專利名稱：北美人參餾分的制備方法、含有它們的產(chǎn)物以及作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備北美人參(西洋參)餾分的化學(xué)方法和含有這些餾分的組合物。本發(fā)明的產(chǎn)物可以用于刺激抗體生成，或作為靶向治療劑用于以免疫力低下為特征的病癥，例如感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS、癌癥等。本發(fā)明的產(chǎn)物還可以給接受化療或放射療法的癌癥患者用作補(bǔ)劑，已知這些療法可引起嚴(yán)重的免疫抑制。
背景技術(shù)：
數(shù)百年來，某些無毒物質(zhì)如草藥化合物的應(yīng)用業(yè)已在多種生理條件下被廣泛接受，尤其是在東方。人參是最為人們所熟知的傳統(tǒng)中草藥。人參提取物本身或它與其他藥物聯(lián)合使用時的藥理學(xué)活性包括減輕腎損傷、抑制癌的發(fā)生且預(yù)防應(yīng)激反應(yīng)。另外還有許多關(guān)于人參作用于個體免疫反應(yīng)的報導(dǎo)。迄今有關(guān)人參的一些免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)已見諸報導(dǎo)，其中包括增強(qiáng)宿主對感染的抵抗力、抗炎作用、抑制腫瘤生長和在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)某些免疫功能。美洲人參，即西洋參，是另一個種的人參，它作為具有多種有益健康作用的保健補(bǔ)品已被公眾接受。數(shù)組科學(xué)家業(yè)已嘗試分離并闡明了人參中的多糖類化合物的結(jié)構(gòu)。已證實(shí)一些多糖在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)活性。
日本Kyoritsu藥學(xué)院的Tomoda小組對人參多糖的分離、鑒定和生物價值進(jìn)行了一系列研究。在一組實(shí)驗中，對人參多糖的分餾是基于其酸性不同。已從高麗參(西洋參)的根部分離出兩種具有免疫學(xué)活性的酸性多糖[1，2]。用熱水提取根切片。該提取物在硫酸鈉存在下用溴化十六烷基三甲銨(CTAB)處理。沉淀物被分離、透析并且上樣至葡聚糖凝膠(Sephadex)G25色譜柱、DEAE-葡聚糖纖維素(Sephacel)(Parmacial)色譜柱，得到兩種純凈多糖，被稱作人參烷(ginsenan)PA和人參烷PB。分別在Toyopearl HW-55F上進(jìn)行凝膠色譜，得到人參烷PA和人參烷PB的分子量各為1.6×105和5.5×104。定量分析顯示，人參烷PA含有21.3％阿拉伯糖、53.4％半乳糖、2.0％鼠李糖、16.0％半乳糖醛酸和2.7％葡糖醛酸。這些糖組分的摩爾比為11∶22∶1∶6∶1。人參烷PB含有11.0％阿拉伯糖、32.2％半乳糖、8.1％鼠李糖、39.9％半乳糖醛酸和5.0％葡糖醛酸。這些糖組分的摩爾比為3∶7∶2∶8∶1。這兩種多糖在碳清除實(shí)驗中表現(xiàn)出顯著的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增效作用，以及明顯的抗補(bǔ)體活性和劑量依賴的堿性磷酸酶誘導(dǎo)活性。
在另一個實(shí)驗中[3]，從上述用CTAB處理的提取物的上清液中，分離出另外兩種多糖，其方法是把上清液傾入乙醇中。分離出沉淀物并上樣至DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-25色譜柱上，得到另外兩種純凈多糖，被稱作S-ⅠA和S-ⅡA。分別在Yoyopearl HW-55F上進(jìn)行凝膠色譜分析，獲得S-ⅠA和S-ⅡA的分子量各為5.6×104和1.0×105。人參烷S-ⅠA含有42.3％阿拉伯糖、50.8％半乳糖和16.0％半乳糖醛酸，其摩爾比為8∶8∶1。人參烷S-ⅡA由42.0％L-阿拉伯糖、32.6％半乳糖、6.2％葡萄糖和19.2％半乳糖醛酸組成，其摩爾比為15∶10∶2∶5。
日本Kitasato學(xué)院東方醫(yī)學(xué)研究中心的Yamada小組已從西洋參的葉和根中分離出若干種多糖餾分。他們研究并比較了這些餾分的化學(xué)性質(zhì)和生物活性[4]。
中國人參的根和葉在經(jīng)過乙醇處理除去其人參皂甙后用水提取，再將殘余物用0.5M NaOH提取，得到水溶性多糖餾分和堿性可溶多糖餾分(水溶性餾分分別稱作GR-2和GL-2，堿溶性餾分分別稱作GRA-2和GLA-2)?；诙嗵浅煞值乃嵝?，經(jīng)過十六烷基三甲胺處理的上述所有餾分進(jìn)一步被分為強(qiáng)酸性(稱作產(chǎn)物GR-3、GL-3、GRA-3和GLA-3)、弱酸性(稱作GR-4、GL-4、GRA-4和GLA-4)和中性(稱作GR-5、GL-5、GRA-5和GLA-5)多糖餾分。根的多糖含量大于葉的多糖含量。得自根部的強(qiáng)酸性多糖餾分具有高含量的糖醛酸，甚至超過了50％。從所有餾分中都可以檢測出類似的糖組分。它們是鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。半乳糖醛酸是主要的醛酸組分。
具有最高抗補(bǔ)體活性的餾分GL-3被用DEAE-Sephadex、Sepharose(瓊脂糖)CL-6B、DEAE Toyopearl色譜柱進(jìn)一步分餾，由乙醇沉淀獲得了被稱作GL-PⅠ至GL-PIV的餾分[5]。所有餾分都含有32-44％的醛酸。餾分PI具有最大分子量，為50，000。PⅠ和PⅡ主要由Rha、Gal和GalA組成，而PⅢ還另外含有Fuc，PIV由Gal、Glc和GalA組成。對結(jié)構(gòu)將進(jìn)行詳盡的測定。
通過在DEAE Sepharose CL-6B和Sepharose CL-6B上進(jìn)行層析，在弱酸性多糖餾分GL-4中分離出抗?jié)児z多糖(GL-BⅢ)。它主要由Rha、Ara、Man、Gal、Glc、GalA和GlcA以摩爾比3∶4∶2∶10∶1∶7∶4組成。對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)測定[6]。
在DEAE-Sepharose CL-6B上通過陰離子交換色譜法可以從GL-4分離出另一種具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞Fc受體表達(dá)作用的多糖(GL-4Ⅱb2)。化學(xué)分析顯示，該樣品含有共65％的碳水化合物和33.7％醛酸。對其進(jìn)行組成分析和結(jié)構(gòu)測定[7]。
同一組的技術(shù)人員還研究了另一種具有抗補(bǔ)體活性的西洋參提取物G-115[8]。將G-115分餾以鑒定具有抗補(bǔ)體和促有絲分裂活性的活性物質(zhì)。在該多糖粗餾分G-115G中觀察到最強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性，而水溶性可透析餾分G-115E表現(xiàn)出最有效的促有絲分裂活性。通過溴化十六烷基三甲銨沉淀、在DEAE-Sepharose上進(jìn)行陰離子交換層析和在Sepharose CL-4B上進(jìn)行凝膠過濾，將G-115G進(jìn)一步提純，得到一種重要的有效抗補(bǔ)體多糖G-115Ⅰ1-Ⅱa-2-3。此多糖為同型多糖。估計其分子量為3.68×105。其中除了含有少量半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和鼠李糖以外，主要是由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成。
日本Tohoku大學(xué)藥學(xué)院的Hikino小組從韓國、中國和日本人參中分離出人參多糖。他們對人參多糖的降血糖活性進(jìn)行了試驗。已闡明了其組成和一些結(jié)構(gòu)特征。
從美國人參中分離出三種多糖，quiquefolans A至C[14]。通過Sephacryl(聚丙烯酰胺葡聚糖)S-S00的凝膠色譜法測出它們的分子量大于2.0×106。quinquefolan A內(nèi)的中性糖組分是甘露糖和葡萄糖(摩爾比為1.0∶2.3)，quinquefolan B內(nèi)的是甘露糖和葡萄糖(摩爾比1.0∶5.5)，quinquefolan C是木糖。發(fā)現(xiàn)在quinquefolan A至C中酸性糖組分分別占10.8％、11.7％和7.1％。對于quinquefolan A至C來說，上述聚糖中的肽部分含量分別是2.7％、2.9％和2.3％。所有這些多糖在正常和四氧嘧啶減少型低血糖小鼠中均表現(xiàn)出降血糖作用。
