本發(fā)明涉及堿性磷酸酶的檢測(cè)技術(shù)，具體為一種用于檢測(cè)堿性磷酸酶的熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

堿性磷酸酶(alp)屬于一種水解酶，具有促使核苷酸、蛋白質(zhì)、糖類等不同底物去磷酸化功能。人血清里alp的正常濃度在40-150mu/ml范圍內(nèi)。濃度出現(xiàn)異常時(shí)常常是一些疾病的先兆，比如肝炎、前列腺癌、骨質(zhì)疏松和骨癌等。在醫(yī)學(xué)診斷上通常被認(rèn)為是一種重要的生物信號(hào)分子，某種程度上alp的活性代表了細(xì)胞的活性。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)alp濃度對(duì)于區(qū)分正常細(xì)胞和異常細(xì)胞(如增生)具有重要意義。

已有一些文獻(xiàn)利用熒光探針和量子點(diǎn)等手段來檢測(cè)alp的活性。其基本原理是利用alp水解酶的去磷酸化活性，將對(duì)硝基苯磷酸基水解為對(duì)硝基酚，產(chǎn)生熒光。但這些探針的靈敏度低，合成過程繁雜，響應(yīng)機(jī)理復(fù)雜。最近，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性(aie)的熒光分子已發(fā)展成為一種新型的熒光材料，這類分子的熒光強(qiáng)度和靈敏度要遠(yuǎn)大于普通熒光分子和量子點(diǎn)，在發(fā)光材料和生物傳感領(lǐng)域得到極大重視。自由aie分子并不發(fā)光，在聚集態(tài)下會(huì)發(fā)出極強(qiáng)的熒光。aie材料中，希夫堿類的aie分子合成簡單，發(fā)光范圍寬廣。最近有一些關(guān)于aie分子在識(shí)別alp方面的報(bào)道，但這些探針的發(fā)光都在綠色和藍(lán)色熒光范圍，在生物領(lǐng)域并不實(shí)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)堿性磷酸酶的熒光探針及其制備方法。該探針能對(duì)堿性磷酸酶選擇性熒光識(shí)別，且靈敏度高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，合成方法簡單，具有良好的生物相容性，能用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶。

本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)堿性磷酸酶的熒光探針，其特征在于，分子式為c21h14no5p，結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)堿性磷酸酶的熒光材料的制備方法，包括如下步驟：

1)按摩爾比1:1.5～2.5將鄰羥基萘甲醛緩慢加入三氯氧磷的吡啶溶液中，室溫?cái)嚢?～6小時(shí)后，將反應(yīng)液倒入冰水中繼續(xù)攪拌12～16小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾，洗滌，硅膠柱色譜分離，得化合物2-磷酸基萘甲醛；

2)按摩爾比為1:1將2-磷酸基萘甲醛和1-氨基萘在有機(jī)醇里加熱回流至少0.5～1.0小時(shí)，冷卻，過濾，洗滌，硅膠柱色譜分離，得目標(biāo)化合物2-磷酸基萘甲醛縮氨基萘(pn)。

步驟1)中所述的室溫?cái)嚢钑r(shí)間為4小時(shí)。

步驟1)中所述的冰水浴攪拌時(shí)間為12小時(shí)。

步驟1)中所述的鄰羥基萘甲醛和三氯氧磷的摩爾比為1:2。

步驟2)中所述的有機(jī)醇可以為1個(gè)碳至5個(gè)碳的有機(jī)醇，優(yōu)選甲醇或乙醇。

本發(fā)明熒光探針對(duì)堿性磷酸酶的識(shí)別體系為ph7.0的緩沖溶液(37℃)，包括磷酸緩沖溶液、hepes緩沖溶液或tris-hcl緩沖溶液，可在溶液和細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)堿性磷酸酶的熒光響應(yīng)。

本發(fā)明熒光探針對(duì)堿性磷酸酶的檢出限為0.002u/ml。

本發(fā)明合成的熒光探針pn在水溶液中并不發(fā)光，這是由于2位磷酸基的存在阻止了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ict)效應(yīng)；在alp的作用下，磷酸基被水解為羥基，羥基ict效應(yīng)被激活，探針就會(huì)在水溶液中發(fā)生aie聚集發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)出極強(qiáng)橙色熒光，便于裸眼識(shí)別，從而提高對(duì)堿性磷酸酶的檢測(cè)效果。

