本發(fā)明涉及納米醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種近紅外納米熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

量子點(diǎn)作為一種新型的納米熒光探針，以其不同于宏觀材料的獨(dú)特物理化學(xué)性能，引起了國內(nèi)外研究者廣泛的興趣。相比于可見光量子點(diǎn)，新型納米熒光探針在近紅外區(qū)發(fā)光，因其在組織中存在“生物近紅外透明窗口”，近紅外量子點(diǎn)更適用于生物成像、對活體細(xì)胞或組織內(nèi)的成分進(jìn)行實(shí)時檢測、疾病診斷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前，近紅外硫族熒光納米粒子的研究處于飛速發(fā)展階段，Ⅱ~Ⅵ族元素（CdSe、CdTe、HgS QDs等）、Ⅳ~Ⅵ族元素（如PbS QDs）等組成的半導(dǎo)體納米晶體由于富含Hg²⁺、Cd²⁺、Pd²⁺，在如何通過包裹或其它方法來降低或消除其毒性上還需要進(jìn)一步探索。而Ⅰ~Ⅵ族量子點(diǎn)（即Ag系硫族量子點(diǎn)）富含的Ag⁺、Cu²⁺所含的毒性很少或幾乎沒有，有利于Ⅰ~Ⅵ族近紅外量子點(diǎn)用于化學(xué)分析及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用；Ⅰ~Ⅵ族量子點(diǎn)是一類窄帶寬的半導(dǎo)體材料，在近紅外區(qū)發(fā)光，這使其在生物分析檢測和熒光成像探針的有著優(yōu)越的條件；Ⅰ~Ⅵ族近紅外發(fā)光量子點(diǎn)由于自身具有的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，且制備方法簡單，易于進(jìn)行表面功能化，因而在生物分析檢測、細(xì)胞成像、腫瘤診斷等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。

因此，利用量子點(diǎn)設(shè)計簡單方便、便于對待檢測物進(jìn)行快速分析且成本低廉、操作簡單的光學(xué)探針具有十分顯著的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。相較于傳統(tǒng)熒光染料，如異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、羅丹明（Rhodamine）等，近紅外量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)，光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解，熒光強(qiáng)度高而穩(wěn)定，生物相容性好，毒性低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、腫瘤診斷等方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種近紅外納米熒光探針，該熒光探針具有長波長（近紅外區(qū)）、光化學(xué)穩(wěn)定高、綠色無毒，并能夠應(yīng)用于細(xì)胞成像和腫瘤診斷。

近紅外量子點(diǎn)為Ag系硫族量子點(diǎn)，包括Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te。

近紅外納米熒光探針中近紅外量子點(diǎn)與特異性分子氨基結(jié)合的制備方法：

(1)含羧基的近紅外量子點(diǎn)的活化

取2 mM Ag系硫族量子點(diǎn)，用合適緩沖液（其中緩沖液可以是PBS7.4、MES緩沖溶液）稀釋后，按照一定比例依次加入0.2 M的EDAC和0.2M的NHS或sulfo-NHS（QDs: EDC的摩爾比為1:50～1:200；EDC: sulfo-NHS的摩爾比為1:2.5～5:1），渦旋振蕩器震蕩均勻后常溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15~60 min；

(2)特異性分子標(biāo)記

將步驟（1）活化的近紅外量子點(diǎn)用30 KD超濾管在4℃條件下以8000 r/min速度離心10 min，超濾純化后，加入PBS稀釋，加入相對應(yīng)單克隆抗體溶液（如Anti-alpha-SMA、Anti-CEA等，QDs和抗體的摩爾比為1:4～1:10），4℃反應(yīng)過夜。溶液體系pH值優(yōu)選為7~9；

(3)標(biāo)記復(fù)合物純化

將反應(yīng)液離心后，近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記的復(fù)合物用葡聚糖凝膠柱層析分離，收集有熒光的部分，即為近紅外納米熒光探針純品。

本發(fā)明的系列近紅外熒光探針都具有極好的生物相容性，體內(nèi)毒性低，熒光信號強(qiáng)且穩(wěn)定，與特異性受體的親和性高，是細(xì)胞成像和腫瘤早期診斷的優(yōu)選試劑。

下面是部分本發(fā)明系列近紅外熒光探針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中NIR-Ag₂S-alpha-SMA表示Ag₂S量子點(diǎn)與alpha-SMA抗體偶聯(lián)的近紅外納米熒光探針，其他表示方法類似。