韓國漢城的韓國癌癥中心醫(yī)院免疫實(shí)驗室的研究人員從西洋參中分離出分子量為150，000被稱作Ginsan的酸性多糖[15]。此多糖是由3.7％蛋白質(zhì)和47.1％己糖(葡萄糖和半乳糖)和43.1％醛酸(半乳糖醛酸)組成的。Ginsan誘發(fā)T細(xì)胞和B細(xì)胞增生，并且通過產(chǎn)生內(nèi)源性多細(xì)胞因子，從天然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞繁殖出淋巴因子激活型殺傷細(xì)胞[16]。
中國東北師范大學(xué)的Miao等人已從美國人參中分離出多糖。并且進(jìn)行了純化和結(jié)構(gòu)測定。
白求恩醫(yī)科大學(xué)的研究小組業(yè)已對美國人參中的多糖的生物活性進(jìn)行了研究。他們發(fā)現(xiàn)，美國人參(PPQ)中的多糖可以促使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。他們研究了西洋參(PPQ-1)多糖對離體鼠脾淋巴細(xì)胞生成細(xì)胞因子的作用。數(shù)據(jù)表明PPQ-1可以調(diào)節(jié)免疫功能。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，某些美國人參提取物具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。CVT-E002及其純化餾分PQ2和PQ223特異性地刺激小鼠脾細(xì)胞增生B細(xì)胞，隨后產(chǎn)生大量抗體。該餾分還可以提高血清免疫球蛋白(例如總的IgG)的水平，并刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α。這些餾分可以用來預(yù)防或治療全身感染和其他免疫缺陷相關(guān)性疾病。
因此，本發(fā)明涉及從美國人參樣品中制備人參餾分PQ2、PQ223和CVT-E002的方法。
具體而言，一種制備人參餾分PQ2的方法包括-將美國人參與含有醇的第一溶劑混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；-此后分離上述第一人參溶液，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；-再將該第一人參殘余物和水混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，生成人參殘余物溶液；-進(jìn)而分離該人參殘余物溶液，生成第二人參殘余物和含有第一人參提取物的第一水提液；-制備含有至少部分第一人參提取物的第二水提液，其中第一人參提取物和水在第二水提液中的比例約為1∶18-1∶22；-此后將該第二水提液和含醇的第二溶劑混合，其中第二溶劑和水的比例約為1∶1-3∶5，生成第一沉淀物和第一上清液；-隨后將前一步驟獲得的第一上清液和含醇的第三溶劑混合，其中，第三溶劑和第一上清液的比例約為3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和-分離該第二沉淀物，得到人參餾分PQ2。
一種制備人參餾分PQ223的方法包括-獲得如上所述的人參餾分PQ2；-將人參餾分PQ2分餾，生成第一洗脫餾分和第二洗脫餾分，其中第一洗脫餾分相應(yīng)于洗脫體積為35-50ml之間的碳水化合物峰，并且第二洗脫餾分相應(yīng)于洗脫體積為50-85ml之間的碳水化合物峰，通過凝膠過濾色譜法，采用下列原料測定(1)一個色譜柱，其中含有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基二丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和-分離且將第一洗脫餾分和第二洗脫餾分合并，生成人參餾分PQ223。
一種制備人參餾分CVT-E002的方法包括-將美國人參和含有醇的第一溶劑以每1克人參約7-9ml溶劑的比例進(jìn)行混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；-隨后分離該第一人參溶液，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；-再將該第一人參殘余物和水以約7-9ml的水/克人參殘余物的比例混合，將所得殘余物溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，生成人參殘余物溶液；-進(jìn)而分離該人參殘余物溶液，得到第二人參殘余物和含有人參提取物的水提液；和-將該水提液干燥，得到人參餾分CVT-E002。
本發(fā)明還涉及人參餾分PQ2、PQ223和CVT-E002，它們通過上述方法制備。
本發(fā)明也涉及含有特定碳水化合物的人參餾分。
第一人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約2-6mol％鼠李糖、約41-49mol％半乳糖醛酸、約12-18mol％葡萄糖、約16-22mol％半乳糖和約12-19mol％阿拉伯糖。
第二人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約3-8mol％鼠李糖、約36-44mol％半乳糖醛酸、約2-7mol％葡萄糖、約25-33mol％半乳糖和約17-25mol％阿拉伯糖。
第三人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約0.5-5mol％鼠李糖、約11-22mol％半乳糖醛酸、約40-60mol％葡萄糖、約10-19mol％半乳糖和約11-19mol％阿拉伯糖。
本發(fā)明還涉及含有與藥物可接受載體結(jié)合的本發(fā)明人參餾分的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明所述的人參餾分單獨(dú)使用或與另一種藥物合用在制備適于治療以免疫力低下為特征的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明所述的人參餾分刺激細(xì)胞內(nèi)IL-1、IL-6和/或TNF-α的生成的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明所述的人參餾分刺激體外或體內(nèi)免疫球蛋白生成的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述人參餾分激活B淋巴細(xì)胞增生及其抗體生成的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種在需要治療的患者中治療以免疫力低下為特征的疾病的方法，該方法包括給患者施用疾病治療有效量的本發(fā)明所述人參餾分。
附圖簡述

圖1表示色譜柱上洗脫體積相對于標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖樣品的分子量對數(shù)所作的圖示。
圖2表示人參餾分CVT-E002的色譜圖。
圖3表示人參餾分PQ的色譜圖。
圖4表示人參餾分PQ2的色譜圖。
圖5表示人參餾分PQ3的色譜圖。
圖6表示人參餾分PQ223的色譜圖。
圖7表示人參餾分PQ223對小鼠脾細(xì)胞B細(xì)胞增殖作用的影響。
圖8表示人參餾分PQ223對小鼠脾細(xì)胞T細(xì)胞增殖作用的影響。
圖9表示人參餾分PQ223作用于小鼠脾細(xì)胞T和B細(xì)胞增殖的特異性。
圖10表示人參餾分PQ223對小鼠脾臟體外抗體生成的影響。
圖11表示注射了人參餾分PQ223的小鼠中蝕斑形成細(xì)胞(PFC)的增強(qiáng)。
發(fā)明詳述一種制備人參餾分PQ2的方法包括(a)將美國人參與含有醇的第一溶劑混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；(b)此后將第一人參溶液分離，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；(c)再將上述第一人參殘余物和水混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得人參殘余物溶液；(d)進(jìn)而分離該人參殘余物溶液，制得第二人參殘余物和含有第一人參提取物的第一水提液；(e)制備含有至少部分第一人參提取物的第二水提液，其中第一人參提取物和水在第二水提液中的比例約為1∶18-1∶22；(f)此后將該第二水提液和含有醇的第二溶劑混合，其中第二溶劑和水的比例約為1∶1-3∶5，制得第一沉淀物和第一上清液；(g)隨后將步驟(f)獲得的第一上清液和含有醇的第三溶劑混合，其中，所述第三溶劑和第一上清液的比例約為3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和(h)分離該第二沉淀物，得到人參餾分PQ2。
