有時稱為高紊度液相色譜)(HTLC)或高通量液相色譜，或納流液相色譜或納米LC。如本文所用，術(shù)語“高效液相色譜”或“HPLC”是指通過迫使流動相在壓力下通過固定相(通常是致密填充的柱子)來提高分離程度的液相色譜。如本文所用，術(shù)語“湍流液相色譜”或“TFLC”(有時稱為高湍流液相色譜(HTLC)或高通量液相色譜)指色譜的一種形式，它利用測定的物質(zhì)通過柱填充的湍流作為進(jìn)行分離的基礎(chǔ)。TFLC已經(jīng)應(yīng)用于制備包含兩種無名藥品的樣品然后用于質(zhì)譜分析。參見，例如Zimmer等,JChromatogr.A854:23-35(1999)；也可參見美國專利5,968,367,5,919,368,5,795,469和5,772,874，其進(jìn)一步解釋TFLC。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解"湍流"。當(dāng)流體流動得緩慢而平穩(wěn)，所述流被稱為"層流"。例如，以低流速移動通過HPLC柱的流體是層流。在層流中流體粒子的運動是有序的，其中顆粒大體上以直線移動。在更快的速度下，水的慣性克服流體的摩擦力而形成湍流。不和不規(guī)則邊界接觸的流體“超越(outrun)”摩擦減慢或被不均勻表面轉(zhuǎn)向的流體。當(dāng)流體以紊流流動時，其以旋渦和回旋(或渦流)流動，比流體是層流時具有更大的"阻力"。很多參考文獻(xiàn)可以用來幫助確定何時流體流動是層流或湍流(例如，湍流分析測量與預(yù)測(TurbulentFlowAnalysisMeasurementandPrediction),P.S.Bernard&J.M.Wallace,JohnWiley&Sons,Inc.,(2000)；湍流介紹(AnIntroductiontoTurbulentFlow),JeanMathieu&JulianScott,CambridgeUniversityPress(2001))。如本文所用，術(shù)語“氣相色譜”或“GC”是指其中樣品混合物被氣化并被注射入載氣流(如氮氣或氦氣)，所述載氣流移動通過包含由液體或微粒固體組成的固定相的柱并根據(jù)化合物對固定相的親和力分離成組分化合物的色譜。如本文所用，術(shù)語"大顆粒柱"或"提取柱"是指含有平均粒徑大于約50μm的色譜柱。如用在本文中，術(shù)語"約"表示±10％。如本文所用，術(shù)語"分析柱"是指具有充足色譜板的色譜柱，以實現(xiàn)從所述柱洗脫的樣品中材料的分離足以測定分析物的存在或含量。這種柱常常區(qū)別于"提取柱"，所述提取柱的一般目的是從非保留材料分離或提取保留的材料以獲得純化的樣品用于進(jìn)一步分析。如用在本文中，術(shù)語"約"表示±10％。某些液相色譜方法，包括HPLC，依賴于相對慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng)HPLC分析依賴于柱填充，其中樣品通過柱的層流是將感興趣分析物從樣品分離的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在這種柱中的分離是擴散過程并且可以選擇適用于感興趣分析物的HPLC設(shè)備和柱。色譜柱通常包括介質(zhì)(即填充材料)以利于化學(xué)物質(zhì)的分離(即分餾)。介質(zhì)可以包括微小顆粒。顆粒包括與各種化學(xué)物質(zhì)相互作用的結(jié)合表面以利于化學(xué)物質(zhì)的分離。一種合適的結(jié)合表面是疏水結(jié)合表面，例如烷基結(jié)合、氰基結(jié)合或五氟苯基丙基(F5)表面、或苯基/結(jié)合、或聯(lián)苯基結(jié)合表面。烷基結(jié)合表面可包括C-4，C-8，C-12或C-18結(jié)合烷基基團。在優(yōu)選實施方式中，柱是C-18柱。色譜柱包括用于從固相提取或HTLC柱直接或間接接收樣品的進(jìn)口以及用于排出包含分級的樣品的洗脫劑的出口。在某些實施方式中，分析物可以通過在感興趣分析物被柱填充材料可逆保留，而一種或多種其他材料不保留的條件下對柱施加樣品，在樣品中富集分析物。在這些實施方式中，可采用感興趣分析物被柱保留的第一流動相條件，然后采用一旦未保留材料被洗去，能夠從柱除去保留的材料的第二流動相條件?；蛘撸治鑫锟梢酝ㄟ^在感興趣分析物相對于一種或多種其他材料以差別速率洗脫的流動相條件下將樣品施加到柱上，而在樣品中富集。這種過程可以相對于一種或多種其他樣品組分富集一種或多種感興趣分析物的量。在另一實施方式中，分析物的反應(yīng)混合物可以首先加載到保護(hù)柱上，用弱溶劑以使所需的分析物產(chǎn)物保留在保護(hù)柱上，然后用LC洗脫溶劑負(fù)載物質(zhì)到分析柱上用于分離和分析。在一個實施方式中，樣品可以在進(jìn)口施加到LC柱，用溶劑或溶劑混合物洗脫，在出口排出?？蛇x擇不同的溶劑用于洗脫感興趣的分析物。例如，可采用梯度模式、等度模式、或多型(即混合)模式進(jìn)行液相色譜。在色譜期間，材料的分離通過諸如洗脫劑(也稱為“流動相”)的選擇、洗脫模式、梯度條件、溫度等變量實現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實施方式中，采用疏水柱色譜系統(tǒng)進(jìn)行HPLC。在某些優(yōu)選的實施方式中，采用C18分析柱(例如，C18,3m50x2.1，或等同物)。在某些實施方式中，采用HPLC級pH為3.0的含0.1％甲酸的5.0mM甲酸銨以及0.1％甲酸的乙腈溶液作為流動相。通過仔細(xì)選擇閥門和連接器管道，兩種或更多種色譜柱可以按需要連接，使得材料從一個通過到下一個而不需要任何手動步驟。在優(yōu)選的實施方式中，閥門和管道的選擇通過預(yù)編程序的計算機進(jìn)行控制以進(jìn)行該必要步驟。更優(yōu)選地，色譜系統(tǒng)還與檢測器系統(tǒng)(例如MS系統(tǒng))以在線方式連接。這樣，操作者可將一盤樣品置于自動取樣器中，剩余的操作在計算機控制下進(jìn)行，從而純化和分析所有選擇的樣品。在一些實施例中，可以在高通量的平臺使用固相提取，用于富集衍生化的感興趣分析物然后用于質(zhì)譜。在這種實施例中，可以使用高通量SPE藥筒或保護(hù)柱提取樣品，其捕獲衍生化的分析物，然后在分析型HPLC柱上洗脫，諸如C-18柱，然后進(jìn)行質(zhì)譜法(MS)分析。因為這些色譜過程中涉及的步驟可以以自動方式鏈接，使得分析物純化期間操作者參與的需求最小化。該特征可節(jié)省時間和成本，消除或降低操作者誤差的可能。直接定量是"在線"或"聯(lián)機"使用所提取和衍生化的分析物進(jìn)行定量。如本文所用，術(shù)語“在線”或“聯(lián)機”，例如在"聯(lián)機自動方式"或“聯(lián)機提取”中，是指不需要操作人員的干預(yù)的執(zhí)行過程。相反，術(shù)語"離線"在這里被用來指要求操作者手動干預(yù)的過程。因此，如果樣品發(fā)生沉淀，并且上清液然后被手動載入自動取樣器中，則沉淀和載入步驟是與隨后的步驟離線的。在該方法的各個實施方式中，一種或多種步驟可以聯(lián)機自動方式進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語"樣品注射"是指將等分單一樣品引入分析儀器，例如質(zhì)譜儀。這種引入可以直接或間接進(jìn)行。間接樣品注射可通過，例如，將等份樣品注入以在線方式連接到質(zhì)譜儀的HPLC柱來實現(xiàn)。如本文所用，相對多個分析物的質(zhì)譜分析的術(shù)語"相同的樣品注射"意味著通過測量來自同一(即相同)樣品注射的不同分析物的分子離子，基本同時檢測兩種或更多種不同分析物的分子離子。在各個實施方式中，測試樣品中存在的感興趣分析物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法離子化。