專利名稱：堿性磷酸酶在酵母中的表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)和表達真核堿性磷酸酶的方法。本發(fā)明還涉及密碼子優(yōu)化的DNA，其編碼比活性在3000U/mg以上的高活性真核堿性磷酸酶。另外，本發(fā)明也涉及將DNA插入在酵母細胞中表達的載體中的方法。
背景技術(shù)：
堿性磷酸酶(AP)是二聚體、含鋅的非特異性磷酸單酯酶，在諸如大腸桿菌和哺乳動物的原核及真核生物中均存在(McComb et al.，《堿性磷酸酶》Plenum Press，New York)。多種堿性磷酸酶的一級結(jié)構(gòu)比較顯示了高度同源性(大腸桿菌和哺乳動物AP間的同源性為25-30％；Millan，1988 Anticancer Res.8，995-1004；Harris，1989 Clin.Chim.Acta 186，133-150)。
在人和高等動物中，AP家族包括位于不同基因座的四個成員(Millan，1988 Anticancer Res.8，995-1004；Harris 1989 Clin.Chim.Acta186，133-150)。堿性磷酸酶家族包括組織特異性AP(胎盤AP(PLAP)，生殖細胞AP(GCAP)和腸AP(IAP))和主要位于肝臟、腎臟和骨骼的非組織特異性AP(TnAP)。
已知的AP的一個決定性的特征是哺乳動物AP催化活性的高可變性，其kcat值高于大腸桿菌AP的10到100倍。在哺乳動物AP中，來自牛腸(bIAP)的AP具有最高的比活性。該特性使得bIAP對于生化應(yīng)用頗具吸引力，如使用相應(yīng)的酶輟合物作為診斷試劑，或使DNA脫磷酸化。在EP0955369和Manes等(Manes et al.(1998)，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)的文章中報導(dǎo)，存在各種具有不同比活性的牛腸堿性磷酸酶。目前，重組表達低活性(最高3000U/mg)真核堿性磷酸酶已經(jīng)在CHO細胞(bIAP I/WO 93/18139；Weissig et al.1993，Biochem.J.260，503-508)和COS細胞(人胎盤AP/Berger et a.，1987，Biochemistry 84，4885-4889)等多種真核細胞系或桿狀病毒表達系統(tǒng)(人胎盤AP/Davis et al.1992，Biotechnology 10，1149-1150)中實現(xiàn)。在CHO細胞中表達更高活性牛腸AP(比活性大于3000U/mg)也有報導(dǎo)(bIAPII，III和IV/Manes et al.1998，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)。但是，在這些表達系統(tǒng)中表達堿性磷酸酶的缺點是低表達量，這使得重組生產(chǎn)高活性AP尤為不經(jīng)濟。
盡管，從理論上說，可以在大腸桿菌等原核宿主中表達真核堿性磷酸酶(人胎盤AP/Beck and Burtscher，1994蛋白表達和純化5，192-197)，但在原核生物中表達的堿性磷酸酶沒有糖基化，而這對制備酶輟合物尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是發(fā)展一種高效穩(wěn)定的表達方法，用以生產(chǎn)具有高比活性的糖基化真核堿性磷酸酶，由于該方法的表達量高，可以經(jīng)濟地生產(chǎn)這種堿性磷酸酶，并且產(chǎn)生比活性和熱穩(wěn)定性等特性與天然高活性或低活性堿性磷酸酶(可向Roche Diagnostics GmbH，Biozyme，Oriental Yeast等商購)相當(dāng)?shù)拿浮?br> 本發(fā)明的目的通過在酵母特別是甲基營養(yǎng)型酵母中生產(chǎn)高比活性真核堿性磷酸酶的方法得以實現(xiàn)，該方法包括如下步驟a)克隆一種基因序列進入不同的載體b)轉(zhuǎn)化酵母c)表達，以及d)純化堿性磷酸酶，其特征在于(i)第一載體具有針對第一選擇標記的抗性基因，(ii)抗性基因和基因序列已經(jīng)整合到基因組的轉(zhuǎn)化子通過在含有低濃度第一選擇標記的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，(iii)基因拷貝數(shù)通過多重轉(zhuǎn)化增加，其中多重轉(zhuǎn)化子通過在選擇壓力增加的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，(iv)加入除基因序列外還有針對第二選擇標記的抗性基因的第二載體，(v)基因拷貝數(shù)通過第二載體的多重轉(zhuǎn)化增加，其中多重轉(zhuǎn)化子通過在選擇壓力增加的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，
(vi)選擇幾個拷貝的基因序列和選擇標記抗性基因已經(jīng)以穩(wěn)定方式整合進基因組的克隆。
優(yōu)選的基因序列是編碼比活性超過3000U/mg、特殊情況下超過7000U/mg到約10000U/mg的真核堿性磷酸酶的DNA序列。例如，已經(jīng)證實SEQ ID NO1的DNA序列適合用于本發(fā)明。在氨基酸水平上相應(yīng)于SEQ ID NO1的密碼子優(yōu)化的DNA序列是特別優(yōu)選的。密碼子優(yōu)化是指SEQ ID NO1的每個密碼子已經(jīng)通過靜默突變優(yōu)化，根據(jù)選定表達宿主增加翻譯，從而產(chǎn)生SEQ ID NO5的序列，靜默突變是指DNA水平改變但氨基酸水平?jīng)]有改變。但是，也可以將與SEQ IDNO1不同、編碼堿性磷酸酶的序列插入載體，所述序列可選地是密碼子優(yōu)化的，如bIAPI，III，IV(DE 198 19 962和EP 0 955 369)。本發(fā)明的方法特別優(yōu)選使用SEQ ID NO5的密碼子優(yōu)化的基因序列。相應(yīng)基因序列然后被克隆進一個或幾個載體，載體根據(jù)待轉(zhuǎn)化的宿主選擇。
甲基營養(yǎng)型酵母如巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母以及其它酵母如釀酒酵母、Yarrowia lipolytica或粟酒裂殖酵母特別適合作為酵母宿主。合適的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，如pPICZαA，pIIC9K，Yes載體，pTEF1/Zeo，pYDI(如Invitrogen)。優(yōu)選以此方式形成的表達載體以穩(wěn)定方式轉(zhuǎn)化進巴斯德畢赤酵母的各種菌株并整合進基因組。穩(wěn)定整合進酵母基因組的優(yōu)勢在于在隨后大體積發(fā)酵生產(chǎn)例如真核高活性堿性磷酸酶時無需選擇壓力。穩(wěn)定整合進基因組是指表達載體通過同源重組等插入例如巴斯德畢赤酵母的基因組中，從而作為永久性成分通過遺傳代代相傳(Cregg，J.M.et al.，Mol.Cell.Biol.5(1985)，3376-3385)。
基因拷貝數(shù)在甲基營養(yǎng)型酵母中通過多重轉(zhuǎn)化增加，同時以合適的選擇標記如Zeocin或遺傳霉素(G418)或營養(yǎng)缺陷型標記增加選擇壓力，然后，只有幾個拷貝的表達載體穩(wěn)定整合進基因組的克隆可以存活。要對較高濃度的用作選擇標記的抗生素有抗性，該克隆必須產(chǎn)生更多的抗性蛋白。這可以通過表達載體的多重整合實現(xiàn)，所述表達載體含有高活性堿性磷酸酶表達盒和用作選擇標記的抗生素的抗性基因。