第一溶劑、第二溶劑和第三溶劑中各自所述的醇分別包括對于所述人參呈惰性且易于從預(yù)期產(chǎn)物中分離出來的醇。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)很容易選擇出滿足這些要求的醇。各種情況中所優(yōu)選的醇分別包括飽和或不飽和C1-C6醇。在各情況中更優(yōu)選的醇分別包括乙醇或甲醇。
在步驟(a)和(c)中，優(yōu)選將所得溶液加熱約3小時。步驟(a)還優(yōu)選將第一溶劑和所述人參以每1克人參約7-9ml第一溶劑的比例混合，首選按每1克人參約8ml第一溶劑的比例混合。在步驟(c)中，優(yōu)選水和第一人參殘余物以每1克人參殘余物約7-9ml水的比例混合，首選按每1克人參殘余物約8ml水的比例混合。
緊繼上述方法的步驟(d)之后，可將第一人參提取物任選地濃縮。這可以采用任何所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法來完成。例如，將含有第一人參提取物的第一水溶液離心(例如，在2500-10，000rpm下離心約5-15分鐘)。也可以將該第一水溶液過濾?；蚴浅藵饪s該第一人參提取物以外，將第一人參提取物冷凍干燥以備隨后使用。
在步驟(e)中，第二水提液含有至少一部分所述第一人參提取物。重要的是，該第一人參提取物和水在第二水提液中的比例為約1∶18-1∶22，更優(yōu)選約1∶20。這可以通過多種途徑來獲得。如果該第一人參提取物在上述步驟(d)后被濃縮和/或冷凍干燥，應(yīng)向該第一人參提取物中加入水至預(yù)定比例?；蛘?，部分或全部的第一水提液可以用于第二水提液中。如果需要，再加入水達(dá)到預(yù)定比例。使用至少部分含有預(yù)定量第一人參提取物的第一水提液可以避免在步驟(d)和(e)之間進(jìn)行額外的濃縮或冷凍干燥。
在步驟(f)中，優(yōu)選的第二溶劑和水的比例約為3∶4。
在步驟(g)中，優(yōu)選的第三溶劑和第一上清液的比例約為2∶1。
一種制備人參餾分PQ223的方法包括(a)按照上述方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2分餾，生成第一洗脫餾分和第二洗脫餾分，其中所述第一洗脫餾分對應(yīng)于洗脫體積為35-50ml之間的碳水化合物峰，所述第二洗脫餾分對應(yīng)于洗脫體積為50-85ml之間的碳水化合物峰，通過凝膠過濾色譜法，采用下列原料測定(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物的基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和(c)分離且將第一洗脫餾分和第二洗脫餾分合并，制得人參餾分PQ223。
第一洗脫餾分也稱作PQ2A，第二洗脫餾分也稱作PQ2B?？梢苑謩e分離這些洗脫餾分。此外，利用上述相同方法可以制備另外的洗脫餾分PQ2C(相應(yīng)于在洗脫體積95-110ml之間觀察到的碳水化合物峰)，和PQ2D(相應(yīng)于在洗脫體積120-250ml之間觀察到的碳水化合物峰)。上述各個餾分也可以分別分離。而且，除了含有兩種或多種PQ2A至PQ2D的PQ223以外，還可以制備其他組合物。
優(yōu)選采用凝膠過濾色譜法對人參餾分PQ2進(jìn)行分餾。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他任何類型的方法均適用。
所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員很熟悉進(jìn)行凝膠過濾色譜的方法，應(yīng)該按照制造商推薦的流量、樣品體積和操作溫度來完成。這些因素在不同制造商說明書中的差別不會明顯影響色譜操作的結(jié)果。
通過所屬技術(shù)領(lǐng)域的已知方法可以測定碳水化合物的含量。優(yōu)選微量滴定平板分析法來測定所述餾分中的碳水化合物組成。這種分析方法對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是熟知的。參見，例如，Dubois等，(分析化學(xué)》，28350-56(1956)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。在微量滴定平板分析法中，優(yōu)選在492nm下檢測樣品的吸光度。
一種制備人參餾分CVT-E002的方法包括(a)將美國人參和含有醇的第一溶劑以每克人參約7-9ml溶劑的比例混合，將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；(b)隨后分離該第一人參溶液，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；(c)再將該第一人參殘余物和水以約7-9ml的水/克人參殘余物的比例混合，將所得殘余物溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得人參殘余物溶液；(d)進(jìn)而分離該人參殘余物溶液，制得第二人參殘余物和含有人參提取物的水提液；和(e)干燥或濃縮該水提液，得到人參餾分CVT-E002。
第一溶劑中含有的醇包括對人參呈惰性且易于自預(yù)期產(chǎn)物中分離出的醇。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)很容易選擇出滿足這些要求的醇。優(yōu)選的醇包括飽和或不飽和的C1-C6醇。更優(yōu)選的醇包括乙醇或甲醇。
在步驟(a)中，優(yōu)選所述第一溶劑和樣品以每克樣品約8ml第一溶劑的比例混合。在步驟(c)中優(yōu)選水和所述第一人參殘余物以每克人參殘余物約8ml水的比例混合。
在步驟(a)和(c)中，優(yōu)選將所述第一人參溶液加熱約3小時。
本發(fā)明還涉及若干種人參餾分。
第一人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約2-6mol％鼠李糖、約41-49mol％半乳糖醛酸、約12-18mol％葡萄糖、約16-22mol％半乳糖和約12-19mol％阿拉伯糖。優(yōu)選該碳水化合物含有約3-5mol％鼠李糖、約43-47mol％半乳糖醛酸、約14-16mol％葡萄糖、約18-20mol％半乳糖和約14-17mol％阿拉伯糖。最優(yōu)選該碳水化合物含有約4mol％鼠李糖、約45mol％半乳糖醛酸、約15mol％葡萄糖、約19mol％半乳糖和約15mol％阿拉伯糖。
本發(fā)明的第二人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約3-8mol％鼠李糖、約36-44mol％半乳糖醛酸、約2-7mol％葡萄糖、約25-33mol％半乳糖和約17-25mol％阿拉伯糖。優(yōu)選該碳水化合物含有4-7mol％鼠李糖、約37-42mol％半乳糖醛酸、約3-6mol％葡萄糖、約27-32mol％半乳糖和約19-24mol％阿拉伯糖。最優(yōu)選該碳水化合物含有5mol％鼠李糖、約39mol％半乳糖醛酸、約4mol％葡萄糖、約29mol％半乳糖和約21mol％阿拉伯糖。
本發(fā)明的第三人參餾分具有一種碳水化合物，其中含有約0.5-5mol％鼠李糖、約11-22mol％半乳糖醛酸、約40-60mol％葡萄糖、約10-19mol％半乳糖和約11-19mol％阿拉伯糖。優(yōu)選該碳水化合物含有約1-3mol％鼠李糖、約13-20mol％半乳糖醛酸、約42-57mol％葡萄糖、約12-17mol％半乳糖和約13-17mol％阿拉伯糖。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述組合物含有和藥物可接受載體相組合的本發(fā)明的人參餾分。在這方面，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉任何適用的藥物可接受載體，因此，在此將不再詳細(xì)探討制備本發(fā)明藥物組合物的方法。所屬藥物組合物可以是適當(dāng)?shù)钠瑒?、膠囊、液體、錠劑、洗液或栓劑的形式。
本發(fā)明涉及本發(fā)明所述人參餾分在制備適合治療以免疫力低下為特征的疾病(如感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS和癌癥)的藥物組合物中的應(yīng)用。所述人參餾分可以單獨(dú)使用或和另一種藥物聯(lián)合使用。本發(fā)明的人參餾分特別適用于和化療藥物或作為放射療法補(bǔ)劑聯(lián)合給藥，這是因為已知癌癥患者的免疫體系被嚴(yán)重抑制。
