稀堿—酶解提取法提取豬鼻骨中的硫酸軟骨素的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，屬于從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate)是一種酸性粘多糖，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的 軟骨、喉骨、鼻骨和氣管中。硫酸軟骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結(jié)而成的雙糖聚 合物，它含有50?70個(gè)雙糖基本結(jié)構(gòu)，分子量為10000?50000。按其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)， 可分為05八、(：、03、？、11等多種同分異構(gòu)體，藥用硫酸軟骨素是從動(dòng)物軟骨中提取的，主 要是A、C及各種硫酸軟骨素的混合物。CSA和CSC均由D2氨基葡萄糖醛和N2乙酰2D2氨 基半乳糖組成，只是硫酸基團(tuán)位置不同。
[0003] 硫酸軟骨素通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成糖蛋白的形式存在，當(dāng)其水解時(shí)發(fā)生消去反應(yīng)， 連接硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)中絲氨酸羥基的苷鍵斷裂，可以得到游離態(tài)的硫酸軟骨素。硫酸 軟骨素為白色或微黃色粉末，具有吸濕性，易溶于水而成粘度較大的溶液，難溶于甲醇、乙 醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有機(jī)溶劑，并且遇熱不穩(wěn)定，乙?；装l(fā)生水解脫落，在酸 性條件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸軟骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎癥及抗腫 瘤等生理活性，臨床上可用于預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化、提高機(jī)體免疫力、治療風(fēng)濕病和腎炎及由 鏈霉素引起的聽覺障礙。硫酸軟骨素與銅等金屬離子結(jié)合可用于治療皮膚病，與硝酸鉍或 氫氧化鋁反應(yīng)得到的絡(luò)合物可用于治療消化性潰瘍，與苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作 用生成的衍生物可用作麻醉劑。作為食品添加劑，硫酸軟骨素可用于食品的乳化、保濕和祛 除異味。在化妝品中添加硫酸軟骨素，可調(diào)節(jié)皮膚的細(xì)胞代謝，促進(jìn)營養(yǎng)的吸收，保持皮膚 的水分和改善發(fā)質(zhì)。
[0004] 隨著硫酸軟骨素生物活性不斷被揭示和其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，有關(guān)硫酸軟骨 素的提取、純化和分離技術(shù)已取得了一定的研宄成果，但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際還有許多需要改 進(jìn)和完善之處。目前，硫酸軟骨素生產(chǎn)廠家主要采用的方法成本高，產(chǎn)率和純度低。所以， 本公司開發(fā)了稀堿一一酶解提取法從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素，以降低成本，提高效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種全新的方法（稀堿一一酶解提取法）從豬鼻骨中提取硫酸軟骨 素，能夠有效地降低成本，并提高產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度。
[0006] 為此，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] 1 ?堿解
[0008] 將豬鼻骨粉碎，放入80°C水中煮4?6小時(shí)，然后按原料（干質(zhì)量）與5%的氫氧 化鈉溶液的比例為1 : 6. 75的量加入氫氧化鈉溶液，于40°C下提取3小時(shí)，然后用鹽酸調(diào) pH到6?6. 5,雙層紗布過濾；留下濾液，濾渣再以1 : 6. 75的質(zhì)量比加入5%的氫氧化 鈉溶液，于40°C下提取2小時(shí)，再用雙層濾布過濾；棄濾渣，取濾液。合并2次濾液，并測量 體積待用。
[0009] 2?酶解
[0010] 將濾液調(diào)節(jié)pH到8.0?9.0,按濾液與胰蛋白酶1000 : 0.5的質(zhì)量比加入胰蛋白 酶，于40?50°C酶解1.5小時(shí)后，再按1000 : 0.5的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，40?50°C酶解 2小時(shí)。
[0011] 3.吸附
[0012] 過濾后加入高嶺土和活性炭吸附。用氯仿反萃取法萃取濾液，留水層。
[0013] 4.沉淀
[0014] 調(diào)節(jié)水層pH至6. 8?7. 2,再加入2. 5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，靜置 12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨索。