以具有高表達量的高效穩(wěn)定的表達方法經(jīng)濟地生產(chǎn)真核堿性磷酸酶的目的只有同時采取(i)到(vi)的措施才可實現(xiàn)。因此，不采取這些措施用含有SEQ ID NO1的bIAPII基因的表達載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株X-33(見實施例1和2)不會得到所需的結(jié)果。盡管該方法使得表達量相對于在CHO細胞中表達bIAPII(Manes et al.，1998，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)有顯著增加，但該方法仍無法經(jīng)濟地生產(chǎn)重組堿性磷酸酶。
本發(fā)明的方法的一個必需措施是合成密碼子優(yōu)化的基因序列。為了優(yōu)化酵母中表達的每個密碼子，需要全部從頭合成編碼高活性真核堿性磷酸酶的約1.5kbp長的基因。可以通過重新翻譯SEQ ID NO4的高活性真核堿性磷酸酶(bIAP-II)的氨基酸序列并使用簡并密碼優(yōu)化需要優(yōu)化的每個密碼子。為此目的，該基因被分成長度為54到82個核苷酸的28個寡核苷酸。寡核苷酸被設(shè)計成5′和3′末端彼此以互補方式與相鄰寡核苷酸重疊的有義鏈和反義鏈片段的交替序列。各例中重疊區(qū)域經(jīng)過選擇，使得在隨后的PCR反應(yīng)中退火過程中非特異性結(jié)合大部分被阻止?；?′和3′末端的寡核苷酸有編碼區(qū)上游和下游的限制性內(nèi)切酶的識別位點，它可以用于隨后將SEQ ID NO5的合成基因插入表達載體中。因此，限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別位點插入上游，限制性內(nèi)切酶Asp718的識別位點插入下游。寡核苷酸序列示于SEQ ID NO6到33。
基因合成通過PCR反應(yīng)進行。為此目的，編碼區(qū)首先被分成3個區(qū)段(寡核苷酸6到15，16到23、24到33)，這些區(qū)段在獨立的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生。在使用重疊互補寡核苷酸通過PCR反應(yīng)進行基因合成時，基因片段逐步延長，以形成全長產(chǎn)物，在隨后的循環(huán)中該產(chǎn)物再擴增。該方法中的退火溫度取決于融解溫度最低的重疊區(qū)。
3個區(qū)段然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，具有預(yù)期長度的產(chǎn)物通過QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從凝膠中分離，在隨后的PCR反應(yīng)中合成，以形成完整的基因產(chǎn)物。在該方法中，前5個循環(huán)的PCR反應(yīng)中不加入完整基因的5′和3′末端引物，使得只有一些具有預(yù)期長度的基因產(chǎn)物的片段首先從3個區(qū)段形成。退火溫度取決于融解溫度最低的重疊區(qū)。隨后，加入終末引物，相應(yīng)于融解溫度最低的引物的退火溫度增加退火溫度。具有預(yù)期長度的基因片段在隨后的25個循環(huán)中高度擴增。
PCR混合物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，分離出具有預(yù)期到大小的基因片段(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)。
這種PCR片段的克隆、轉(zhuǎn)化進巴斯德畢赤酵母和表達如實施例3所述。
高活性堿性磷酸酶的密碼子優(yōu)化的基因使得表達量相對于以野生型基因進行的第一次實驗增加了3倍。
但是，這些克隆并未提供生產(chǎn)高活性堿性磷酸酶的經(jīng)濟方法。
增加巴斯德筆觸畢赤酵母中異源和同源蛋白的表達量的一個措施是通過多重轉(zhuǎn)化增加細胞中的基因拷貝數(shù)。該措施可增加靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA。基因拷貝數(shù)通過含有表達載體的克隆的多重轉(zhuǎn)化同時在隨后轉(zhuǎn)化子在含有濃度更高的用作選擇標記的抗生素的營養(yǎng)平板上生長時增加選擇壓力而增加。在該方法中，由第一輪轉(zhuǎn)化中獲得了至少一個拷貝的表達載體的表達克隆再次成為感受態(tài)(見實施例1)，再次用表達載體轉(zhuǎn)化。通過涂布于含有更高濃度選擇壓力的營養(yǎng)平板即含有比第一輪轉(zhuǎn)化更高濃度的作為選擇標記的抗生素(如Zeocin)的平板上來選擇已經(jīng)有幾個拷貝的表達載體整合進基因組的轉(zhuǎn)化子。為此，確定由第一輪轉(zhuǎn)化獲得的克隆仍能生長的作為選擇標記的抗生素的最高濃度，再次轉(zhuǎn)化后，YPDS瓊脂平板中作為選擇標記的抗生素的濃度相應(yīng)增加到高于確定的閾值。增加表達載體的拷貝數(shù)也同時增加了作為表達載體一種成分的抗性基因的拷貝數(shù)，因此也增加了對更高濃度作為選擇標記的抗生素的抗性。也可以通過改變營養(yǎng)平板中作為選擇標記的抗生素的濃度來選擇基因組中含有不同拷貝數(shù)表達載體的克隆(約100到2000μg/ml，見實施例4)。
另一個可以用來增加巴斯德畢赤酵母等酵母中的異源和同源蛋白的表達量的措施時通過多重選擇來增加基因拷貝數(shù)。為此，已經(jīng)通過含有靶基因表達盒(例如SEQ ID NO5的編碼高活性堿性磷酸酶的基因)和用作選擇標記的第一種抗生素(如Zeocin)的抗性基因的表達載體的多重轉(zhuǎn)化優(yōu)化的表達克隆用第二種表達載體轉(zhuǎn)化，第二種載體含有靶基因(例如SEQ ID NO5的編碼高活性堿性磷酸酶的基因)和用作選擇標記的第二種抗生素(如遺傳霉素(G418))的抗性基因。當(dāng)轉(zhuǎn)化子隨后在含有用作選擇標記的第二種抗生素的異源平板上鋪平板時，選擇出來的克隆除了含有用作選擇標記的第一種抗生素的抗性基因的表達載體的拷貝外，也獲得了至少一個拷貝含有作為選擇標記的第二種抗生素的抗性基因的表達載體。這些表達克隆然后就可以用含有作為選擇標記的第二種抗生素的抗性基因的表達載體進一步進行多重轉(zhuǎn)化(見實施例5)。
通過綜合多重轉(zhuǎn)化和雙重選擇，可以使表達量相對于含有密碼子優(yōu)化基因的第一輪轉(zhuǎn)化克隆增加4倍。
重組進行磷酸酶可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的提取方法由生物體中提取，提取方法例見《蛋白純化》，Springer Verlag，編輯RobertScopes(1982)。比活性大于7000U/mg的純化帶產(chǎn)物通過色譜分離方法獲得，特別是使用疏水柱材料和陽離子交換劑的方法。
純化產(chǎn)物進行N末端測序，以鑒定重組的高活性堿性磷酸酶。
確定的主要序列是EAEAEFLIPA(SEQ ID NO36)。該序列明顯與AP＂LIPA＂(SEQ ID NO37)的N末端序列和構(gòu)建體EAEAEF連接肽(SEQ ID NO38)有關(guān)，所述構(gòu)建體是通過克隆基因序列至載體中的策略和通過Kex2信號肽酶(如Invitrogen)切割α因子信號肽而形成。
重組堿性磷酸酶產(chǎn)物的穩(wěn)定性與天然堿性磷酸酶進行比較。當(dāng)溶液經(jīng)受熱脅迫時(55℃)，樣品產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