采用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測，它包括離子源，用于電離分級的樣品并產(chǎn)生帶電分子用于進(jìn)一步分析。例如，樣品的電離可通過以下方式進(jìn)行，電子電離，化學(xué)電離，電噴射離子化(ESI)，光子電離，大氣壓化學(xué)電離(APCI)，光致電離，大氣壓光致電離(APPI)，快原子轟擊(FAB)，液體二次電離(LSI)，基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)，場致電離，場致解吸，熱噴霧/等離子噴霧電離，表面增強激光解吸電離(SELDI)，感應(yīng)耦合等離子體(ICP)和粒子束電離進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，電離方法的選擇可根據(jù)要測量的分析物，樣品類型，檢測器類型，正-負(fù)模式的選擇等選擇。如本文所用，術(shù)語"質(zhì)譜法"或"MS"是指鑒定化合物的分析技術(shù)。MS指過濾、檢測和根據(jù)其質(zhì)荷比或"m/z"測量離子的方法。MS技術(shù)一般包括：(1)使化合物電離以形成帶電化合物；和(2)檢測帶電化合物的分子量并計算質(zhì)荷比。化合物可以通過任何合適的方法離子化和檢測。"質(zhì)譜儀"一般包括電離器和離子檢測器。通常，一種或多種感興趣分子被電離，隨后離子被引入質(zhì)譜儀，在其中，由于磁場和電場的組合，所述離子依賴于質(zhì)量("m")和電荷("z")沿著路徑在空間移動。參見，例如美國專利6,204,500，標(biāo)題“來自表面的質(zhì)譜”("MassSpectrometryFromSurfaces")；6,107,623,標(biāo)題“串聯(lián)質(zhì)譜的方法和設(shè)備”("MethodsandApparatusforTandemMassSpectrometry")；6,268,144,標(biāo)題“基于質(zhì)譜的DNA診斷”("DNADiagnosticsBasedOnMassSpectrometry")；6,124,137,標(biāo)題“用于分析物的解吸附和檢測的表面改善的光不溫度連接和釋放("Surface-EnhancedPhotolabileAttachmentAndReleaseForDesorptionAndDetectionOfAnalytes")；Wright等,ProstateCancerandProstaticDiseases1999,2:264-76；以及MerchantandWeinberger,Electrophoresis2000,21:1164-67。如本文所用，術(shù)語"電霧化電離"或"ESI"是指這樣的方法，其中溶液沿著毛細(xì)管流動較短的長度到末端，末端被施加了高的正或負(fù)電勢。到達(dá)管末端的溶液被蒸發(fā)(霧化)噴射或噴霧成溶劑蒸汽中非常小的溶液液滴。這種霧滴流動通過汽化室，汽化室可被加熱以防止冷凝并以促進(jìn)溶劑蒸發(fā)。隨著液滴變得更小，電表面電荷密度增加，直到相同電荷之間的自然排斥引起離子以及中性分子被釋放。在一個實施例中，檢測在ESI之后進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語"大氣壓化學(xué)電離"或"APCI"是指與ESI相似的質(zhì)譜方法；然而，APCI通過在大氣壓下發(fā)生在等離子體中的離子-分子反應(yīng)產(chǎn)生離子。等離子體是通過放電維持在噴射毛細(xì)管與對電極之間。然后，利用一組差別泵送的撇渣器(skimmer)階段，離子通常被提取至質(zhì)量分析儀。逆流干燥和預(yù)熱的N2氣體可用于提高溶劑的去除。APCI中的氣相電離可以比ESI更有效地用于分析更小極性的種類。術(shù)語"大氣壓光致電離"或"APPI"如本文所用是指這種形式的質(zhì)譜法，其中分子M光致電離的機理是光子吸收和電子射出以形成分子的離子M+。因為光子能量通常恰在電離電壓之上，所述分子離子解離的可能性較小。在許多情況下，有可能分析樣品而無需進(jìn)行色譜分析，因此節(jié)省了大量時間和費用。在水蒸氣或質(zhì)子溶劑的存在下，分子離子可吸取H以形成MH+。這往往在M具有高質(zhì)子親合力時發(fā)生。這不影響量化精確度，因為M+與MH+之和是常數(shù)。質(zhì)子溶劑中的藥物化合物通常被視作MH+，而非極性化合物諸如萘或睪酮通常形成M+。參見，例如，Robb等,Anal.Chem.2000,72(15):3653-3659。如本文所用，術(shù)語"解吸"指分析物從液體表面的易位和/或分析物進(jìn)入氣相。激光解吸熱解吸是這樣一種技術(shù)，其中包含分析物的樣品熱解吸入氣相的激光脈沖。激光撞擊具有金屬基底的特制96孔板的背部。激光脈沖加熱基底并且熱使樣品轉(zhuǎn)移入氣相。然后將氣相樣品吸入質(zhì)譜儀中。如本文所用，術(shù)語"選擇的離子監(jiān)控"是一種質(zhì)譜儀的檢測模式，其中僅檢測相對窄質(zhì)量范圍內(nèi)的離子，一般是大約一個質(zhì)量單位。如本文所用，"多重反應(yīng)模式"，有時被稱為“選擇反應(yīng)監(jiān)控”，是一種質(zhì)譜儀的檢測模式，其中選擇性檢測先驅(qū)離子和一種或多種碎片離子。離子可采用幾種檢測模式進(jìn)行檢測。例如，所選離子可以采用即選擇性離子監(jiān)測模式(SIM)檢測，或者可選地，離子可使用掃描模式，例如多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)或選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)檢測。優(yōu)選地，質(zhì)/荷比采用四極分析器進(jìn)行測定。例如，在"四極"或"四極離子阱"儀器中，在振蕩射頻場中的離子經(jīng)歷的力正比于施加在電極之間的直流電勢，所述RF信號的振幅和質(zhì)/荷比?？梢赃x擇電壓和振幅，以致只有特定質(zhì)/離子荷比運行四極的長度，而所有其它離子是偏離的。因此，四極儀器可充當(dāng)注入到儀器的離子的"質(zhì)量過濾器"和"質(zhì)量檢測器"。可以通過利用“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“四極”提高M(jìn)S技術(shù)的分辨率。在這種技術(shù)中，從感興趣的分子的產(chǎn)生的前體離子(也稱為母離子)可在MS儀器中進(jìn)行過濾，并且前體離子隨后碎片化以產(chǎn)生一種或多種碎片離子(也稱為子離子或產(chǎn)物離子)，然后在第二MS過濾器和檢測器(四極)中分析。通過仔細(xì)選擇前體離子，僅僅由某些分析物產(chǎn)生的離子通過至碎裂室，其中與惰性氣體原子的碰撞產(chǎn)生碎片離子。因為前體和碎片離子在給定設(shè)置的電離/破碎條件下以可再現(xiàn)的方式產(chǎn)生，MS/MS技術(shù)可提供極其強大的分析工具。例如，過濾/碎片化組合可被用于消除干擾物質(zhì)，并且可特別用于復(fù)雜樣品諸如生物學(xué)樣品。質(zhì)譜儀一般給用戶提供離子掃描；即，給定范圍內(nèi)各個離子的相對豐度與特定質(zhì)/荷比(例如m/z:5-1250，對于API5000)。分析物分析(即質(zhì)譜)的結(jié)果可與通過各種本領(lǐng)域已知方法得到的原始樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)。例如，假定取樣和分析參數(shù)被仔細(xì)控制，給定離子的相對豐度可以與將相對豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量的表進(jìn)行比較?？