本發(fā)明還涉及一種在需治療患者中用于治療以免疫力低下為特征的疾病的方法，該方法包括給該患者施用疾病治療有效量的本發(fā)明所述人參餾分。優(yōu)選所述疾病選自感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS和癌癥。本發(fā)明所述人參餾分的劑量取決于被治療的特定病癥和患者的年齡、性別和全身健康狀況。然而，已發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膭┝渴窃?-5000 mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，每天給藥1-10次。所述人參餾分可以口服給藥，經(jīng)注射或灌注給藥，局部、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、經(jīng)鞘或直腸給藥。
本發(fā)明現(xiàn)在將通過下列實(shí)施例得到進(jìn)一步說明。實(shí)施例實(shí)施例1第一種制備餾分CVT-E002和純化該餾分的方法將美國人參的根部通過化學(xué)方法提取并進(jìn)一步純化以得到餾分CVT-E001和CVT-E002。再將一定量的CVT-E002進(jìn)一步提純以得到餾分G1、G2和G3。詳細(xì)方法描述如下。
攪拌下，將500g干燥的人參根粉用4L 85％乙醇或3L 90％甲醇在80-85℃的水浴上提取3小時并過濾，得到醇溶液和殘余物。將該醇溶液濃縮并噴霧干燥，得到總皂甙的產(chǎn)物(CVT-E001)。攪拌的同時將該殘余物用4L水在95-100℃的水浴上提取3小時。提取物經(jīng)平紋細(xì)布袋過濾并離心，得到含有CVT-E002的水溶液，棄去剩下的殘余物。
將一部分水溶液進(jìn)一步提純，向上述水溶液中加入等體積的95％乙醇，引發(fā)沉淀。將沉淀離心并凍干得到餾分G1。通過蒸發(fā)減小上清液的體積。加入等體積的95％乙醇，得到第二批沉淀G2，除去剩余上清液的乙醇且冷凍干燥，得到粉末G3。
按照下列方法進(jìn)一步純化G2。將2g G2溶解在80ml水中，并在截止分子量為1200的Sigma D-7884透析管中相對于3個體積的水進(jìn)行透析。該透析是在4℃下持續(xù)72小時，每24小時收集兩次透析液。將該透析液濃縮至15ml，隨后用等體積甲醇沉淀。將該沉淀溶解在水中并冷凍干燥，得到粉末G22。
按照下列方法進(jìn)一步純化G22。將1.5g G22溶解在60ml水中，隨后在截止分子量為1000的Fisher Spectral/Por分子多孔膜中在4℃下相對于600ml水透析。透析24小時后收集到第一透析液，通過蒸發(fā)將其濃縮至15ml，隨后冷凍干燥。所得干燥粉末稱作G221。以相同的方法，在48小時后收集到第二批透析液并稱作G222。將殘余物濃縮并冷凍干燥，得到的粉末稱作G223。實(shí)施例2第二種制備餾分CVT-E002和提純該餾分的方法本發(fā)明另一種制備人參餾分CVT-E002的方法如下所述。
攪拌下，將1000g干燥的美國人參根用8L 85％乙醇在95-100℃的水浴上提取3小時并過濾，得到醇溶液和殘余物。在持續(xù)攪拌的條件下將殘余物和水(1∶8)在熱水浴上混合3小時。冷卻至室溫后，過濾該混合物。在5000rpm下離心該濾液10分鐘。將上清液濃縮并冷凍干燥，得到提取物CVT-E002。通過這種方法制備的CVT-E002的產(chǎn)量與實(shí)施例1所述方法的大致相同，即約是人參原料重量的10％。
按照下列方法進(jìn)一步分離一部分CVT-E002。將1600ml 95％乙醇加入到100g溶于2000ml水的CVT-E002溶液中。分離出沉淀，為PQ1。將上清液濃縮至500ml。再將另一部分95％乙醇(1000ml)加入到該濃縮溶液中，得到第二沉淀餾分。將該第二沉淀餾分分離并冷凍干燥，得到餾分PQ2。將上清液濃縮并冷凍干燥，得到PQ3。實(shí)施例3促有絲分裂活性試驗通過基于對其體外淋巴細(xì)胞的促有絲分裂活性的篩選選擇出多種純化水平下的不同美國人參餾分。雖然促有絲分裂作用被認(rèn)為是與體內(nèi)免疫系統(tǒng)中正常活動相關(guān)的人為行為，但促有絲分裂劑為可能的效應(yīng)子功能提供了良好的指示。
促有絲分裂活性的試驗方法如下所述試驗選用Balb/C或C57B1/6J小鼠。Balb/C小鼠得自于Health Sciences Laboratory AnimalServies Facility(University of Alberta，Edmonton，Canada)。C57B1/6J小鼠得自于Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。在各個試驗中令7-10周大的小鼠按年齡和性別相匹配。用頸部脫位法處死小鼠。通過無菌技術(shù)取出脾臟并在兩個玻璃載玻片的磨砂端之間壓碎。在漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)中離心洗滌后，將細(xì)胞懸浮在pH 7.4的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Gibco，Grand Island，N.Y.)，其中含有10％胎牛血清(Flow Labs)、50mM巰基乙醇(ICN Pharmaceuticals，Plainview，N.Y.)和青霉素-鏈霉素(Gibco)。在96孔平底Linbro平板中一式三份進(jìn)行培養(yǎng)，各孔內(nèi)的終濃度為1.25×106細(xì)胞/ml。將被測餾分預(yù)先過濾滅菌并溶解在HBSS中，用這些餾分建立試驗組。對照培養(yǎng)是由不含有促細(xì)胞分裂劑的一組和用20μg/ml植物凝集素(PHA)或25μg/ml脂多糖(LPS)處理的多個組組成。已知PHA能夠特異性地刺激T型脾細(xì)胞，而LPS刺激B型脾細(xì)胞。培養(yǎng)物在37℃、5％CO2加濕空氣中培養(yǎng)72小時。在72小時培養(yǎng)結(jié)束之前4小時，向各孔中加入1μCi氚代胸苷(New England Nuclear，Boston，Massachusetts)。用自動樣品收集器(Skatron，Virginia)收集細(xì)胞，并隨后通過閃爍計數(shù)法測定摻混的放射性。結(jié)果計算為相對于對照組計算的百分比(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，三次重復(fù))。
實(shí)施例1和2中給出了不同的提取條件，例如CVT-E002在水中的濃度和沉淀所用的乙醇體積，對CVT-E002的進(jìn)一步分餾的影響。比較由上述兩種方法制得的產(chǎn)物的促有絲分裂活性。結(jié)果如下表所示。各試驗采用三個批次的三份試樣。
表1由實(shí)施例1所示方法制備的G1、G2和G3的促有絲分裂活性
表2由實(shí)施例2所示方法制備的PQ1、PQ2和PQ3的促有絲分裂活性
如表1和2所示，實(shí)施例1和2所述提取方法之間的改變和生物學(xué)活性從G1餾分至PQ2餾分的轉(zhuǎn)變有關(guān)。實(shí)施例4PQ2的分離和一種制備PQ223餾分的方法按照分子量的分布、通過凝膠過濾色譜法、在HiPrep 16/60 Sephary1S-200高分辨色譜柱(Pharmacia Biotech，Cat.No.17-1166-01)上進(jìn)一步分離實(shí)施例2所述的CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ3，該色譜柱含有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，分離范圍(MW)對于球蛋白來說是5000-250，000，對于葡聚糖來說是1000-80，000。葡聚糖樣品(MW=71.4k，37.5k，19.5k和9.5k)購自Sigma，用作標(biāo)準(zhǔn)品。將5mg各樣品溶解在1ml水中，上樣至柱內(nèi)，用含有0.1N HCl和0.3M NaCl、pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖劑洗脫，流速為0.3ml/min，環(huán)境溫度為4℃。收集一定體積的洗脫液，得到每5ml一份的多個試樣。