因此，本發(fā)明首次公開了一種方法，它可以由哺乳動物細胞如牛腸經(jīng)濟地生產(chǎn)重組堿性磷酸酶，所述重組酶具有與來自牛腸的天然高活性堿性磷酸酶相當(dāng)?shù)奶匦?，并被糖基化?br> 本發(fā)明也涉及SEQ ID NO5的DNA序列，其用作在巴斯德畢赤酵母中表達高活性堿性磷酸酶基因的密碼子優(yōu)化基因序列。
本發(fā)明的另一個主題是含有SEQ ID NO5的載體，特別優(yōu)選的是圖2的pHAP10-3載體。pHAP10-3載體時可商購的載體pPICZαA，含有AOX1啟動子控制下的SEQ ID NO5的本發(fā)明基因。
本發(fā)明的另一個主題是已用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株。特別優(yōu)選的是用載體pHAP10-3轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母X-33菌株。
另一種優(yōu)選的載體是含有來自pHAP10-3的整個表達盒的載體，它基本上含有AOX1啟動子；來自釀酒酵母的α因子的信號肽，它以正確的讀框克隆在信號肽之后；SEQ ID NO5的密碼子優(yōu)化的靶基因，它編碼高活性堿性磷酸酶；以及AOX1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(見圖3)。載體pHAP10-3/9K是特別優(yōu)選的，它含有可商購的載體pPIC9K(Invitrogen)和來自pHAP10-3的表達盒，包括SEQ ID NO5的合成基因。
載體pHAP10-3和pHAP10-3/9K同等相關(guān)，因為最終生產(chǎn)克隆含有兩個載體的拷貝。
本發(fā)明的另一個主題是已經(jīng)用pHAP10-3/9K載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體和宿主對本發(fā)明也是合適的，如YES載體、pYD1、pTEF1/ZEO(Invitrogen)和釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、多形漢遜酵母、Yarrowia lipolytica，特別是巴斯德畢赤酵母X-33。本發(fā)明特別優(yōu)選用載體pHAP10-3/9K轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母X-33菌株。
因此，本發(fā)明的另一個主題是生產(chǎn)高活性真核堿性磷酸酶的方法，通過在已經(jīng)用本發(fā)明的一個或幾個載體特別是用pHAP 10-3或pHAP10-3/9K載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株表達蛋白來生產(chǎn)。已經(jīng)用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌株對本發(fā)明的方法是特別優(yōu)選的。已經(jīng)用pHAP10-3和pHAP10-3/9K載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌株X-33尤為優(yōu)選。


圖1在pICZαA(Invitrogen)中含有bIAPII基因的表達載體pHAP1的質(zhì)粒圖。
圖2在pPIC9K(Invitrogen)中含有合成基因的表達載體pHAP10-3的質(zhì)粒圖。
圖3在pPIC9K(Invitrogen)中含有合成基因的表達載體pHAP10-3/9K的質(zhì)粒圖。
縮寫YPD酵母蛋白胨葡萄糖YPDS酵母蛋白胨葡萄糖山梨糖醇BMGY緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基BMMY緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基
具體實施例方式
實施例1克隆bIAPII基因首先在SEQ ID NO1的bIAPII基因(EP 0955 369；Manes et al.，1989，J.Biol.Chem.273 No.36，23353-23360)的上游和下游提供限制性內(nèi)切酶切割位點，該切割位點適合用于通過PCR和選擇SEQ ID NO2和3的合適引物克隆進巴斯德畢赤酵母表達載體。因此，EcoRI限制性內(nèi)切酶切割位點連接在上游，Asp718I限制性內(nèi)切酶切割位點連接在下游。
PCR片段用EcoRI和Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)重新切割，再次分離(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)，然后再連接至已經(jīng)用EcoRI和Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)線性化的表達載體pPICZαA(Invitrogen)的載體片段，并分離(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)。在該載體中，bIAPII基因處于AOX1(巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1啟動子，可以用甲醇誘導(dǎo))啟動子控制之下，并以正確的讀框克隆在釀酒酵母α因子信號肽之后。然后，通過限制性內(nèi)切酶分析和測序分析以此方式插入的基因片段是否無誤。以此方式形成的含有編碼高活性真核堿性磷酸酶的bIAPII基因的表達載體被稱為pHAP-1(見圖1)。
在巴斯德畢赤酵母中pHAP-1的轉(zhuǎn)化為了在巴斯德畢赤酵母X-33中轉(zhuǎn)化pHAP-1并隨后整合進基因組中，載體首先用SacI(Roche Diagnostics GmbH)線性化。轉(zhuǎn)化使用GenePulserII(Biorad)通過電穿孔進行。
將5毫升YPD培養(yǎng)基(Invitorgen)中接種巴斯德畢赤酵母野生型菌株菌落，30℃振蕩溫育過夜。然后用過夜培養(yǎng)物以1∶2000接種200毫升新鮮YPD培養(yǎng)基(Invitrogen)，30℃振蕩溫育過夜，直至OD600達到1-3到1.5。將細胞離心(1500×g/5分鐘)，沉淀重懸于200毫升冰冷無菌水中(0℃)。細胞再次離心(1500×g/5分鐘)，重懸于100毫升冰冷無菌水中(0℃)。細胞再次離心并重懸于10毫升冰冷(0℃)的1M山梨糖醇(ICN)中。以此方式獲得的細胞保持在冰上，立即用于轉(zhuǎn)化。
約1μg線性化pHAP-1載體DNA加入80μl細胞，將整個混合物轉(zhuǎn)移到冰冷(0℃)的電穿孔池中，冰上溫育5分鐘。隨后，將電穿孔池轉(zhuǎn)移到Gene PulserII(Biorad)中，在1kV/1kΩ/25μF下進行轉(zhuǎn)化。電穿孔后，將1毫升1M山梨糖醇(ICN)加入混合物，然后取100到150μl涂布于含有100μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS瓊脂平板(Invitrogen)上。平板然后在30℃溫育2-4天。
Raster MD(基本葡萄糖)平板用克隆接種，然后進一步進行分析。選出生長的克隆，重懸于20μl無菌水中，用17.5U溶細胞酶(RocheDiagnostics GmbH)(1h，37℃)裂解，通過PCR直接檢查bIAPII表達盒是否正確整合。
轉(zhuǎn)化過程中完整表達盒整合進基因組的克隆用于表達實驗。