蛇x地，分子標(biāo)準(zhǔn)品可與樣品一起運行，基于從那些標(biāo)準(zhǔn)品中產(chǎn)生的離子構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線，給定離子的相對豐度可被轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量。在某些優(yōu)選的實施方案中，可采用一種或多種內(nèi)標(biāo)來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計算感興趣分析物的量。產(chǎn)生和利用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法是本領(lǐng)域公知的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能選擇合適的內(nèi)標(biāo)。例如，可使用同位素標(biāo)記的兒茶酚胺作為內(nèi)標(biāo)；在某些優(yōu)選的實施方式中，可使用d6-腎上腺素和/或d6-去甲腎上腺素和/或d4-多巴胺作為內(nèi)標(biāo)。將離子的量與原始分子的量相關(guān)聯(lián)的許多其他方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。在特別優(yōu)選的實施方式中，感興趣的分析物采用MS/MS在樣品中定量。樣品中一種或多種感興趣的分析物在FMOC-Cl或其變體的存在下首先過濾通過固相提取柱并在高pH下從提取柱洗脫。然后將所得洗脫液進(jìn)行液相色譜，優(yōu)選HPLC。來自色譜柱的流動相進(jìn)入MS/MS分析儀加熱的ESI探針，分析物離子化。離子(例如先驅(qū)離子)穿過儀器的孔并且進(jìn)入第一個四極。四極1和3(Q1和Q3)是質(zhì)量過濾器，允許根據(jù)它們的質(zhì)荷比(m/z)選擇離子(即，在Q1和Q3分別選擇“先驅(qū)”和“碎片”離子)。四極2(Q2)為碰撞單元，其中離子被碎片化。質(zhì)譜儀的第一個四極(Q1)選擇感興趣分析物的質(zhì)荷比的分子。具有正確質(zhì)/荷比的前體離子被允許穿過進(jìn)入碰撞室(Q2)，而具有任何其它質(zhì)/荷比的不需要的離子與四極側(cè)面碰撞并被消除。進(jìn)入Q2的先驅(qū)離子與中性氬氣分子碰撞并碎片化。該過程被稱為碰撞活化分裂(CAD)或碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。所產(chǎn)生的碎片離子穿到四極3(Q3)，其中碎片離子被選擇而其它離子被除去。在單一樣品的分析期間，可以調(diào)節(jié)Q1和/或Q3使得針對一種兒茶酚胺特異性的一種或多種前體離子/碎片離子對的質(zhì)/荷比被首先選擇，然后在某一隨后的時間通過選擇針對第二中兒茶酚胺特異性的一種或多種前體離子/碎片離子對的質(zhì)/荷比，任選地在某一隨后的時間選擇針對第三種兒茶酚胺特異性的一種或多種前體離子/碎片離子對的質(zhì)/荷比，以此類推。在特別優(yōu)選的實施方式中，在單一樣品的分析期間，檢測針對腎上腺素特異性的前體/碎片離子對的質(zhì)荷比，針對去甲腎上腺素特異性的前體/碎片離子對的質(zhì)荷比，針對多巴胺特異性的前體/碎片離子對的質(zhì)荷比，針對變腎上腺素特異性的前體/碎片離子對的質(zhì)荷比，針對去甲變腎上腺素特異性的前體/碎片離子對的質(zhì)荷比，雖然可以以任意順序進(jìn)行檢測。該方法可包括在正或負(fù)離子模式下進(jìn)行MS/MS；優(yōu)選正離子模式。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠鑒定可用于四極3(Q3)的選擇的感興趣分析物的具體前體離子的一種或多種碎片離子。在各種實施方式中，感興趣的分析物進(jìn)行質(zhì)譜用于檢測和定量。質(zhì)譜技術(shù)可以采用大氣壓化學(xué)電離(APCI)或電噴射離子化(ESI)產(chǎn)生帶電離子。感興趣的分析物可以作為質(zhì)子加合物或質(zhì)子化分子離子，即[M+H+]在流動相中存在。如果流動相中存在豐富的銨離子，該分析物也可以顯示銨加合物[M+NH4+]作為分子離子，或者如果流動相中存在相應(yīng)的陽離子時顯示其他陽離子加合物。不同的加合物也是可能的，并且可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，通常顯示[M+A+H]+，其中A是加合物。所述加合物可以或可以不被溶劑化。在電離過程中，分子離子解吸附進(jìn)入氣相，然后聚焦進(jìn)入質(zhì)譜儀用于分析和檢測。關(guān)于APCI的更多信息參見US6,692,971，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。MS分析可以用單個質(zhì)量分析器，例如單個四極質(zhì)譜儀(MS)，或串聯(lián)質(zhì)量分析器，例如三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS)。在串聯(lián)質(zhì)譜分析模式中，第一質(zhì)量過濾器或四極(Q1)可以獨立地調(diào)節(jié)以選擇一種或多種感興趣分析物以及選擇的內(nèi)標(biāo)的分子離子。分子離子(先驅(qū)離子)可以在第二四極(Q2)發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離(CID)以產(chǎn)生碎片或產(chǎn)物離子。碎片離子可在Q3在第二質(zhì)量過濾器檢測和分析。該過程可以稱為產(chǎn)物優(yōu)化。然后調(diào)節(jié)第二質(zhì)量過濾器以選擇性地監(jiān)視來自具體分子離子的一種或多種最豐富的產(chǎn)物離子。這種技術(shù)被稱為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。下面顯示了兒茶酚胺的Fmoc衍生物的分子離子[M+NH4]，監(jiān)測兒茶酚胺的前體-產(chǎn)物離子對的MRM轉(zhuǎn)換，如下所示：內(nèi)標(biāo)，例如氘化的兒茶酚胺，可以應(yīng)用于本文描述的方法。在一個實施方式中，使用多巴胺-d4。在另一個實施方式中，使用腎上腺素-d6。在另一實施方式中，使用去甲腎上腺素-d6。MRM轉(zhuǎn)換對列出如下：多巴胺-D4(+)841179(+)841184腎上腺素-D6(+)873304(+)873179去甲腎上腺素-D6(+)859290(+)859202變腎上腺素和去甲變腎上腺素的Fmoc衍生物的分子離子[M+NH4+]以及前體-產(chǎn)物對的MRM轉(zhuǎn)換顯示如下：內(nèi)標(biāo)，例如氘代變腎上腺素，可應(yīng)用于本文所述的方法。在一個實施方式中，使用變腎上腺素-d6。在另一個實施方式中，使用去甲變腎上腺素-d6。MRM轉(zhuǎn)換對顯示如下：甲狀腺激素的Fmoc衍生物的分子離子[M+NH4+]顯示如下，監(jiān)測甲狀腺激素的前體-產(chǎn)物離子對的轉(zhuǎn)換，如下所示：甲狀腺激素的Fmoc衍生物的分子離子[M+H+]顯示如下，監(jiān)測甲狀腺激素的前體-產(chǎn)物離子對的轉(zhuǎn)換，如下所示：本文所述的方法中可使用內(nèi)標(biāo)。在一個實施方式中，使用3,3',5-三碘代-L-甲狀腺原氨酸-13C6(T3-13C6)。