用微量滴定平板分析法檢測每份洗脫液的碳水化合物總含量，以得到全部碳水化合物的含量。這是Dubois等人在《分析化學(xué)》28350-56(1956)中描述的方法的改進(jìn)。推導(dǎo)洗脫液中的碳水化合物總量的目的是能夠在確定的吸收光譜下進(jìn)行檢測。用D-葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，所用的其他材料是濃硫酸(98％)和5％苯酚。聚苯乙烯微量滴定板購自SARSTDT(Quebec，Canada)。向微量滴定平板的各個孔中，加入40μl含有1-10μg D-葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品和40μl 5％苯酚并混合。隨后小心地加入200μl濃硫酸。用多道吸移管將試劑和各份洗脫液混合后，把平板放在80℃下保溫1小時。冷卻至室溫后，用Multiskan微量滴定平板讀數(shù)器在492nm下測定樣品的吸光度。儲存數(shù)據(jù)并用微軟Excel程序?qū)⒛z過濾色譜結(jié)果繪圖。
通過在同一色譜柱中洗脫一系列分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(Sigma)可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。CVT-E002和批次21的PQ1、PQ2和PQ3的色譜圖如圖2-5所示。在各圖中，X軸上的各點(diǎn)表示相當(dāng)于實(shí)際體積五分之一的洗脫體積。所以，為了得到洗脫體積的真實(shí)值，須將圖中的結(jié)果乘以5。
CVT-E002的凝膠過濾色譜(圖2)顯示出三個主峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推測第一個峰的分子量(洗脫餾分7-10)為70，000或更高(圖1)。第三個峰的分子量(洗脫餾分18-22)約為1，000。還觀察到峰寬較小的第二個峰(洗脫餾分10-17)。這三個峰的比例為57.2∶8.5∶34.4。
PQ1的色譜(圖3)顯示為一個主峰(洗脫餾分7-10)和一個小峰(洗脫餾分18-21)。主峰對應(yīng)于CVT-E002的高分子量餾分。兩個峰的比例是86.8∶13.2 。
PQ2的色譜(圖4)顯示為三個主峰。峰A(洗脫餾分7-10)和峰C(洗脫餾分19-22)和CVT-E002的兩個主峰相對應(yīng)。另一個寬峰，也就是峰B(洗脫餾分10-17)位于峰A和C之間。據(jù)推算峰B的分子量約為2，000-60，000。三個峰A-C的比例是34.1∶45.7∶20.3。還觀察到一個小峰區(qū)，稱作峰D(洗脫餾分24-50，如圖4所示)。
PQ3的色譜(圖5)僅僅顯示出一個主峰(洗脫餾分18-21)，它對應(yīng)于CVT-E002的低分子量餾分。
收集PQ2的A、B、C和D餾分并冷凍干燥。將干粉分別重新命名為PQ2A、PQ2B、PQ2C和PQ2D。再將餾分A和B合并，并將合并的餾分稱作PQ223(圖6為其色譜圖)。試驗PQ2A、PQ2B、PQ2C和PQ2D的促有絲分裂活性并將PQ223、PQ2和CVT-E002的活性進(jìn)行比較。
結(jié)果如下表所示。
表3．美國人參餾分的促有絲分裂活性(相對于對照組計的3H-胸苷摻混百分率％)
*和**分別表示P＜0.05和P＜0.01。n=3如上述結(jié)果所示，有效性的順序是PQ223＞PQ2＞CVT-E002。實(shí)施例5CVT-E002、PQ1、PQ2、PQ3和PQ223的總碳水化合物和蛋白組成的化學(xué)測定得到各餾分CVT-E002、PQ1、PQ2、PQ3和PQ223的三個批次，測定各餾分中總的碳水化合物和蛋白質(zhì)組成。用苯酚-硫酸法測定碳水化合物總量，該方法是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。用Lowry法測定蛋白組成，此方法為本領(lǐng)域所已知，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果如下表所示。
表4．餾分中蛋白質(zhì)和碳水化合物含量的對比
實(shí)施例6CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的單糖組成的化學(xué)測定由于碳水化合物的總量主要代表多糖和寡糖的量，所以還需測定某些餾分中單糖的摩爾比例。
將不同批次的餾分CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223酸催化水解，以便釋放出其結(jié)構(gòu)單位--單糖。在用MPP(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)衍生化后，通過HPLC法對釋放出的單糖進(jìn)行定性和定量分析。詳細(xì)方法如下所述將溶于2N HCl中的樣品溶液在95-100℃下加熱6小時。用NaOH溶液中和該混合物。加入內(nèi)標(biāo)。隨后向此混合物中加入甲醇和氫氧化鈉水溶液(0.3N)。隨后在50-60℃下攪拌8小時(或在室溫下攪拌1周)。用水稀釋該混合物(1∶10)并用C-18柱分析，用含有18％乙腈的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7)洗脫，流速為1ml/min，UV檢測器被設(shè)定在245nm。下表列出了CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的單糖的摩爾比例。在一些CVT-E002、PQ1和PQ2樣品中發(fā)現(xiàn)了痕量的葡萄糖醛酸。
表5 CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的單糖組成(摩爾％)
如結(jié)果所示，葡萄糖含量的順序為PQ1＞CVT-E002＞PQ2＞PQ3；半乳糖醛酸的含量如下PQ2＞PQ223＞CVT-E002＞PQ1。實(shí)施例7人參餾分的免疫調(diào)節(jié)作用1．巨噬細(xì)胞活性利用腹膜滲出的巨噬細(xì)胞來體外研究CVT-E002、PQ2、G2和PQ223對小鼠巨噬細(xì)胞的作用，所述巨噬細(xì)胞得自于選擇性提高細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的C57B1/6小鼠和選擇性提高抗體介導(dǎo)反應(yīng)的Balb/c小鼠。用100μg/ml被測樣品刺激巨噬細(xì)胞，之后測試IL-1、IL-6和TNF-α的生成。方法如下所述。
A．從腹膜滲出細(xì)胞和細(xì)胞上清液中制備巨噬細(xì)胞1)將1ml 3％巰基乙酸鹽注射到小鼠腹膜腔內(nèi)，3天后自腹腔中收集腹膜滲出巨噬細(xì)胞。
2)在1100rpm、4℃下用的Hanks緩沖液離心5分鐘，洗滌細(xì)胞懸浮液兩次。
3)把巨噬細(xì)胞懸浮在RPMI-10％FBS培養(yǎng)基中。
4)對細(xì)胞計數(shù)并用RPMI-10％FBC培養(yǎng)基稀釋至終濃度106/ml。
5)在37℃下將巨噬細(xì)胞在10×106/10ml RPMI-10％FBS中培養(yǎng)2小時。棄去上清液并將沉淀的巨噬細(xì)胞用10ml PBS洗滌兩次。
6)收集巨噬細(xì)胞并再次懸浮在RPMI-10％FBS中。
7)用10mg/ml LPS或100mg/ml被測樣品培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(5×105)24或48小時，此后收集上清液并過濾滅菌，以進(jìn)行生物檢測(IL-1、IL-6和TNF-α)。試驗一式三份。
B．上清液中IL-1的測定NOB1細(xì)胞系是EL4細(xì)胞系的TK變種，在對IL-1反應(yīng)中它產(chǎn)生CTLL生長刺激活性(IL-2)。由于NOB1細(xì)胞沒有摻混3HTdR，所以可以通過CTLL系的攝取來測定對IL-1的反應(yīng)。所用方法如下所述1)在96孔平底微量滴定平板的各個孔中，將104CTLL細(xì)胞和4×104NOB1細(xì)胞在200μl存在于IMDM中的5％FBS中混合。加入IL-1測試樣品的4、8、16或22倍稀釋液或IL-1標(biāo)準(zhǔn)樣的系列稀釋液。各孔的終體積為200μl。各樣品按一式三份制備。
2)把平板在37℃、5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
3)在培養(yǎng)的最后5小時加入[3H]-胸苷。
4)收集細(xì)胞并通過液體閃爍計數(shù)法測定摻混的[3H]-胸苷。
5)計算IL-1的濃度。結(jié)果如下表所示。
表6．人參餾分對小鼠巨噬細(xì)胞IL-1生成作用的影響
1．將腹膜滲出巨噬細(xì)胞5×105/ml用100μg/ml樣品、10μg/ml LPS培養(yǎng)48小時并收集培養(yǎng)物上清液。