高活性堿性磷酸酶的表達3ml BMGY培養(yǎng)基(Invitrogen)用陽性克隆接種，30℃振蕩溫育過夜。隨后，在600nm處確定OD，轉(zhuǎn)接10毫升BMMY培養(yǎng)基(Invitrogen)使其OD600為1。BMMY培養(yǎng)基(Invitrogen)含有甲醇(Mallinckrodt BakerB.V.)，它通過AOX1啟動子誘導(dǎo)高活性堿性磷酸酶的表達。
搖瓶30℃振蕩溫育，每24小時取樣，確定OD600，測定高活性堿性磷酸酶的表達活性，加入0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)進行進一步誘導(dǎo)。表達實驗進行96小時。
實施例2高活性堿性磷酸酶活性測定取出500μl實施例1的表達混合物，確定OD600，將細胞離心。儲存上清，細胞沉淀重懸，以相應(yīng)于OD600的一定量Y-PERTM(50到300μl/Pierce)裂解，室溫振蕩1小時。隨后，裂解物離心除去細胞沉淀(15000×g/5分鐘)，上清轉(zhuǎn)移到新鮮反應(yīng)容器中。5μl裂解物用于活性檢測。
活性檢測的原理如下測定405納米的吸光度增加值。
50μl 4-硝基苯磷酸溶液(0.67mol/14-硝基苯磷酸，鈉鹽(RocheDiagnostics GmbH))加入至3毫升二乙醇胺緩沖液(1mol/l二乙醇胺(Merck)pH9.8，0.5mmol/1 MgCl2(Riedelde Haen))，混合物于37℃溫育。然后加入5μl裂解物起始反應(yīng)，持續(xù)3分鐘測定37℃吸光度變化，由此計算ΔA/min。
根據(jù)下式計算活性 ε＝18.2[1×mmol-1×cm-1]因子X＝細胞裂解后濃度因子表達培養(yǎng)物培養(yǎng)基上清的活性以類似方式確定。這種情況下反應(yīng)也通過加入5μl上清起始，另外還加入0.5mM Zncl2。計算時不考慮因子X。
實施例3克隆基因合成的PCR片段用EcoRI和Asp718(Roche Diagnostics GmbH)再次切割PCR片段，再次分離(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)，然后連接至已用EcoRI和Asp718(Roche Diagnostics GmbH)線性化處理的表達載體pPICZαA(Invitrogen)的載體片段，再分離(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)。在此載體中，合成基因處于AOX1啟動子(巴斯德畢赤酵母醇氧化酶1啟動子，可用甲醇誘導(dǎo)，Malinckrodt Baker B.V.)控制之下，以正確的讀框克隆在釀酒酵母α因子的信號肽之后。然后通過限制性分析和測序檢查以此方式插入的基因片段是否無誤。以此方式形成的含有編碼高活性真核堿性磷酸酶的合成基因的表達載體被稱為pHAP10-3(見圖2)。
在巴斯德畢赤酵母中pHAP10-3的轉(zhuǎn)化為了在巴斯德畢赤酵母中進行pHAP10-3的轉(zhuǎn)化并整合進基因組中，載體首先用SacI(Roche Diagnostics GmbH)線性化處理。使用GenePulser II(Biorad)通過電穿孔進行轉(zhuǎn)化。將5毫升YPD培養(yǎng)基(Invitrogen)接種巴斯德畢赤酵母菌落，30℃振蕩溫育過夜。然后用過夜培養(yǎng)物以1∶2000轉(zhuǎn)接200毫升新鮮YPD培養(yǎng)基(Invitrogen)，30℃振蕩溫育過夜，直至OD600達到1.3到1.5。將細胞離心(1500×g/5分鐘)，沉淀重懸于200毫升冰冷無菌水中(0℃)。細胞再次離心(1500×g/5分鐘)，重懸于100毫升冰冷無菌水中(0℃)。細胞再次離心并重懸于10毫升冰冷(0℃)的1M山梨糖醇(ICN)中。以此方式獲得的細胞保持在冰上，立即用于轉(zhuǎn)化。
約1μg線性化pHAP10-3載體DNA加入80μl細胞，將整個混合物轉(zhuǎn)移到冰冷(0℃)的電穿孔池中，冰上溫育5分鐘。隨后，將電穿孔池轉(zhuǎn)移到Gene PulserII(Biorad)中，在1kV/1kΩ/25μF下進行轉(zhuǎn)化。電穿孔后，將1毫升1M山梨糖醇(ICN)加入混合物，然后取100到150μl涂布于含有100μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS瓊脂平板(Invitrogen)上。平板然后在30℃溫育2-4天。
Raster MD(基本葡萄糖)平板用克隆接種，然后進一步進行分析。選出生長的克隆，重懸于20μl無菌水中，用17.5U溶細胞酶(RocheDiagnostics GmbH)(1h，37℃)裂解，通過PCR直接檢查合成AP表達盒是否正確整合。
轉(zhuǎn)化過程中完整表達盒整合進基因組的克隆用于表達實驗。
高活性堿性磷酸酶的表達3ml BMGY培養(yǎng)基(Invitrogen)用陽性克隆接種，30℃振蕩溫育過夜。隨后，在600nm處確定OD，轉(zhuǎn)接10毫升BMMY培養(yǎng)基(Invitrogen)使其OD600為1。BMMY培養(yǎng)基(Invitrogen)含有甲醇(Mallinckrodt BakerB.V.)，它通過AOX1啟動子誘導(dǎo)高活性堿性磷酸酶的表達。
搖瓶30℃振蕩溫育，每24小時取樣，確定OD600，測定高活性堿性磷酸酶的表達活性，加入0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)進行進一步誘導(dǎo)。表達實驗進行96小時。
高活性堿性磷酸酶活性測定取出500μl表達混合物，確定OD600，將細胞離心。儲存上清，細胞沉淀重懸，以相應(yīng)于OD600的一定量Y-PERTM(50到300μl/Pierce)裂解，室溫振蕩1小時。隨后，裂解物離心除去細胞沉淀(15000×g/5分鐘)，上清轉(zhuǎn)移到新鮮反應(yīng)容器中。5μl裂解物用于活性檢測。
活性檢測如上所述進行。
實施例4
通過多重轉(zhuǎn)化增加表達量制備表達實驗的最佳克隆用于如上所述的外推法，并以1μg線性化pHAP10-3載體DNA再次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化混合物涂布于含有1000到2000μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS瓊脂平板(Invitrogen)上。結(jié)果，選擇壓力增加，使得只有基因組中整合了幾個拷貝的表達載體pHAP10-3因而也有幾個拷貝的相應(yīng)抗性基因(本例中為Zeocin)的克隆才能生長。Zeocin抗性蛋白是印度斯坦鏈異壁菌的博來霉素基因產(chǎn)物(Chalmels，T.et al.，Curr.Genet.20(1991)，309-314；Drocourt，D.et al.，Nucleic Acid Research 18(1990)，4009)，它以化學(xué)計量濃度比結(jié)合Zeocin，因此使細胞對Zeocin有抗性。YPDS瓊脂平板中Zeocin的濃度越高，為了定量結(jié)合Zeocin從而能夠生長，細胞需要產(chǎn)生更多的抗性蛋白。例如當(dāng)多個拷貝的抗性基因整合進基因組時，這就有可能。如上所述，光柵(raster)MD平板用克隆轉(zhuǎn)接，如上所述通過PCR分析再次檢查haAP表達盒是否正確整合。隨后，這些克隆如上所述測定haAP活性。