一、近紅外納米熒光探針對細(xì)胞成像

近紅外納米熒光探針對細(xì)胞標(biāo)記成像，操作步驟如下：

1）在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞（FB）、人卵巢癌細(xì)胞（A2780）、人肺癌細(xì)胞（A549）的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3 min；

2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

3）將細(xì)胞爬片用PBS7.4洗3×5 min后，用0.5%~1%的Trition-100在37℃條件下淹沒20 min；

4）用PBS7.4洗3×5 min，加入山羊血清，37℃封閉1 h后；

5）加入對應(yīng)的近紅外納米熒光探針（如NIR-Ag₂S-alpha-SMA用于成纖維細(xì)胞（FB）成像、NIR-Ag₂S--Ki67對人卵巢癌細(xì)胞（A2780）標(biāo)記成像、NIR-Ag₂Se-GAPDH用于人肺癌細(xì)胞（A549）成像），室溫孵育2~3 h；

6）PBST洗3×5 min后，室溫下DAPI染核，20 min；

7）PBST洗3×10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液，封片；

8）在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

其中PBST：PBS7.4磷酸緩沖溶液中加入0.02%-0.05%Tween-20。

二、腫瘤標(biāo)記物蛋白芯片

蛋白質(zhì)芯片制備方法：

1）用不銹無菌裁紙刀裁取所需大小及所需孔徑的多孔纖維素膜，如2平方厘米的0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜（NC膜）；

2）用微量噴印設(shè)備將捕獲抗體（如Anti-CEA、Anti-AFP、Anti-CA199）以微陣列形式噴印到NC膜上，每孔0.5 μL；

3）用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS緩沖液，封閉40~60 min；

4）37℃干燥2 h后即得蛋白質(zhì)芯片。

腫瘤標(biāo)記物檢測：

取樣本孵育，PBS洗滌后，加對應(yīng)近紅外納米熒光探針（CEA對應(yīng)NIR-Ag₂S-CEA熒光探針、AFP對應(yīng)NIR-Ag₂Se-AFP熒光探針、CA199對應(yīng)NIR-Ag₂S-CA199熒光探針等），檢測出現(xiàn)紅色或橙紅色熒光斑點(diǎn)為含有相應(yīng)的抗原。

本發(fā)明制備的近紅外納米熒光探針直接標(biāo)記一抗，相對于一般免疫熒光實(shí)驗(yàn)來說，實(shí)驗(yàn)過程中無需避光、操作簡單，替代了一抗與二抗的繁瑣操作，近紅外納米熒光探針具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)，光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解，熒光強(qiáng)度高而穩(wěn)定，生物相容性好，毒性低，且其熒光在近紅外區(qū)，熒光背景更少等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明制備的近紅外納米熒光探針在細(xì)胞成像、腫瘤診斷上有著廣泛的應(yīng)用。

附圖說明

圖1成纖維細(xì)胞（FB）成像：DAPI（左）、NIR-Ag₂S-alpha-SMA探針標(biāo)記（中）、影像重疊（右）；

圖2 人卵巢癌細(xì)胞（A2780）成像：DAPI（左）、NIR-Ag₂S--Ki67探針標(biāo)記（中）、影像重疊（右）；

圖3 人肺癌細(xì)胞（A549）成像：DAPI（左）、NIR-Ag₂Se-GAPDH探針標(biāo)記（中）、影像重疊（右）；

圖4 癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）蛋白檢測芯片。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

本發(fā)明所述量子點(diǎn)可為Ag系硫族近紅外量子點(diǎn)，如Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te。本發(fā)明所述的量子點(diǎn)可以采用任何方法制備，也可以采用如下方法制備：

本發(fā)明所述的Ag系硫族近紅外量子點(diǎn)按照覃愛苗等提供的方法（申請（專利）號：201410237382.X）進(jìn)行：

1）在合成過程保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)的體系中，將0.1mol/L的AgNO₃溶液2~8 mL注入到100 mL去離子水中，加入0.2~2.0 mmol白色固體的L-半胱氨酸作為修飾劑，待溶解后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH值至11，溶液體系呈無色透明，隨后加入0.5~4 mL濃度為0.1 mol/L的S源溶液、10~30 mL濃度為5.0×10^-3 mol/L的Se源或10~30 mL濃度為5.0×10^-3 mol/L的Te源溶液，即得到近紅外發(fā)光的Ag₂S、Ag₂Se或Ag₂Te量子點(diǎn)；

2）所述S源為Na₂S·9H₂O；所述Se源為Na₂SeO₃在NaBH₄的還原下制備的NaHSe；所述Te源為Na₂TeO₃在NaBH₄的還原下制備的NaHTe；