MRM轉(zhuǎn)換對如下所示：3,3',5-三碘代-L-甲狀腺原氨酸-13C6(T3-13C6)(+)定量1118.9701.8(+)驗證1118.9655.9下面顯示了THC的Fmoc衍生物的分子離子[M+NH4+]，監(jiān)測THC的前體-產(chǎn)物離子對的MRM轉(zhuǎn)換，如下所示：可以通過一些參數(shù)，包括例如，準(zhǔn)確度，精密度，檢測極限(LOD)定量，限制(LOQ)，線性范圍，特異性，選擇性，線性度，強度，和系統(tǒng)適用性，來評估本文所述的方法。方法的精度是分析方法的準(zhǔn)確性的度量，或測量值與作為常規(guī)真實值接受的值或者接受的參比值之間的一致性值的接近度。該方法的精度是當(dāng)過程重復(fù)應(yīng)用于同質(zhì)樣品的多個采樣時，個體測試結(jié)果間的一致性的程度。因此，精度評估1)在分析內(nèi)的變異性；2)天內(nèi)的變異性(可重復(fù)性)；以及3)日間的變異性(中間精度)；和4)在實驗室之間的變異性(重現(xiàn)性)。變異系數(shù)(CV％)是相對于觀察到的或者理論平均值表達(dá)的精度的定量度量。方法的檢測極限(LOD)指的是產(chǎn)生顯著不同于陰性對照或者空白的信號的分析物的濃度并且代表了可以從背景區(qū)分的分析物的最低濃度。本發(fā)明的定量限(LOQ)是指采用可接受的準(zhǔn)確度和精度測量的樣品中分析物的最低和最高濃度。定量的下限是指檢測方法可以恒定地從背景測量的最低劑量。定量的上限是指在發(fā)生信號飽和之前檢測方法能夠恒定地測量的最高劑量。方法的線性范圍是指定量的下限和上限之間的區(qū)域。線性范圍通過將定量的上限減去定量的下限來計算。如本文所用，術(shù)語“下漸近線的信噪比”是指在檢測下限該方法中檢測到的信號除以背景信號。如本文所用，術(shù)語“上漸近線的信噪比”是指在檢測上限該方法中檢測到的信號除以背景信號。如本文所用，體液樣品中分析物的“量”通常是指反映體液體積中可檢測的分析物的質(zhì)量的絕對值。然而，量也可以考慮相對于另一種分析物的量的相對量。例如，體液中分析物的量可以是大于正常存在的對照或正常水平的分析物的量。本發(fā)明方法和試劑盒可用于感興趣分析物的定量或檢測。本發(fā)明的各個方面也可描述如下：1.一種用于確定測試樣品中一種或多種分析物的存在的方法，所述方法包括：a)從所述測試樣品固相提取一種或多種分析物，b)用具有堿性pH、或酸性pH、或中性pH的洗脫溶液從所述固相提取洗脫所述一種或多種分析物，c)用衍生化試劑原位衍生所述一種或多種分析物，和d)采用液相色譜和/或質(zhì)譜檢測所述一種或多種衍生化的分析物。2.一種通過原位衍生化和LC-MSMS檢測優(yōu)化生物樣品中一種或多種分析物的固相提取(SPE)方案的方法。3.如實施方式1或?qū)嵤┓绞?所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是具有伯胺、仲胺或酚羥基的化合物。4.如實施方式1-3中任一項所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是藥物、激素、信號傳導(dǎo)試劑、氨基酸或殺蟲劑。5.如實施方式1-4中任一項所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是單胺神經(jīng)遞質(zhì)，包括兒茶酚胺或其衍生物或代謝物之一，性激素或其衍生物或代謝物之一，大麻素或其衍生物或代謝物之一，甲狀腺激素或其衍生物或代謝物之一，阿片試劑、阿片樣物質(zhì)或其衍生物或代謝物之一，或芳基環(huán)己胺或其衍生物或代謝物之一，安非他明或其衍生物或代謝物之一。6.如實施方式1-5中任一項所述的方法，其中，所述兒茶酚胺或其衍生物或代謝物之一是鄰苯二酚、多巴、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、3-甲氧基酪胺、p-奧克巴胺、昔奈福林、酪胺、3,4-二羥基芐胺、3,4-二羥基扁桃酸、二羥基苯基乙二醇、DOPAL、DOPAC、高香草酸、羥基酪醇、3-甲氧基-4-羥基苯基二醇、3-甲氧基酪胺(3-MT)、MOPET、去甲變腎上腺素、變腎上腺素或香草基扁桃酸。7.如實施方式5所述的方法，其中，所述單胺神經(jīng)遞質(zhì)是組胺、色胺、5-羥色胺或胍丁胺。8.如實施方式5所述的方法，其中，所述性激素或其衍生物或代謝物之一是雌激素。9.如實施方式8所述的方法，其中，所述雌激素是雌酮、雌二醇、雌三醇或雌四醇。10.如實施方式5所述的方法，其中，所述大麻素(cannabinoid)或其衍生物或代謝物之一是大麻葛讓酚類(Cannabigerol-type)(CBG)大麻素、大麻色烯類(Cannabichromene-type)(CBC)大麻素、大麻二醇類(Cannabidiol-type)(CBD)大麻素、大麻諾醇類(Cannabinodiol-type)(CBND)大麻素、四氫大麻酚類(Tetrahydrocannabinol-type)(THC)大麻素、大麻酚類(Cannabinol-type)(CBN)大麻素、大麻三醇類(Cannabitriol-type)(CBT)大麻素、大麻伊索因類(Cannabielsoin-type)(CBE)大麻素、異大麻素、大麻環(huán)酚類(Cannabicyclol-type)(CBL)大麻素、大麻西川類(Cannabicitran-type)(CBT)大麻素、或大麻二氫色原酮類(Cannabichromanone-type)(CBCN)大麻素。11.如實施方式1所述的方法，其中，所述甲狀腺激素或其衍生物或代謝物之一是3,3',5-三碘甲腺原氨酸(T3)，3,3',5'-三碘甲腺原氨酸(rT3)或甲狀腺素(T4)。12.如實施方式5所述的方法，其中，所述阿片試劑、阿片樣物質(zhì)、或阿片試劑或阿片樣物質(zhì)的衍生物或代謝物之一是嗎啡、東罌粟堿(oripavine)、嗎啡酮、氫嗎啡酮或羥嗎啡酮。13.如實施方式5所述的方法，其中，所述阿片試劑、阿片樣物質(zhì)、或阿片試劑或阿片樣物質(zhì)的衍生物或代謝物之一是芐基異喹啉生物堿，半合成芐基異喹啉類生物堿衍生物，或阿片樣物質(zhì)。14.如實施方式5所述的方法，其中，芳基環(huán)己胺或其衍生物或代謝物之一是替來他明、3-甲氧他胺(3-Methoxetamine)(MXE)、甲氧氯胺酮(Methoxyketamine)、N-乙基諾勒他明(norletamine)(愛科他明(Ethketamine))、安非他明、麻黃堿、或甲基安非他明。15.如實施方式5所述的方法，其中，安非他明或其衍生物或代謝物之一是安非他明(本身)、甲基安非他明(methamphetamine)、麻黃堿、卡西酮、3,4-亞甲二氧基-N-甲基安非他明(MDMA，"迷幻劑")和2,5-二甲氧基-4-甲基安非他明(DOM或"STP")。16.如實施方式1或3-15中任一項所述的方法，其中，所述固相提取采用離子交換柱或藥筒進(jìn)行。17.如實施方式16所述的方法，其中，所述離子交換柱是陽離子交換柱。18.如實施方式17所述的方法，其中，所述陽離子交換柱是弱陽離子交換柱。19.如實施方式17所述的方法，其中，所述陽離子交換柱是強陽離子交換柱。20.如實施方式16所述的方法，其中，所述離子交換柱是陰離子交換柱。21.如實施方式1或3-20中任一項所述的方法，其中，所述固相提取采用反相二氧化硅柱或藥筒進(jìn)行。22.如實施方式21所述的方法，其中，所述反相二氧化硅是烷基結(jié)合的(C4,C8,C12或C18)二氧化硅，氰基結(jié)合的二氧化硅，苯基結(jié)合的二氧化硅，或聯(lián)苯基結(jié)合的二氧化硅。23.如實施方式1-22中任一項所述的方法，其中，所述樣品是生物樣品、土壤樣品、或食物樣品。24.如實施方式23所述的方法，其中，所述生物樣品是血液樣品、唾液樣品，淚液樣品，尿液樣品或組織樣品。25.如實施方式24所述的方法，其中，所述血液樣品是全血樣品、血漿樣品或血清樣品。26.