實施例5通過使用第二種選擇壓力增加表達量增加Zeocin濃度到高于2000μg/ml不會導(dǎo)致高活性進行磷酸酶的表達量增加。為了進一步增加表達克隆中SEQ ID NO5的基因的拷貝數(shù)，通過第二種選擇壓力(優(yōu)選為G418(Roche Diagnostics GmbH)由實施例3和4產(chǎn)生的克隆中選擇有其它表達載體整合進基因組、表達量最高的克隆，所述SEQ ID NO5的基因編碼高活性進行磷酸酶，為在酵母中表達已經(jīng)過密碼子優(yōu)化。為此，來自pHAP10-3的完整表達盒被克隆進載體pIC9K，通過G418(Roche Diagnostics GmbH)選擇該載體整合進基因組中的克隆，所述pHAP10-3表達盒包括AOX1啟動子、釀酒酵母α因子的信號肽、SEQ ID NO5的高活性堿性磷酸酶的密碼子優(yōu)化的基因、和如下所述使用合適的引物通過PCR分離的AOX1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。引物示于SEQ ID NO34和35。
PCR混合物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，分離具有預(yù)期大小的基因片段(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)，用SacI和NotI(RocheDiagnostics GmbH)再次切割，然后再從瓊脂糖凝膠中分離(QIAquick凝膠提取試劑盒/Qiagen)，連接至由pIC9K分離的、已經(jīng)用SacI/NotI(Roche Diagnostics GmbH)線性化的載體片段。這確保來自pHAP10-3的完整表達盒以pPIC9K的相同形式存在。通過限制性分析和旁側(cè)區(qū)測序檢查插入的片段。以此方式形成的表達載體被稱為pHAP10-3/9K(見圖3)。
如上所述制備來自pHAP10-3(Zeocin抗性)的多重轉(zhuǎn)化、具有最高haAP表達量的克隆用于電穿孔，如上所述用來自SacI(RocheDiagnostics GmbH)線性化處理的pHAP10-3/9K的載體片段1μg轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化混合物隨后在4℃下在1M山梨糖醇(ICN)中儲存1到3天(以形成G418抗性)，取100到200μl涂布于含有1、2和4mg/ml G418(Roche Diagnostics GmbH)的YPD平板(Invitrogen)上，30℃溫育3到5天。如上所述通過活性檢測再次檢查所得克隆的高活性真核堿性磷酸酶的表達增加。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>堿性磷酸酶在酵母中的表達<130>5387/00/<140><141><160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1476<212>DNA<213>牛<400>1gaattcctca tcccagctga ggaggaaaac cccgccttct ggaaccgcca ggcagcccag 60gcccttgatg tagccaagaa gttgcagccg atccagacag ctgccaagaa tgtcatcctc 120ttcttggggg atgggatggg ggtgcctacg gtgacagcca ctcggatcct aaaggggcag 180atgaatggca aactgggacc tgagacaccc ctggccatgg accagttccc atacgtggct 240ctgtccaaga catacaacgt ggacagacag gtgccagaca gcgcaggcac tgccactgcc 300tacctgtgtg gggtcaaggg caactacaga accatcggtg taagtgcagc cgcccgctac 360aatcagtgca acacgacacg tgggaatgag gtcacgtctg tgatcaaccg ggccaagaaa 420gcagggaagg ccgtgggagt ggtgaccacc accagggtgc agcatgcctc cccagccggg 480gcctacgcgc acacggtgaa ccgaaactgg tactcagacg ccgacctgcc tgctgatgca 540cagaagaatg gctgccagga catcgccgca cagctggtct acaacatgga tattgacgtg 600atcctgggtg gaggccgaat gtacatgttt cctgagggga ccccagaccc tgaataccca 660gatgatgcca gtgtgaatgg agtccggaag gacaagcaga acctggtgca ggaatggcag 720gccaagcacc agggagccca gtatgtgtgg aaccgcactg cgctccttca ggcggccgat 780gactccagtg taacacacct catgggcctc tttgagccgg cagacatgaa gtataatgtt 840cagcaagacc acaccaagga cccgaccctg gcggagatga cggaggcggc cctgcaagtg 900ctgagcagga acccccgggg cttctacctc ttcgtggagg gaggccgcat tgaccacggt 960caccatgacg gcaaagctta tatggcactg actgaggcga tcatgtttga caatgccatc 1020gccaaggcta acgagctcac tagcgaactg gacacgctga tccttgtcac tgcagaccac 1080tcccatgtct tctcttttgg tggctacaca ctgcgtggga cctccatttt cggtctggcc 1140cccggcaagg ccttagacag caagtcctac acctccatcc tctatggcaa tggcccaggc 1200tatgcgcttg gcgggggctc gaggcccgat gttaatggca gcacaagcga ggaaccctca 1260taccggcagc aggcggccgt gcccctggct agcgagaccc acgggggcga agacgtggcg 1320gtgttcgcgc gaggcccgca ggcgcacctg gtgcacggcg tgcaggagga gaccttcgtg 1380gcgcacatca tggcctttgc gggctgcgtg gagccctaca ccgactgcaa tctgccagcc 1440cccgccaccg ccaccagcat ccccgactag ggtacc 1476<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>2gcgcgaattc ctcatcccag ctgaggagga aaaccccgcc 40<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>3cgcgggtacc ctagtcgggg atgctggtgg cggtgg 36<210>4<211>487<212>PRT<213>牛<400>4Leu Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn Arg Gln Ala1 5 10 15Ala Gln Ala Leu Asp Val Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile Gln Thr Ala20 25 30Ala Lys Asn