[0015] 5.純化
[0016] 將硫酸軟骨素溶于濃度為2% (m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜 置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨 素。
[0017] 6.脫水
[0018] 最后，用95%以上的丙酮對產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：用堿解與酶解相結(jié)合的方法分離豬鼻骨中的硫酸軟骨素， 并且增加了純化過程，有效地降低了生產(chǎn)成本，并且提高了產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度。
【附圖說明】
[0020] 圖1是工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0022] 1 ?堿解
[0023] 稱取100千克豬鼻骨粉碎，放入80°C水中煮4?6小時(shí)，然后加入5%的氫氧化鈉 溶液675升，于40°C下提取3小時(shí)，然后用鹽酸調(diào)pH到6?6. 5,雙層紗布過濾；留下濾液， 濾渣再以1 : 6. 75的質(zhì)量比加入5%的氫氧化鈉溶液，于40°C下提取2小時(shí)，再用雙層濾 布過濾；棄濾渣，取濾液。合并2次濾液，并測量體積待用。
[0024] 2?酶解
[0025] 將濾液調(diào)節(jié)pH到8. 0?9. 0,按濾液與胰蛋白酶1000 : 0. 5的質(zhì)量比加入胰蛋白 酶，于46°C酶解1.5小時(shí)后，再按1000 : 0.5的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，42°C酶解2小時(shí)。
[0026] 3?吸附
[0027] 過濾后加入高嶺土和活性炭吸附。用氯仿反萃取法萃取濾液，留水層。
[0028] 4?沉淀
[0029] 調(diào)節(jié)水層pH至6. 8?7. 2,再加入2. 5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬螅o置 12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨索。
[0030] 5?純化
[0031] 將硫酸軟骨素溶于濃度為2% (m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜 置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨 素。
[0032] 6?脫水
[0033] 最后，用95%以上的丙酮對產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。
[0034] 7?對照
[0035] 稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用傳統(tǒng)工藝提取其中的硫酸軟骨素。通過對 照發(fā)現(xiàn)：傳統(tǒng)工藝明顯地成本高，效益低。
[0036] 表1兩種工藝產(chǎn)出效果對照表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 稀堿一酶解提取法提取豬鼻骨中的硫酸軟骨素； 其特征在于：采用堿解法與酶解法相結(jié)合的方法將豬鼻骨中的硫酸軟骨素提取出來。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法； 其特征在于：提取豬鼻骨中的硫酸軟骨素采用如下步驟：堿解，酶解，吸附，沉淀，純 化，脫水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法； 其特征在于：在乙醇沉淀之前，先用胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解，再用高嶺土和活性碳吸 附。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法； 其特征在于：在堿解過程中，按原料(干質(zhì)量)與5%的氫氧化鈉溶液的比例為1 : 6. 75 的量加入氫氧化鈉溶液以提取豬鼻骨中的硫酸軟骨素，并且提取溫度為40°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法； 其特征在于：在酶解過程中，先按濾液與胰蛋白酶1000 : 0.5的質(zhì)量比加入胰蛋白酶， 再按1000 : 0.5的質(zhì)量比加入胃蛋白酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法； 其特征在于：在純化過程中，用于溶解硫酸軟骨素的氯化鈉溶液濃度為2%(m/v)。
【專利摘要】稀堿—酶解提取法提取豬鼻骨中的硫酸軟骨素，經(jīng)過堿解、酶解、吸附、沉淀、純化、脫水六個(gè)步驟從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素。結(jié)果堿解與酶解結(jié)合法與傳統(tǒng)提取方法相比較，乙醇用量減少88%左右，純度提高19％左右，產(chǎn)率提高8%左右。
【IPC分類】C08B37-08
【公開號】CN104558245
【申請?zhí)枴緾N201410816780
【發(fā)明人】劉乃山, 姜德志, 遲培升
【申請人】青島九龍生物醫(yī)藥有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日