如實施方式1或3-25中任一項所述的方法，其中，所述堿性pH是大于約8的pH。27.如實施方式26所述的方法，其中，所述堿性pH是pH約8至約13的pH。28.如實施方式1-27中任一項所述的方法，其中，所述衍生化試劑是式I的?；噭?9.如實施方式28所述的方法，其中，所述酰化試劑是酰氯或酰鹵。30.如實施方式29所述的方法，其中，所述酰氯是式II的Fmoc氯化物：31.如實施方式30所述的方法，其中，R1,R2,R3和R4各自獨立地是H，氟，氯，溴，碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。32.如實施方式31所述的方法，其中，所述FMOC化合物在式III中顯示：其中，R1和R2各自獨立地是H，氟，氯，溴，碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。32.如實施方式31所述的方法，其中，F(xiàn)moc氯化物顯示如下：33.如實施方式29所述的方法，其中，所述酰氯是式VII顯示的Fmoc氯化物：34.如實施方式33所述的方法，其中，R1,R2,R3,R4和R5各自獨立地是H，鹵素原子如氟，氯，溴或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。35.如實施方式33所述的方法，其中，式VII顯示如下：其中，稠合環(huán)體系是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，任選地萘、喹諾酮、異喹啉、喹唑啉(quinzoline)、苯并呋喃、吲哚、苯并咪唑，具有5-7元取代或未取代的稠合環(huán)，或者非芳香性的碳環(huán)或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)，其中，所述稠合環(huán)適當(dāng)時可以被一種或多種以下的取代基取代：鹵素原子，任選地氟、氯、溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。36.如實施方式33所述的方法，其中，式VII是37.如實施方式29所述的方法，其中，?；噭┦牵浩渲?，R1,R2,R3,R4和R5各自獨立地是H，鹵素原子，任選地氟，氯，溴或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。39.如實施方式37所述的方法，其中，式VIII顯示如下：其中，稠合環(huán)體系是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，具有5-7元稠合環(huán)，或者非芳香性的碳環(huán)或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)，其中，所述稠合環(huán)適當(dāng)時可以被一種或多種以下的取代基取代：鹵素原子，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。40.如實施方式37所述的方法，其中，式VIII是苯甲酰氯：41.如實施方式29所述的方法，其中，所述?；噭┦鞘絀X：其中，R1,R2,R3,R4和R5各自獨立地是H，鹵素原子，任選地氟，氯，溴或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈或支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。43.如實施方式41所述的方法，其中，式IX是其中，稠合環(huán)體系是全碳環(huán)或雜環(huán)芳香體系，任選地萘、喹諾酮、異喹啉、喹唑啉(quinzoline)、苯并呋喃、吲哚、苯并咪唑，具有5-7元取代或未取代的稠合環(huán)，或者非芳香性的碳環(huán)或雜環(huán)稠合環(huán)體系，例如3,4-二氫-1H-茚，或3,4-二氫-2H-色烯，具有4-8元稠合環(huán)，其中，所述稠合環(huán)適當(dāng)時可以被一種或多種以下的取代基取代：鹵素原子，任選地氟、氯、溴、或碘，氰基，乙炔基，丙烯基，乙烯基，直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷基，取代的乙烯基，或直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-8烷氧基。44.如實施方式28所述的方法，其中，X是Cl、Br、F、45.如實施方式1-44中任一項所述的方法，其中，質(zhì)譜包括串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。46.如實施方式1-45中任一項所述的方法，其中質(zhì)譜包括LC-MS/MS技術(shù)。47.如實施方式46所述的方法，其中，LC-MS/MS技術(shù)包括大氣壓化學(xué)電離(APCI)或電噴霧電離(ESI)技術(shù)。48.如實施方式46所述的方法，其中，LC-MS/MS技術(shù)包括在多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，或選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，正離子模式中使用三重四極質(zhì)譜儀。49.如實施方式48所述的方法，其中，所述LC-MS/MS技術(shù)包括調(diào)節(jié)至選擇對應(yīng)于所需的一種或多種分析物的酰化衍生物的[M+H]+、或[M+NH4]+、或[M+A+H]+的前體離子的Q1掃描，其中，A是分子加合物，例如乙腈或H2O。50.如實施方式49所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是多巴胺，腎上腺素和去甲腎上腺素中至少一種，所述一種或多種分析物的酰化衍生物是三-Fmoc多巴胺(M+H]＝820，或[M+NH4]＝837)，三-Fmoc腎上腺素([M+H]＝850，或[M+NH4]＝867)，和三-Fmoc去甲腎上腺素([M+H]＝836或[M+NH4]＝853)。51.如實施方式49所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是變腎上腺素和去甲變腎上腺素中至少一種，所述一種或多種分析物的?；苌锸请p-Fmoc變腎上腺素([M+H]＝642,或[M+NH4]＝659)，和雙-Fmoc去甲變腎上腺素([M+H]＝628,或[M+NH4]＝645)。52.如實施方式49所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是甲狀腺素(T4)、3,3',5-三碘甲腺原氨酸(T3)和3,3',5'-三碘甲腺原氨酸(rT3)中至少一種，所述一種或多種分析物的?；苌锸请p-FmocT4[M+H]＝1222,或[M+NH4]＝1239),雙-FmocT3([M+H]＝1096,或[M+NH4]＝1113),和雙-FmocrT3([M+H]＝1096,or[M+NH4]＝1113)。53.如實施方式49所述的方法，其中，所述一種或多種分析物是δ-9-四氫大麻酚(THC)和11-去甲-9-羧基-d-9-四氫大麻酚(9-羧基-THC)中至少一種，δ-9-四氫大麻酚(THC)的酰化衍生物是Fmoc-THC([M+H]＝537,或[M+NH4]＝554)，11-去甲-9-羧基-d-9-四氫大麻酚(9-羧基-THC)的酰化衍生物是Fmoc-9-羧基-THC([M+H]＝567,[M+NH4]＝584)。54.如實施方式1-53中任一項所述的方法，其中，所述一種或多種分析物的檢測是定性或定量的。55.一種用于確定樣品中一種或多種分析物的量的方法，所述方法包括：在允許所述一種或多種分析物中至少一種衍生化的條件下，使用包含衍生化試劑的洗脫緩沖液將所述一種或多種分析物中至少一種從固相提取洗脫。