Val Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Pro Thr35 40 45Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Met Asn Gly Lys Leu Gly50 55 60Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Gln Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser65 70 75 80Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala85 90 95Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Tyr Arg Thr Ile Gly Val100 105 110Ser Ala Ala Ala Arg Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125Val Thr Ser Val Ile Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ala Val Gly130 135 140Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Ala Tyr145 150 155 160Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Leu Pro Ala165 170 175Asp Ala Gln Lys Asn Gly Cys Gln Asp Ile Ala Ala Gln Leu Val Tyr180 185 190Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Met Tyr Met Phe195 200 205Pro Glu Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Ala Ser Val Asn210 215 220Gly Val Arg Lys Asp Lys Gln Asn Leu Val Gln Glu Trp Gln Ala Lys225 230 235 240His Gln Gly Ala Gln Tyr Val Trp Asn Arg Thr Ala Leu Leu Gln Ala245 250 255Ala Asp Asp Ser Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Ala260 265 270Asp Met Lys Tyr Asn Val Gln Gln Asp His Thr Lys Asp Pro Thr Leu275 280 285Ala Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Pro Arg290 295 300Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His305 310 315 320Asp Gly Lys Ala Tyr Met Ala Leu Thr Glu Ala Ile Met Phe Asp Asn325 330 335Ala Ile Ala Lys Ala Asn Glu Leu Thr Ser Glu Leu Asp Thr Leu Ile340 345 350Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Thr355 360 365Leu Arg Gly Thr Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Leu Asp370 375 380Ser Lys Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Ala385 390 395 400Leu Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Val Asn Gly Ser Thr Ser Glu Glu405 410 415Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ala Ser Glu Thr His420 425 430Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu435 440 445Val His Gly Val Gln Glu Glu Thr Phe Val Ala His Ile Met Ala Phe450 455 460Ala Gly Cys Val Glu Pro Tyr Thr Asp Cys Asn Leu Pro Ala Pro Ala465 470 475 480Thr Ala Thr Ser Ile Pro Asp485<210>5<211>1476<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>5gaattcttga ttccagctga agaagaaaat ccagcttttt ggaatagaca agctgctcaa 60gctttggatg ttgctaagaa gttgcaacca attcaaactg ctgctaagaa tgttattttg 120tttttgggtg atggtatggg tgttccaact gttactgcta ctagaatttt gaagggtcaa 180atgaatggta agttgggtcc agaaactcca ttggctatgg atcaatttcc atacgttgct 240ttgtctaaga cttacaatgt tgatagacaa gttccagatt ctgctggtac tgctactgct 300tacttgtgtg gtgttaaggg taattacaga actattggtg tttctgctgc tgctagatac 360aatcaatgta atactactag aggtaatgaa gttacttctg ttattaatag agctaagaag 420gctggtaagg ctgttggtgt tgttactact actagagttc aacatgcttc tccagctggt 480gcttacgctc atactgttaa tagaaattgg tactctgatg ctgatttgcc agctgatgct 540caaaagaatg gttgtcaaga tattgctgct caattggttt acaatatgga tattgatgtt 600attttgggtg gtggtagaat gtacatgttt ccagaaggta ctccagatcc agaataccca 660gatgatgctt ctgttaatgg tgttagaaag gataagcaaa atttggttca agaatggcaa 720gctaagcatc aaggtgctca atatgtttgg aatagaactg ctttgttgca agctgctgat 780gattctagtg ttactcattt gatgggtttg tttgaaccag ctgatatgaa gtataatgtt 840caacaagatc atactaagga tccaactttg gctgaaatga ctgaagctgc tttgcaagtt 900ttgtctagaa atccaagagg tttttacttg