2．利用NOB1和CTLL細(xì)胞系測定IL-1，結(jié)果表示為平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01結(jié)果表明，CVT-E002、PQ2、G2和PQ223明顯刺激C57B1/6小鼠的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1。所有試驗樣品顯示出相同的刺激IL-1生成的功效。
C．IL-6的測定小鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系B9的增殖依賴于IL-6。在含有濃度遞減的被測樣品的一系列微孔內(nèi)培養(yǎng)B9細(xì)胞。方法如下。
1)將從儲備培養(yǎng)瓶內(nèi)取出的等分試樣中的處于對數(shù)生長期的B9細(xì)胞計數(shù)。
2)4℃下，將細(xì)胞在臺式離心機(jī)中以180×g離心5分鐘，將沉淀團(tuán)重新懸浮在10ml的完全RPMI-10培養(yǎng)基中。將上述方法重復(fù)兩次并將細(xì)胞重新懸浮在完全RPMI-10培養(yǎng)基中，濃度為2×103細(xì)胞/ml。
3)向96孔微量滴定平板的各孔中加入100μl洗滌過的細(xì)胞(2×103細(xì)胞/ml)。
4)在各孔內(nèi)加入100μl試驗樣品的2倍連續(xù)稀釋液，但為IL-6標(biāo)準(zhǔn)物保留2或3行平板孔。
5)把平板在37℃、5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。
6)加入[3H]-胸苷，將平板在37℃下培養(yǎng)4小時。
7)收集細(xì)胞，通過液體閃爍計數(shù)法測定摻混的[3H]-胸苷。
8)計算IL-6的濃度。結(jié)果如下表所示。
表7．人參對小鼠巨噬細(xì)胞的IL-6生成作用的影響
1．將腹膜滲出巨噬細(xì)胞5×105/ml用1001μg/ml樣品、10μg/ml LPS培養(yǎng)24小時并收集培養(yǎng)物上清液。
2．利用B9細(xì)胞系測定IL-6，結(jié)果表示為平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01CVT-E002、PQ2和PQ223提高C57B1/6小鼠和Balb/c小鼠的巨噬細(xì)胞上清液中IL-1的生成。功效依次為PQ223＞PQ2＞CVT-E002。
D.TNF-α的測量下列方案采用對TNF敏感的、用放線菌素D處理的小鼠L929成纖維細(xì)胞來定量測定得自細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中的TNF活性。
1)向各孔中加入4×104存在于50μl IMDM-5％FSC中的L929細(xì)胞。
2)在各行的第二個孔內(nèi)(第2列)加入50μl被測樣品。通過輕輕混合第2孔的內(nèi)含物制備兩倍連續(xù)稀釋液，并從第2孔中取50μl轉(zhuǎn)移到第3孔中。將第3孔輕輕混合，并從第3孔中取50μl轉(zhuǎn)移到第4孔內(nèi)。連續(xù)進(jìn)行該操作直至第12孔。最后輕輕混合第12列各孔中的內(nèi)含物且從各孔中棄去50μl。此時，所有孔內(nèi)均含有50μl的內(nèi)含物。
3)在各孔(2μl ml)內(nèi)加入50μl的放線霉素D溶液。
4)把平板在37℃下的含有5％CO2的空氣內(nèi)培養(yǎng)24小時。
5)向各孔中加入5μl中性紅并將平板培養(yǎng)2.5小時。
6)將各孔內(nèi)的全部上清液迅速且仔細(xì)地漂洗和排空，用200μl PBS洗滌兩次平板。
7)抽吸PBS，并將1001μl在0.05M Na2HPO4中的50％的乙醇加入到各孔中，在室溫下振搖5分鐘。
8)立刻在570nm下用微量滴定平板讀數(shù)器讀取各孔的吸光度。
9)計算TNF-α的濃度。結(jié)果如下表所示。
表8．人參對小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α生成作用的影響
1．將腹膜滲出巨噬細(xì)胞5×105/ml用100μg/ml樣品、10μg/ml LPS培養(yǎng)48小時并收集培養(yǎng)物上清液。
2．利用L929-8細(xì)胞系測定TNF-α，結(jié)果表示為平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01
TNF-α的生成被來自于Balb/c或C57B1/6細(xì)胞系的巨噬細(xì)胞上清液中的CVT-E002和PQ223所誘導(dǎo)。Balb/c小鼠巨噬細(xì)胞上清中的TNF-α被G2顯著刺激。PQ2似乎不刺激巨噬細(xì)胞的TNF-α產(chǎn)生。
2．血清免疫球蛋白的生成和用水飼養(yǎng)的小鼠相比，用CVT-E002飼養(yǎng)的小鼠的血清免疫球蛋白的生成(總IgG)提高了21％，用PQ2飼養(yǎng)的小鼠提高了26％，用PQ223飼養(yǎng)的小鼠提高了31％。效價依次為PQ223＞PQ2＞CVT-E002。結(jié)果如表9所示。
表10．小鼠體內(nèi)免疫球蛋白的生成(n=15)
3．PQ223的促有絲分裂活性的特異性著名的促有絲分裂原例如PHA或LPS表現(xiàn)出對受其刺激類型的細(xì)胞具有特異性。重要的是，人參餾分能夠刺激哪種特定類型的脾細(xì)胞。所以，我們通過親和色譜柱分離出T細(xì)胞，以此通過排除T細(xì)胞來富集B細(xì)胞。
A.T細(xì)胞的富集把脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液在淋巴細(xì)胞-M(Cedarlane Labs)上鋪層以除去紅細(xì)胞。隨后把淋巴細(xì)胞通過親和色譜柱(Biotex Co.Ltd.，Edmonton，Alberta)，通過使B細(xì)胞粘附在小鼠免疫球蛋白包被珠粒上來除去B細(xì)胞。洗脫液包括富集的T細(xì)胞。利用抗-胸苷1.2(anti-thy 1.2)單克隆抗體和補(bǔ)體處理的存活試驗來測定T細(xì)胞相對于其他類型細(xì)胞的百分比。
B.B細(xì)胞的富集在從脾細(xì)胞群中除去紅細(xì)胞以后，將淋巴細(xì)胞和單克隆抗-胸苷1.2抗體一起在37℃下溫育1小時。此后加入低毒兔補(bǔ)體且在4℃下溫育半小時。此操作去除了細(xì)胞懸浮液中的T細(xì)胞，得到富集的B細(xì)胞群。
C．用PQ223培養(yǎng)用不同劑量的PQ223培養(yǎng)B或T細(xì)胞，利用氚代胸苷摻雜法測定其反應(yīng)。圖7和8分別顯示，PQ223對較純的B細(xì)胞和T細(xì)胞具有增殖作用。對照組包括用LPS(一種B細(xì)胞特異性促有絲分裂原)和PHA(一種T細(xì)胞特異性促有絲分裂原)處理的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)PQ223具有B細(xì)胞特異性(參見圖9)。
4．PQ223對體外抗體生成的影響在不同劑量PQ223的存在下將脾細(xì)胞培養(yǎng)72小時。對照培養(yǎng)是由加入25μg的LPS組和另一未加入促有絲分裂原的組組成。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定上清液中可溶性免疫球蛋白的存在。在0.1MTris緩沖液(pH 9)中連續(xù)稀釋含有可溶性免疫球蛋白的上清液。將該上清液涂布在微量滴定平板上并在4℃下溫育過夜。用PBS吐溫洗滌平板3次，隨后以1∶1000的稀釋度加入100μl抗體-酶螯合山羊F(ab′)2抗-小鼠Ig辣根過氧化物酶(Tago Inc.，Burlingame Califomia)。平板在室溫下保溫1小時。再用PBS洗滌平板3次，隨后向各孔內(nèi)加入100μl ABTS過氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry Lab Inc.)。1小時后，利用流動多掃描(Flow Multiscan)ELISA讀取器在405nm的波長下測定吸光度。
圖10顯示，與25μg LPS相比，50μg/ml PQ223促進(jìn)了免疫球蛋白的生成。較高濃度的PQ223500μg/ml，沒有引起較高水平的抗體生成。該劑量反應(yīng)曲線由異型脾細(xì)胞群和純化的B細(xì)胞的增殖反應(yīng)構(gòu)成。