56.一種用于確定一種或多種分析物的量的固相提取試劑盒，所述試劑盒包括：a)固相提取柱，和b)在相同或單獨容器中的含衍生化試劑的具有高pH的洗脫溶液。57.如實施方式57所述的試劑盒，其中，所述衍生化試劑是?；噭?。58.如實施方式57所述的試劑盒，其中，所述?；噭┦酋Ｂ然蝓｛u。59.如實施方式59所述的試劑盒，其中，所述酰氯是FMOC-Cl或其變體。60.如實施方式58所述的試劑盒，其中，所述酰氯是CBZ-Cl或其變體。61.如實施方式56-60中任一項所述的試劑盒，其中，所述固相提取柱是弱陽離子交換柱。62.如實施方式56-60中任一項所述的試劑盒，其中，所述固相提取物是強陽離子交換柱。63.如實施方式56-60中任一項所述的試劑盒，其中，所述固相提取柱是反相柱。64.如實施方式56-60中任一項所述的試劑盒，其中，所述固相提取柱是陰離子交換柱。實施例下面的非限制性實施例僅用于說明的目的，為了便于更全面地理解所公開的主題。這些實施例不應(yīng)被解釋為限制任何在本說明書中描述的實施例，包括那些關(guān)于用于檢測分析物的方法以及包括執(zhí)行所述方法必要的組件的試劑盒。實施例1血漿中兒茶酚胺的定量從人類患者的血液獲取血漿樣品。樣品被抽取(血漿肝素鈉&EDTA)至預(yù)冷的真空容器中。真空容器翻轉(zhuǎn)5次并冷藏直到離心。30分鐘收集時間內(nèi)血漿在冷藏的離心器中分離(1000xg，10分鐘)，然后在塑料小瓶中于-20立即凍存。血漿融化并稀釋，然后用于固相提取。空白、校準(zhǔn)樣品和血漿樣品中摻混內(nèi)標(biāo)(例如，多巴胺-D4，腎上腺素-D6和去甲腎上腺素-D6)。采用摻混已知量的兒茶酚胺的血漿溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。摻混溶液連續(xù)稀釋，然后加入從相同血漿樣品獲取的血漿中。采用0.5ml的甲醇，然后0.5ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)調(diào)理PWCXHP(1cc/10mg)柱(目錄號675-0101R)。將另一0.5ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)加入柱。然后，0.5ml10mM磷酸鹽緩沖液與100μL樣品混合。將樣品/緩沖液混合物以2-3psi壓力加載到柱上。柱在2-3psi用1ml去離子水洗滌，然后在6psi用1ml乙腈洗滌。采用0.5ml的洗脫緩沖液：4％w/vFMoc-Cl在25mMK2CO3溶質(zhì)在水和乙腈的溶液中(H2O:乙腈＝1:3)，從柱洗脫樣品。衍生化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行12分鐘。用20μL10mM的甲酸銨終止衍生化反應(yīng)。將從甲酸銨反應(yīng)獲得的25μL溶液直接用作樣品注入LC-MS/MS分析。對于LC-MS/MS分析，將從甲酸銨反應(yīng)獲得的25μL溶液自動注入C183μm粒徑50x2.1mm分析柱。對分析柱應(yīng)用二元HPLC梯度，將腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺的FMoc衍生物與樣品中包含的其他分析物分離開來。流動相A是含0.1％甲酸的5.0mM甲酸銨(pH3.0)，流動相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在35℃的溫度下進(jìn)行，流速為5分鐘內(nèi)500μl/分鐘：50％B；3.0分鐘,100％B,4.0分鐘100％B,4.5分鐘,50％B,5.0分鐘,50％B。采用由分析家(Analyst)軟件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多倫多)控制的API5000三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS。從HPLC分析柱出來的分析物通過流動相流動到MS/MS分析儀加熱的霧化器界面。溶劑/分析物混合物在界面加熱管道中轉(zhuǎn)化為蒸汽。霧化溶劑中的分析物通過加熱的電噴霧電離源進(jìn)行電離。離子傳送到第一個四極(Q1)，其選定具有由分析物之一產(chǎn)生的母離子的質(zhì)荷比的離子。進(jìn)入四極2(Q2)的離子與碰撞氣體碰撞以產(chǎn)生離子碎片，其被傳送至四極3(Q3)用于進(jìn)一步選擇。同時，對內(nèi)標(biāo)多巴胺-D4和/或腎上腺素-D6和/或去甲腎上腺素-D6進(jìn)行采用同位素稀釋質(zhì)譜的相同的過程。以下質(zhì)量轉(zhuǎn)變用于檢測和定量來自相同樣品注射的正極上確認(rèn)期間的腎上腺素，去甲腎上腺素和多巴胺(及其相應(yīng)的內(nèi)標(biāo))。衍生化兒茶酚胺的結(jié)果如下所示(銨加合物)。表2顯示了摻混有1ng/ml兒茶酚胺的血漿樣品的兒茶酚胺的百分回收率的數(shù)據(jù)。圖1A和1B呈現(xiàn)了實施例數(shù)據(jù)，顯示內(nèi)標(biāo)當(dāng)量1A(圖1A)和兒茶酚胺摻雜的血漿(圖1B)的色譜圖。如表2所示，F(xiàn)MOC-Cl衍生化兒茶酚胺的提取效率非常高。測試本發(fā)明檢測方法的線性時，測試摻混有感興趣兒茶酚胺的每個血漿樣品的重復(fù)品。圖2A和2B顯示了在10和100pg/ml獲得的數(shù)據(jù)。然而，讀取所有濃度時，兩種血漿樣品各自以及各個讀取的樣品一式兩份讀取。表4中總結(jié)的數(shù)據(jù)提供示例性線性回歸數(shù)據(jù)，用于定量血漿中的多巴胺，腎上腺素和去甲腎上腺素。實施例2：血漿中變腎上腺素類的定量變腎上腺素類方法和實施例數(shù)據(jù)從人類患者的血液獲取血漿樣品。樣品被抽取(血漿肝素鈉&EDTA)至預(yù)冷的真空容器中。真空容器翻轉(zhuǎn)5次并冷藏直到離心。30分鐘收集時間內(nèi)血漿在冷藏的離心器中分離(1000xg，10分鐘)，然后在塑料小瓶中于-20立即凍存。血漿融化并稀釋，然后用于固相提取?？瞻住⑿?zhǔn)樣品和血漿樣品摻混內(nèi)標(biāo)。采用摻混已知量的變腎上腺素的血漿溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。摻混溶液連續(xù)稀釋，然后加入從相同血漿樣品獲取的血漿中。采用0.5ml的甲醇，然后0.5ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)調(diào)理PWCX1cc10mg,96/pk(目錄號675-0101R)。0.5ml10mM磷酸鹽緩沖液與100μL樣品混合。將另一0.5ml的10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)加入柱。將樣品/緩沖液混合物以2-3psi壓力加載到柱上。柱在2-3psi用1ml去離子水洗滌，然后在6psi用1ml乙腈洗滌。采用0.5ml洗脫緩沖液；20μL100mg/mlFMOC-CI在50:50的100mMK2CO3:乙腈溶液中，從柱洗脫樣品。衍生化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行12分鐘。用20μL20:8050mMNH4CO3H:乙腈終止衍生化反應(yīng)。將從甲酸銨反應(yīng)獲得的25μL溶液直接用作樣品注入LC-MS/MS分析。對于LC-MS/MS分析，將從甲酸銨反應(yīng)獲得的25μL溶液自動注入C183μm粒徑50x2.1mm分析柱。對分析柱施加二元HPLC梯度，將變腎上腺素類與樣品中包含的其他分析物分離開來。