tttgttgaag gtggtagaat tgatcatggt 960catcatgatg gtaaggctta tatggctttg actgaagcta ttatgtttga taatgctatt 1020gctaaggcta atgaattgac ttctgaattg gatactttga ttttggttac tgctgatcat 1080agtcatgttt tttcttttgg tggttacact ttgagaggta cttctatttt tggtttggct 1140ccaggtaagg ctttggatag taagtcttac acttctattt tgtatggtaa tggtccaggt 1200tatgctttgg gtggtggttc tagaccagat gttaatggta gtactagtga agaaccatct 1260tacagacaac aagctgctgt tccattggct agtgaaactc atggtggtga agatgttgct 1320gtttttgcta gaggtccaca agctcatttg gttcatggtg ttcaagaaga aacttttgtt 1380gctcatatta tggcttttgc tggttgtgtt gaaccataca ctgattgtaa tttgccagct 1440ccagctactg ctactagtat tccagattaa ggtacc 1476<210>6<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>6gcgcgaattc ttgattccag ctgaagaaga aaatccagct ttttggaata gacaagctgc 60tcaagctttg gatgttgc78<210>7<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>7ccaaaaacaa aataacattc ttagcagcag tttgaattgg ttgcaacttc ttagcaacat 60ccaaagcttg 70<210>8<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>8gaatgttatt ttgtttttgg gtgatggtat gggtgttcca actgttactg ctactagaat 60tttgaaggg 69<210>9<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>9ggaaattgat ccatagccaa tggagtttct ggacccaact taccattcat ttgacccttc 60aaaattctag70<210>10<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>10gctatggatc aatttccata cgttgctttg tctaagactt acaatgttga tagacaagtt 60ccagattctg c 71<210>11<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>11ccaatagttc tgtaattacc cttaacacca cacaagtaag cagtagcagt accagcagaa 60tctggaactt g 71<210>12<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>12gtaattacag aactattggt gtttctgctg ctgctagata caatcaatgt aatactacta 60gaggtaatga ag 72<210>13<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>13agtaacaaca ccaacagcct taccagcctt cttagctcta ttaataacag aagtaacttc 60attacctcta gtag 74<210>14<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>14gctgttggtg ttgttactac tactagagtt caacatgctt ctccagctgg tgcttacgct 60catactgtta atag 74<210>15<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>15caaccattct tttgagcatc agctggcaaa tcagcatcag agtaccaatt tctattaaca 60gtatgagc 68<210>16<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>16gatgctcaaa agaatggttg tcaagatatt gctgctcaat tggtttacaa tatgg 55<210>17<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>17ccttctggaa acatgtacat tctaccacca cccaaaataa catcaatatc catattgtaa 60accaattgag ca 72<210>18<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>18gtacatgttt ccagaaggta ctccagatcc agaataccca gatgatgctt ctgttaatgg 60tgttagaaag g 71<210>19<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>19catattgagc accttgatgc ttagcttgcc attcttgaac caaattttgc ttatcctttc 60taacaccatt aac73<210>20<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>20gcatcaaggt gctcaatatg tttggaatag aactgctttg ttgcaagctg ctgatgattc 60tagtgttact c 71<210>21<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>21cttcatatca gctggttcaa acaaacccat caaatgagta acactagaat catc 54<210>22<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>22gaaccagctg atatgaagta taatgttcaa caagatcata ctaaggatcc aactttggc 59<210>23<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>23cctcttggat ttctagacaa aacttgcaaa gcagcttcag tcatttcagc caaagttgga 60tccttag 67<210>24<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>24gtctagaaat ccaagaggtt tttacttgtt tgttgaaggt ggtagaattg atcatggtca 60tcatgatgg 