5．體內(nèi)抗體蝕斑形成細(xì)胞將三個濃度的PQ223靜脈內(nèi)注射給三組動物，每組3只小鼠。給對照組注射平衡鹽溶液。在PQ223靜脈內(nèi)處理的第7天末，用在HBSS中的0.2ml的10％SRBC懸浮液免疫小鼠。免疫5天后，處死小鼠并從脾臟制備單細(xì)胞懸浮液，將濃度調(diào)至4×106細(xì)胞/ml。將該細(xì)胞懸浮液的0.1ml等分試樣與0.3ml 10％SRBC溶液豚鼠補(bǔ)體和0.5ml RPMI培養(yǎng)基混合。取70μl該混合物轉(zhuǎn)移至Cunningham室內(nèi)。該室用聚乙烯石蠟混合物密封并在37℃下培養(yǎng)1小時，隨后對蝕斑形成細(xì)胞計數(shù)。所有PFC水平表示為每1百萬脾細(xì)胞。圖11表明，在注射了化合物的小鼠中，上述三個劑量均能夠明顯提高抗體的生成。
總之，上述研究結(jié)果表明，本發(fā)明的人參餾分激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α。它們還激活淋巴細(xì)胞，特別是B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體生成。全身體系介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)被增強(qiáng)表明對感染的抵御作用。已報導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生具有抗病毒和抗腫瘤的有益作用。另外還有報導(dǎo)說TNF-α在多種寄生蟲感染的治療中具有療效。
下列在本發(fā)明背景中引用的文獻(xiàn)在此引入作為參考1．Tomoda等，《生物學(xué)和藥理學(xué)通訊》(Biol.Pharm.Bull.)，16，22-5(1993)2．Tomoda等，《生物學(xué)和藥理學(xué)通訊》(Biol.Pharm.Bull.)，17，1287-91(1994)3．Tomoda等，《生物學(xué)和藥理學(xué)通訊》(Biol.Pharm.Bull.)，16，1087-90(1993)4．Gao等，《植物醫(yī)學(xué)》(Planta Medica)，55，9-12(1989)5．Gao等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，181，175-87(1988)6．Kiyohara等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，263，89-101(1994)7．Shin等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，300，239-49(1997)8．Yamada等，《植物治療法研究》(Phytotherapy res.)，9，264-9(1995)9．Konno等，《植物醫(yī)學(xué)》(Planta Medica)，50，434-6(1984)10．Hikino等，未公開
11．Oshima等，《人種藥理學(xué)雜志》(J.Ethnopharmacology)，14，255-9(1985)12．Konno等，《國際生藥研究雜志》(Int.J.Crude Drug Res.)，25，53-6(1987)13．Konno等，《人種藥理學(xué)雜志》(J.Ethnopharmacology)，14，69-74(1985)14．Oshima等，《天然產(chǎn)物雜志》(J.Natural Products)，50，188-90(1987)15．Lee等，《抗癌研究》(Anticancer Res.)，17，323-32(1997)16．Kim等，《植物醫(yī)學(xué)》(Planta Medica)，64，110-5(1998)17．苗等，《生物化學(xué)雜志》9，610-4(1993)18．馬等，《白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》，23，236-8(1997)19．朱等，《中國藥理學(xué)通報》13，76-8(1997)
權(quán)利要求
1．一種制備人參餾分PQ2的方法，該方法包括(a)將美國人參與含有醇的第一溶劑混合，并將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；(b)此后將第一人參溶液分離，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；(c)再將上述第一人參殘余物和水混合，并將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得人參殘余物溶液；(d)進(jìn)而將上述人參殘余物溶液分離，制得第二人參殘余物和含有第一人參提取物的第一水提液；(e)制備含有至少部分第一人參提取物的第二水提液，其中在第二水提液中第一人參提取物和水的比例約為1∶18-1∶22；(f)此后將上述第二水提液和含有醇的第二溶劑混合，其中第二溶劑和水的比例約為1∶1-3∶5，制得第一沉淀物和第一上清液；(g)隨后將步驟(f)獲得的第一上清液和含有醇的第三溶劑混合，其中，所述第三溶劑和第一上清液的比例約為3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和(h)分離上述第二沉淀物，得到人參餾分PQ2。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的在第一溶劑、第二溶劑和第三溶劑中的醇獨(dú)立地包括飽和或不飽和C1-C6醇。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的在第一溶劑、第二溶劑和第三溶劑中的醇獨(dú)立地包括乙醇或甲醇。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(e)中第二水提液含有至少部分的第一水提掖。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中將所得溶液加熱約3小時。
6．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(c)中將所得溶液加熱約3小時。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(e)中第一人參提取物和水的比例約為1∶20。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(f)中第二溶劑和水的比例約為3∶4。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(g)中第三溶劑和第一上清液的比例約為2∶1。
10．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中所述第一溶劑和人參是以每克人參約7-9ml第一溶劑的比例混合。
11．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中第一溶劑和人參是以每克人參約8ml第一溶劑的比例混合。
12．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(c)中水和第一人參殘余物是以每克人參殘余物約7-9ml水的比例混合。
13．如權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(c)中水和第一人參殘余物是以每克人參殘余物約8ml水的比例混合。
14．人參餾分PQ2，它是按照權(quán)利要求1-13中任一項的方法獲得的。
15．一種制備人參餾分PQ223的方法，該方法包括(a)按照權(quán)利要求1-13中的任一項所述的方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2分餾，得到第一洗脫餾分和第二洗脫餾分，其中所述第一洗脫餾分對應(yīng)于洗脫體積在35-50ml之間所觀察到的碳水化合物峰，所述第二洗脫餾分對應(yīng)于洗脫體積在50-85ml之間所觀察到的碳水化合物峰，這是通過凝膠過濾色譜法采用下列原料測定的(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和(c)分離并將第一洗脫餾分和第二洗脫餾分合并，制得人參餾分PQ223。
16．如權(quán)利要求15所述的方法，其中人參餾分PQ2是通過凝膠過濾色譜法分餾的。
17．如權(quán)利要求15或16所述方法制備的人參餾分PQ223。
18．一種制備人參餾分CVT-E002的方法，該方法包括(a)將美國人參和含有醇的第一溶劑以每克人參約7-9ml第一溶劑的比例混合，并將所得溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得第一人參溶液；(b)隨后將上述第一人參溶液分離，得到醇/人參溶液和第一人參殘余物；(c)再將上述第一人參殘余物和水以約7-9ml的水/克人參殘余物的比例混合，將所得人參殘余物溶液在約80-100℃的溫度下加熱約2-4小時，制得人參殘余物溶液；(d)進(jìn)而將所得人參殘余物溶液分離，制得第二人參殘余物和含有人參提取物的水提液；和(e)干燥或濃縮上述水提液，得到人參餾分CVT-E002。