流動相A是含0.1％甲酸的5.0mM甲酸銨(pH3.0)，流動相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在35℃的溫度下進(jìn)行，流速為5分鐘內(nèi)500μl/分鐘：50％B；3.0分鐘,100％B,4.0分鐘100％B,4.5分鐘,50％B,5.0分鐘,50％B。采用由分析家(Analyst)軟件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多倫多)控制的API5000三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS。從HPLC分析柱出來的分析物通過流動相流動到MS/MS分析儀加熱的霧化器界面。溶劑/分析物混合物在界面加熱管道中轉(zhuǎn)化為蒸汽。霧化溶劑中的分析物通過加熱的電噴霧電離源進(jìn)行電離。離子傳送到第一個四極(Q1)，其選定具有由分析物之一產(chǎn)生的母離子的質(zhì)荷比的離子。進(jìn)入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞以產(chǎn)生離子碎片，其被傳送至四極3(Q3)用于進(jìn)一步選擇。測量指示分析物之一的離子之后，Q1調(diào)節(jié)至選擇具有來自第二分析物的母離子的質(zhì)荷比的離子。這些離子在Q2中與氬氣碰撞，離子碎片進(jìn)入Q3用于進(jìn)一步選擇。以下質(zhì)量轉(zhuǎn)變用于檢測和定量來自相同樣品注射的正極上驗證期間的變腎上腺素類。同樣，百分回收率非常高，如表6所示。圖4A-4E顯示變腎上腺素的圖譜。實施例3：血漿中甲狀腺激素的定量甲狀腺激素(T3,rT3,T4)方法和實施例數(shù)據(jù)樣品的制備按照實施例1進(jìn)行，不同的是樣品摻混甲狀腺激素和合適的內(nèi)標(biāo)。采用1.0mL的甲醇，然后是1.0mL的2％甲酸(水溶液)調(diào)理PSCX1cc10mg(目錄號687-0101R,96/pk)柱。0.5mL13％乙腈的2％甲酸(水溶液)溶液與200μL樣品混合。0.5mL13％乙腈的2％甲酸溶液加入柱。將樣品/緩沖液混合物以2-3psi壓力加載到柱上。柱在3psi用1ml50％乙腈(水溶液)洗滌，然后在6psi用1ml乙腈洗滌。采用高壓的氮氣流，柱干燥30秒。柱用1ml10mM碳酸鉀pH11.9，在3psi洗滌。采用0.5ml的洗脫緩沖液[100mM碳酸鉀(水溶液，pH11.9):乙腈]將樣品從柱洗脫，洗脫后加入20μL100mg/mlFMOC-Cl的乙腈溶液。衍生化反應(yīng)在室溫下進(jìn)行25分鐘。用20μL20:8050mMNH4CO3H(水溶液):乙腈終止衍生化反應(yīng)。反應(yīng)混合物無需處理直接用于定量。對于LC-MS/MS分析，將20μL衍生化反應(yīng)混合物的溶液注入C183μm粒徑50x2.1mm分析柱。對分析柱施加二元HPLC梯度，將甲狀腺激素類與樣品中包含的其他分析物分離開來。流動相A是pH3.0的20.0mM甲酸銨，流動相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在40℃的溫度下進(jìn)行，流速為5分鐘內(nèi)500μl/分鐘：0.01分鐘,60％B；7.5分鐘,85％B,7.6分鐘,95％B；7.9分鐘,95％B,8.0分鐘,60％B；9.0分鐘,60％B。采用分析家(Analyst)軟件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多倫多)控制的API5000三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS。從HPLC分析柱出來的分析物通過流動相流動到MS/MS分析儀加熱的霧化器界面。溶劑/分析物混合物在界面加熱管道中轉(zhuǎn)化為蒸汽。霧化溶劑中的分析物通過加熱的電噴霧電離源進(jìn)行電離。離子傳送到第一個四極(Q1)，其選定具有由分析物之一產(chǎn)生的母離子的質(zhì)荷比的離子。進(jìn)入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞以產(chǎn)生離子碎片，其被傳送至四極3(Q3)用于進(jìn)一步選擇。測量指示分析物之一的離子之后，Q1調(diào)節(jié)至選擇具有來自第二分析物的母離子的質(zhì)荷比的離子。這些離子在Q2中與氬氣碰撞，離子碎片進(jìn)入Q3用于進(jìn)一步選擇。以下質(zhì)量轉(zhuǎn)變用于檢測和定量來自相同樣品注射的正極上驗證期間的甲狀腺激素類。圖5A-5D和圖6A-6C提供了甲狀腺激素類的示例性圖譜。表9提供了用于甲狀腺激素類的定量的示例性線性回歸數(shù)據(jù)。1標(biāo)準(zhǔn)曲線的二次回歸(1/x權(quán)重)Rep代表接收實施例4衍生化THC本文所述的方法來在THC上進(jìn)行。如下所述在從SPE柱洗脫期間衍生化THC：尿液中11-去甲-9-羧基-δ-9-四氫大麻酚的定量方法和實施例數(shù)據(jù)尿液水解：將尿液樣品(2mL)與KOH(水溶液,10M,100uL)在60℃混合15分鐘，加入IS，冷卻至室溫。2000rpm離心2分鐘。獲得澄清溶液用于下一步驟。固相提取柱[填充吸附劑的狹窄孔(10BPC-SAX,2.5mg)]用甲醇(0.5mL)和洗滌緩沖液(H2O:乙腈:NH4OH＝85:15:1,0.5mL)平衡。加入水解的尿液樣品(前一步驟，0.5mL)，氮氣壓力下(<15psi)2分鐘內(nèi)通過柱。柱相繼用洗滌緩沖液(H2O:乙腈:NH4OH85:15:1,0.5mL)，甲醇(0.5mL),乙酸乙酯洗滌，然后在氮氣流下于30psi干燥3分鐘。然后，分析物用洗脫緩沖液[己烷:乙酸乙酯:乙酸(冰)＝80:18:2,100μL]洗脫，在氮氣流下干燥(40℃)。將干燥的提取分析物用芴基甲氧羰基氯化物(FMOC-Cl,1.6mg/mL，在ACN中,50μL)重懸，渦旋，然后加入碳酸鉀(水溶液，100mM,50μL)，渦旋。反應(yīng)進(jìn)行25分鐘，然后用終止緩沖液[NH4CO3H(水溶液,50mM):乙腈＝1:4,10μL]重懸。對于LC-MS/MS分析，將20μL衍生化反應(yīng)混合物的溶液注入C183μm粒徑50x2.1mm分析柱。對分析柱施加二元HPLC梯度，將甲狀腺激素類從樣品中包含的其他分析物分離開來。流動相A是pH3.0的20.0mM甲酸銨，流動相B是含0.1％甲酸的乙腈。HPLC梯度在40℃的溫度下進(jìn)行，流速為5分鐘內(nèi)500μl/分鐘：0.01分鐘,40％B；3.0分鐘,90％B；4.0分鐘,90％B；4.1分鐘,40％B,5.0分鐘,40％B。采用分析家(Analyst)軟件版本1.52(ABI-SCIEX，加拿大多倫多)控制的API5000三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS。從HPLC分析柱出來的分析物通過流動相流動到MS/MS分析儀加熱的霧化器界面。溶劑/分析物混合物在界面加熱管道中轉(zhuǎn)化為蒸汽。霧化溶劑中的分析物通過加熱的電噴霧電離源進(jìn)行電離。離子傳送到第一個四極(Q1)，其選定具有由分析物之一產(chǎn)生的母離子的質(zhì)荷比的離子。進(jìn)入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞以產(chǎn)生離子碎片，其被傳送至四極3(Q3)用于進(jìn)一步選擇。測量指示分析物之一的離子之后，Q1調(diào)節(jié)至選擇具有來自第二分析物的母離子的質(zhì)荷比的離子。這些離子在Q2中與氬氣碰撞，離子碎片進(jìn)入Q3用于進(jìn)一步選擇。以下質(zhì)量轉(zhuǎn)變用于檢測和定量來自相同樣品注射的正極上驗證期間的甲狀腺激素類。表1示出10至1000ng/反應(yīng)時尿液中11-去甲-9-羧基-δ-9-四氫大麻酚的二次線性回歸。