69<210>25<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>25ccttagcaat agcattatca aacataatag cttcagtcaa agccatataa gccttaccat 60catgatgacc atg73<210>26<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>26gataatgcta ttgctaaggc taatgaattg acttctgaat tggatacttt gattttggtt 60actgctgatc atag 74<210>27<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>27ccaaaccaaa aatagaagta cctctcaaag tgtaaccacc aaaagaaaaa acatgactat 60gatcagcagt aac73<210>28<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>28cttctatttt tggtttggct ccaggtaagg ctttggatag taagtcttac acttctattt 60tgtatggtaa tgg73<210>29<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>29ctagtactac cattaacatc tggtctagaa ccaccaccca aagcataacc tggaccatta 60ccatacaaaa tagaag 76<210>30<211>77<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>30gatgttaatg gtagtactag tgaagaacca tcttacagac aacaagctgc tgttccattg 60gctagtgaaa ctcatgg77<210>31<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>31caccatgaac caaatgagct tgtggacctc tagcaaaaac agcaacatct tcaccaccat 60gagtttcact agc73<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>32gctcatttgg ttcatggtgt tcaagaagaa acttttgttg ctcatattat ggcttttgct 60ggttgtgttg aacc 74<210>33<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>33gcgcggtacc ttaatctgga atactagtag cagtagctgg agctggcaaa ttacaatcag 60tgtatggttc aacacaacca gc 82<210>34<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>34gcgcgcctag gagatctaac atccaaagac g31<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明人工的<400>35cgcgcgctag cggatccgca caaacgaag 29<210>36<211>10<212>PRT<213>釀酒酵母<400>36Glu Ala Glu Ala Glu Phe Leu Ile Pro Ala1 5 10<210>37<211>4<212>PRT<213>釀酒酵母<400>37Leu Ile Pro Ala1<210>38<211>6<212>PRT<213>釀酒酵母<400>38Glu Ala Glu Ala Glu Phe1 權(quán)利要求
1.在酵母細胞中生產(chǎn)真核堿性磷酸酶的方法，包括以下步驟a)克隆一種基因序列進入不同的載體，b)轉(zhuǎn)化酵母，c)表達，以及d)純化堿性磷酸酶，其中-第一載體具有針對第一選擇標記的抗性基因，-抗性基因和基因序列已經(jīng)整合到基因組的轉(zhuǎn)化子通過在含有低濃度第一選擇標記的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，-基因拷貝數(shù)通過多重轉(zhuǎn)化增加，其中多重轉(zhuǎn)化子通過在選擇壓力增加的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，-加入具有針對第二選擇標記的抗性基因的第二載體，-基因拷貝數(shù)通過第二載體的多重轉(zhuǎn)化增加，其中多重轉(zhuǎn)化子通過在選擇壓力增加的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長來選擇，-選擇幾個拷貝的基因序列和選擇標記抗性基因已經(jīng)以穩(wěn)定方式整合進基因組的克隆。
2.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中基因序列相應(yīng)于SEQ ID NO1。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中基因序列相應(yīng)于SEQ ID NO5。
4.權(quán)利要求1到3任一項的方法，其中使用甲基營養(yǎng)型酵母細胞。
5.權(quán)利要求1到4任一項的方法，其中使用巴斯德畢赤酵母或多形漢遜酵母作為酵母菌株。
6.SEQ ID NO5的DNA。
7.含有SEQ ID NO5的載體。
8.權(quán)利要求7的載體，其基本上相應(yīng)于pHAP10-3。
9.含有來自pHAP10-3的完整表達盒的載體。
10.權(quán)利要求9的載體，其基本上相應(yīng)于pHAP10-3/9K。
11.用權(quán)利要求9或10的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株。
12.用載體pHAP10-3/9K和/或權(quán)利要求7或8的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株。
13.權(quán)利要求12的宿主菌株，其中巴斯德畢赤酵母或多形漢遜酵母被用作宿主菌株。
14.用權(quán)利要求8到10的載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母X-33菌株。
15.生產(chǎn)高活性真核堿性磷酸酶的方法，其中所述酶在 11到14任一項的宿主菌株中表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及在酵母細胞中重組生產(chǎn)和表達真核堿性磷酸酶的方法,其中使用編碼比活性高于3000U/mg的高活性真核堿性磷酸酶的DNA。本發(fā)明還涉及將相應(yīng)核酸序列插入在甲基營養(yǎng)型酵母菌株中表達的載體中的方法,以及合適的載體和宿主菌株。
文檔編號C12N15/53GK1334341SQ0112324
公開日2002年2月6日 申請日期2001年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月25日
發(fā)明者R·米勒, J·-P·塔爾霍菲, F·蓋佩, W·赫爾克, S·格拉澤, H·?？怂固? T·基爾施鮑姆, B·波馬里烏斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司