19．如權(quán)利要求18所述的方法，其中在步驟(a)中第一溶劑和樣品是以每克樣品約8ml第一溶劑的比例混合。
20．如權(quán)利要求18所述的方法，其中在步驟(c)中水和第一人參殘余物是以每克人參殘余物約8ml水的比例混合。
21．如權(quán)利要求18所述的方法，其中在步驟(a)中將第一人參溶液加熱約3小時。
22．如權(quán)利要求18所述的方法，其中在步驟(c)中將所述人參殘余物溶液加熱約3小時。
23．如權(quán)利要求18所述的方法，其中第一溶劑中的醇包括飽和或不飽和C1-C6醇。
24．如權(quán)利要求18所述的方法，其中第一溶劑中的醇包括乙醇或甲醇。
25．由權(quán)利要求18-24中任一項所述的方法制備的人參餾分CVT-E002。
26．一種含有碳水化合物的人參餾分，所述碳水化合物包括約2-6mol％鼠李糖、約41-49mol％半乳糖醛酸、約12-18mol％葡萄糖、約16-22mol％半乳糖和約12-19mol％阿拉伯糖。
27．如權(quán)利要求26所述的人參餾分，其中所述碳水化合物包括約3-5mol％鼠李糖、約43-47mol％半乳糖醛酸、約14-16mol％葡萄糖、約18-20mol％半乳糖和約14-17mol％阿拉伯糖。
28．如權(quán)利要求26所述的人參餾分，其中所述碳水化合物包括約4mol％鼠李糖、約45mol％半乳糖醛酸、約15mol％葡萄糖、約19mol％半乳糖和約15mol％阿拉伯糖。
29．一種含有碳水化合物的人參餾分，所述碳水化合物包括約3-8mol％鼠李糖、約36-44mol％半乳糖醛酸、約2-7mol％葡萄糖、約25-33mol％半乳糖和約17-25mol％阿拉伯糖。
30．如權(quán)利要求29所述的人參餾分，其中所述碳水化合物包括約4-7mol％鼠李糖、約37-42mol％半乳糖醛酸、約3-6mol％葡萄糖、約27-32mol％半乳糖和約19-24mol％阿拉伯糖。
31．如權(quán)利要求29所述的人參餾分，其中所述碳水化合物包括約5mol％鼠李糖、約39mol％半乳糖醛酸、約4mol％葡萄糖、約29mol％半乳糖和約21mol％阿拉伯糖。
32．一種含有碳水化合物的人參餾分，所述碳水化合物包括約0.5-5mol％鼠李糖、約11-22mol％半乳糖醛酸、約40-60mol％葡萄糖、約10-19mol％半乳糖和約11-19mol％阿拉伯糖。
33．如權(quán)利要求32所述的人參餾分，其中所述碳水化合物包括約1-3mol％鼠李糖、約13-20mol％半乳糖醛酸、約42-57mol％葡萄糖、約12-17mol％半乳糖和約13-17mol％阿拉伯糖。
34．一種藥物組合物，該組合物含有與藥物可接受載體組合的如權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分。
35．權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分單獨(dú)或和另一種藥物聯(lián)合在制備適用于治療以免疫力低下為特征的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
36．如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其中所述疾病選自感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS和癌癥。
37．權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分在刺激細(xì)胞中IL-1、IL-6和/或TNF-α生成中的應(yīng)用。
38．權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分在體外或體內(nèi)刺激免疫球蛋白生成中的應(yīng)用。
39．權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分在激活B淋巴細(xì)胞增殖和由此激活抗體生成中的應(yīng)用。
40．一種治療患者患有的以免疫力低下為特征的疾病的方法，該方法包括給所述患者施用治療有效量的如權(quán)利要求14、17和25-33中任一項所述的人參餾分。
41．如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述疾病選自感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS和癌癥。
42．一種制備人參餾分PQ2A的方法，該方法包括(a)按照權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2分餾，生成一種洗脫餾分，通過凝膠過濾色譜法并采用下列材料測定，該餾分對應(yīng)于洗脫體積在35-50ml之間所觀察到的碳水化合物峰(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和(c)分離上述洗脫餾分得到人參餾分PQ2A。
43．按照權(quán)利要求42所述方法制備的人參餾分PQ2A。
44．一種制備人參餾分PQ2B的方法，該方法包括(a)按照權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2B分餾，生成一種洗脫餾分，通過凝膠過濾色譜法并采用下列材料測定，該餾分對應(yīng)于洗脫體積在50-85ml之間所觀察到的碳水化合物峰(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和(c)分離上述洗脫餾分得到人參餾分PQ2B。
45．按照權(quán)利要求44所述方法制備的人參餾分PQ2B。
46．一種制備人參餾分PQ2C的方法，該方法包括(a)按照權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2分餾，生成一種洗脫餾分，通過凝膠過濾色譜法并采用下列材料測定，該餾分對應(yīng)于洗脫體積在95-110ml之間所觀察到的碳水化合物峰(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖劑；和(c)分離上述洗脫餾分得到人參餾分PQ2C。
47．按照權(quán)利要求46所述方法制備的人參餾分PQ2C。
48．一種制備人參餾分PQ2D的方法，該方法包括(a)按照權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得人參餾分PQ2；(b)將人參餾分PQ2分餾，生成一種洗脫餾分，通過凝膠過濾色譜法并采用下列材料測定，該餾分對應(yīng)于洗脫體積在120-250ml之間所觀察到的碳水化合物峰(1)一個色譜柱，內(nèi)裝有烯丙基葡聚糖和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的球形交聯(lián)共聚物基質(zhì)，該色譜柱的床層尺寸為16×600mm，床層體積為120ml，該色譜柱的分餾范圍(MW)對于球蛋白是5000-250，000，對于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH為7.0的Tris-HCl洗脫緩沖液；和(c)分離上述洗脫餾分得到人參餾分PQ2D。
49．按照權(quán)利要求48所述方法制備的人參餾分PQ2D。
50．一種組合物，該組合物含有下列人參餾分中的至少兩種(a)如權(quán)利要求43所述的人參餾分PQ2A；(b)如權(quán)利要求45所述的人參餾分PQ2B；(c)如權(quán)利要求47所述的人參餾分PQ2C；和(d)如權(quán)利要求49所述的人參餾分PQ2D。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備北美人參(西洋參)餾分的化學(xué)方法和含有這些餾分的組合物。本發(fā)明的產(chǎn)物可用于刺激細(xì)胞因子和/或抗體的生成,或作為以免疫力低下為特征的疾病如感冒、流行性感冒、慢性疲勞綜合征、AIDS和癌癥的靶向治療劑。
文檔編號A61K36/00GK1285752SQ98812069
公開日2001年2月28日 申請日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日
發(fā)明者杰奎琳·J·單, 彼得·K·T·龐, 黃步漢, 凌雷 申請人:Cv技術(shù)公司