圖7A-7C示出了1000pg/ml，100pg/ml和10pg/ml的示例性線性數(shù)據(jù)的色譜圖。圖8A(標(biāo)準(zhǔn)品)和8B(提取的樣品)顯示分析物的回收率的色譜圖。該數(shù)據(jù)也被反映在表12中?；诒疚奶峁┑臄?shù)據(jù)，清楚的是，該過程同時提供了以下優(yōu)點：樣品處理時間短，自動化兼容，通過衍生化提供了對于氧化的化學(xué)保護(hù)，導(dǎo)致提取回收率高；由于衍生物的高親脂性使得HPLC行為改善；由于衍生物的分子量高得多MS/MS靈敏度大大提高，LLOQ10pg/mL，即定量靈敏度提高超過1000倍。這些優(yōu)點對于高pH洗脫是出乎意料的，因為兒茶酚胺的穩(wěn)定性隨著pH升高而降低，在堿性介質(zhì)中破壞變得非?？焖?。還認(rèn)識到，使用高M(jìn)S敏感衍生化允許篩選，優(yōu)化固相萃取的方法，包括吸附劑、加樣緩沖液、洗滌溶液、最終洗脫緩沖液的選擇，以及每個步驟的過程。最后，應(yīng)該理解的是，雖然本說明書的各方面通過參照特定實施例突出顯示，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，這些公開的實施例僅僅闡述說明這里公開的主題的原理。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所公開的主題并不局限于特定的方法，協(xié)議和/或本文描述的試劑等。這樣，所公開的主題的各種修改或改變或替代結(jié)構(gòu)可根據(jù)本文中的教示而不脫離本說明書的精神。最后，在此使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體實施例的目的，而不是用來限制本發(fā)明的范圍，其僅由權(quán)利要求書限定。因此，本發(fā)明并不限于具體所示和所述的內(nèi)容。本文描述了本發(fā)明的某些實施方式，包括本發(fā)明人已知的實施本發(fā)明所需的最佳模式。當(dāng)然，閱讀以上說明書后，所述實施方式的變型將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所明白的。本發(fā)明人預(yù)期，普通技術(shù)人員將適當(dāng)?shù)乩眠@些變型，本發(fā)明人旨在使本發(fā)明在本文具體描述之外以其他方式進(jìn)行實施。因此，根據(jù)申請原則，本發(fā)明包括所附權(quán)利要求書所涉及主題的所有改進(jìn)和等同形式。而且，所有可能的變型中上述要素的任意組合包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，除非另有說明或者清楚指出相反。本文所述本發(fā)明可選的實施方式、要素或步驟的分組不應(yīng)解釋為限制性的。每個組成員都可被單獨提到或要求保護(hù)，或與本文公開的其他組成員的任何組合。預(yù)計出于便利和/或?qū)＠缘脑?，組中可以包括或者刪除一個或多個成員。在發(fā)生任何這種包括或者刪除時，認(rèn)為說明書包括經(jīng)修飾的組，因而滿足所附權(quán)利要求書中使用的所有馬庫什組(Markushgroup)的書寫描述。除非另有說明，本說明書和權(quán)利要求書所用的表示特征、項目、數(shù)量、參數(shù)、性質(zhì)、屬性術(shù)語等等的所有數(shù)值應(yīng)理解為在所有情況下均被術(shù)語“約”修飾。如本文所用，術(shù)語“約”表示限定的特征、項目、數(shù)量、參數(shù)、屬性涵蓋了所述特征、項目、數(shù)量、參數(shù)、特性或?qū)傩缘闹翟谥匣蛑录由匣驕p去10％。因此，除非有相反說明，以下說明書和所附權(quán)利要求中所述的數(shù)值參數(shù)是近似值。例如，質(zhì)譜分析儀可以在測定給定分析物的質(zhì)量時輕微變化，術(shù)語離子質(zhì)量或離子的質(zhì)/荷比的“約”是指+/-0.50原子質(zhì)量單位。并非試圖限制等同原則應(yīng)用于權(quán)利要求的范圍，最起碼的，每個數(shù)值至少應(yīng)根據(jù)所記錄的有效數(shù)字的位數(shù)并考慮到運用了常用的取整規(guī)則進(jìn)行解釋。使用術(shù)語"可"或"可能"參考一個實施方式或?qū)嵤┓绞降囊环矫孢€攜帶有“不”或“不能”的替代含義。這樣，如果本說明書公開的實施方式或?qū)嵤┓绞降囊环矫婵梢允腔蛘呖杀话鳛楸景l(fā)明的主題的一部分，則負(fù)面限制或排除條件也被明確地表示，也就是說一個實施方式或者實施方式的一個方面可以不是或不能被包含作為本發(fā)明的主題。以類似的方式，使用術(shù)語"任選地"參考一個實施方式或?qū)嵤┓绞降囊环矫嬉馕吨@樣的實施方案或?qū)嵤┓绞降姆矫婵梢员话ㄗ鳛楸景l(fā)明主題的部分或可不被包括作為本發(fā)明的主題。無論這種負(fù)面限制或是禁入條件應(yīng)用將基于負(fù)面限制或排除條件敘述在所要求保護(hù)的主題。雖然限定本發(fā)明寬泛范圍的數(shù)值范圍是近似值，但是具體實施例中列出的數(shù)值范圍和值是盡可能準(zhǔn)確記錄的。然而，任何數(shù)值范圍或值不可避免地包含由其各自的測量過程中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差所必然造成的某些誤差。本文中對數(shù)值范圍的引用僅僅是一種速記方法，單獨表示落在該范圍內(nèi)的各個獨立的值。除非另有說明，否則，各個獨立的數(shù)值范圍包括在說明書范圍內(nèi)，如同它們被單獨引用。描述本發(fā)明的內(nèi)容時使用的術(shù)語“一個”、“一種”、“該”等類似表達(dá)(尤其在權(quán)利要求書的內(nèi)容中)應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非另有說明或者清楚指出相反。所有本文所述的方法可以任何合適的順序進(jìn)行，除非另有說明或上下文明確另有所指。本文涉及的任何和所有實施例，或者示例性的語言(例如，“例如”)的使用僅僅是為了更好地闡述本發(fā)明，而不是對本發(fā)明范圍的限制。說明書中的所有語言都不應(yīng)解釋為指示對本發(fā)明實踐所必需的非要求的元素。本文所揭示的具體實施方式可以進(jìn)一步被限制在權(quán)利要求書中使用“由…組成”或“基本由…組成”的用語。當(dāng)在權(quán)利要求中使用時，無論是提交時的或是在每次修改添加，所述的過渡術(shù)語“由…組成”不包括沒有在該權(quán)利要求中指定的任何元件，步驟或成分。過渡術(shù)語“基本由…組成”將權(quán)利要求的范圍限制到指定的物質(zhì)或步驟以及本質(zhì)上不影響基本和新特征的那些。所述的本發(fā)明的實施方式固有地或明確地描述并且能夠在本文中實現(xiàn)。所有的專利，專利出版物和其它出版物引用和標(biāo)識在本說明書中被單獨和明確地以引用方式全文并入本文，用于描述和公開的目的，例如，這些出版物中描述的組合物和方法可以與本發(fā)明結(jié)合使用。提供本文討論的出版物僅針對其在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_。在這方面，不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明人無權(quán)憑借先前發(fā)明或任何其它原因占先于這些公開。因此，所有關(guān)于日期或表示為這些文檔的內(nèi)容的聲明是基于申請人可獲得的信息，不構(gòu)成對這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何認(rèn)可。當(dāng)前第1頁1 2 3