與傳統(tǒng)生物試劑比較，該熒光探針響應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能長時(shí)間保存，且具有生物相容性好、對(duì)細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。該探針可用于研究溶液中及細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的含量及在細(xì)胞中的定位，對(duì)相關(guān)疾病如癌癥、艾滋病等的診斷具有重要意義。

附圖說明

圖1熒光探針pn的合成路線。

圖2熒光探針pn的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖3熒光探針pn對(duì)堿性磷酸酶選擇性識(shí)別的熒光光譜，hepes緩沖溶液(ph7.0)，[pn]＝10μmol·l^-1，[蛋白]＝(2.0u/ml)，λex＝480nm,t＝20min,37℃。

圖4熒光探針pn與堿性磷酸酶作用的熒光光譜，[pn]＝10μmol·l^-1，[alp]＝(0,0.01,0.25,0.5,0.75,1.0,1.25,1.5,1.75,2.0u/ml)，hepes緩沖溶液(ph7.0)，λex＝480nm，t＝20min,37℃。

圖5細(xì)胞sw480熒光成像：a為細(xì)胞空白實(shí)驗(yàn)，不加探針；b細(xì)胞加探針；c是a的明場(chǎng),d是b的明場(chǎng)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

熒光探針pn的合成(合成路線見圖1)：

將鄰羥基萘甲醛(0.17g，1.0mmol)緩慢加入溶解有三氯氧磷(0.2ml,2.0mmol)的20ml吡啶溶液中，在圓底燒瓶中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)；再將反應(yīng)液倒入含有50ml冰水的圓底燒瓶中，繼續(xù)攪拌12小時(shí)，過濾，硅膠柱色譜分離，得化合物2-磷酸基萘甲醛(0.25g)。

將1-氨基萘(0.14g，1.0mmol)和2-磷酸基萘甲醛(0.25g，1.0mmol)在20ml甲醇里加熱回流0.5小時(shí)，冷卻，過濾，洗滌，硅膠柱色譜分離，得目標(biāo)化合物pn(0.37g)。

由電噴霧質(zhì)譜表征可知化合物pn：實(shí)驗(yàn)值m/z＝375.3[m+h]⁺，理論值m/z＝375.3[m+h]⁺(附圖2)。核磁¹h-nmr(dmso)，δ(ppm,300mhz，tms)：δ7.86(s，1h,phen-h),7.93(s，1h，phen-h)，7.63(s，1h，phen-h)，7.21(s，1h,phen-h)，7.30(m，5h，phen-h)，7.53(s，1h)，7.7(t，3h，phen-h)，8.39(1h，-hc＝n)。元素分析(％c)：理論值67.20，h：3.76，n：3.73，實(shí)驗(yàn)值c：67.25，h：3.66，n：3.70。

實(shí)施例2

熒光探針pn在hepes(ph7.0)緩沖溶液中首先可以實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中堿性磷酸酶(alp)的熒光響應(yīng)，如附圖3。將2.0u/ml的蛋白alp,gdp，acp，pde，gal，ache，gox和trysin分別加入10μmol·l^-1pn的hepes(ph7.0)緩沖溶液中。由附圖3可知，alp的加入使得溶液在523，550和600nm處的熒光大幅度增強(qiáng)(λex＝480nm)，溶液的顏色逐漸變?yōu)槌壬?。其他常見蛋白分子gdp，acp，pde，gal，ache，gox和trysin的加入基本不影響到熒光探針pn的熒光強(qiáng)度，表明探針pn在hepes(ph7.0)緩沖溶液中對(duì)alp具有選擇性識(shí)別功能，其他常見蛋白基本不會(huì)對(duì)alp的識(shí)別產(chǎn)生干擾作用。附圖4為不同濃度的alp對(duì)探針pn的熒光滴定圖。由圖可見，隨著alp的加入，探針pn溶液的熒光逐漸增強(qiáng)。經(jīng)dl＝3sb/s公式計(jì)算，探針pn對(duì)alp蛋白的檢出限為0.002u/ml。

實(shí)施例3

探針pn可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)源alp的傳感。圖5中a為空白實(shí)驗(yàn)，不加探針。圖5中b為將10μmol·l^-1探針pn與sw480cells在細(xì)胞培養(yǎng)液中37℃孵育0.5小時(shí)。在熒光顯微鏡下可以清楚地看到，細(xì)胞在加入探針pn后，逐漸發(fā)出橙色的熒光。圖5中c和d分別為圖5中a和b相應(yīng)的明場(chǎng)圖片。該實(shí)驗(yàn)表明探針pn對(duì)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源alp具有良好的熒光識(shí)別功能。