3）Se源制備過程為量取100 mL去離子水，加入0 .0866 g ( 0.5mmol ) Na₂SeO₃，待溶解后加入0.2598 g NaBH₄，密封系統(tǒng)且溫度為90℃下反應(yīng)而得到的濃度為5.0×10^-3mol/L的Se源；Te源制備過程為量取100 mL去離子水，加入0.1108 g ( 0.5 mmol ) Na₂TeO₃，待溶解后加入0.3324 g NaBH₄，密封系統(tǒng)且溫度為90℃下反應(yīng)而得到的濃度為5 .0×10^{- 3}mol/L的Te源。

實(shí)施例1 近紅外納米熒光探針NIR-Ag₂S-alpha-SMA的制備

近紅外納米熒光探針中近紅外量子點(diǎn)與特異性分子氨基結(jié)合的制備方法：

（1）含羧基的近紅外Ag₂S量子點(diǎn)的活化；

取2mM Ag₂S量子點(diǎn)用合適緩沖液（其中緩沖液是0.05M的MES緩沖溶液）稀釋后，按照一定比例依次加入0.2 M的EDAC和0.2 M的NHS（QDs: EDC的摩爾比為1:50；EDC: NHS的摩爾比為1:2.5），渦旋振蕩器震蕩均勻后常溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15~60 min；

（2）特異性分子標(biāo)記

將步驟（1）活化的近紅外量子點(diǎn)用30 KD超濾管在4℃條件下以8000 r/min的速度，離心10 min，超濾純化后，加入PBS稀釋，加入相對應(yīng)單克隆alpha-SMA抗體溶液（QDs和抗體的摩爾比為1:4～1:10），4℃反應(yīng)過夜。溶液體系pH值優(yōu)選為7~9；

（3）標(biāo)記復(fù)合物純化

將反應(yīng)液離心后，近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記的復(fù)合物用葡聚糖凝膠柱層析分離，收集有熒光的部分，即得近紅外納米熒光探針NIR-Ag₂S-alpha-SMA。

其他近紅外納米熒光探針制備方法類似。

實(shí)施例2 NIR-Ag₂S-alpha-SMA對成纖維細(xì)胞（FB）成像標(biāo)記成像

NIR-Ag₂S-alpha-SMA用于成纖維細(xì)胞（FB）成像，操作步驟如下：

1）在培養(yǎng)板中將已爬好成纖維細(xì)胞（FB）的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3 min；

2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

3）成纖維細(xì)胞（FB）爬片用PBS7.4洗3×5 min后，用0.5%~1%的Trition-100在37℃條件下淹沒20 min；

4）用PBS7.4洗3×5 min，加入山羊血清，37℃封閉1 h后；

5）加入NIR-Ag₂S-alpha-SMA近紅外納米熒光探針，室溫孵育2~3 h；

6）PBST洗3×5 min后，室溫下DAPI染核，20 min；

7）PBST洗3×10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液，封片；

8）在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像（圖1）。

其中PBST：PBS7.4磷酸緩沖溶液中加入0.02%~0.05% Tween-20。

實(shí)施例3 NIR-Ag₂S--Ki67對人卵巢癌細(xì)胞（A2780）標(biāo)記成像

NIR-Ag₂S--Ki67用于人卵巢癌細(xì)胞（A2780）成像，操作步驟如下：

1）在培養(yǎng)板中將已爬好人卵巢癌細(xì)胞（A2780）的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3 min；

2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

3）人卵巢癌細(xì)胞（A2780）爬片用PBS7.4洗3×5 min后，用0.5%~1%的Trition-100在37℃條件下淹沒40 min；

4）用PBS7.4洗3×5min，加入山羊血清，37℃封閉1h；

5）加入NIR-Ag₂S--Ki67近紅外納米熒光探針，室溫孵育2~3 h；

6）PBST洗3×5 min后，DAPI染核，室溫20 min；

7）PBST洗3×10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液，封片；

8）在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像（圖2）。

其中PBST：PBS7.4磷酸緩沖溶液中加入0.02%~0.05%Tween-20。

實(shí)施例4 NIR-Ag₂Se-GAPDH對人肺癌細(xì)胞（A549）標(biāo)記成像

NIR-Ag₂Se-GAPDH用于人肺癌細(xì)胞（A549）成像，操作步驟如下：

1）在培養(yǎng)板中將已爬好人肺癌細(xì)胞（A549）的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3 min；

2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

3）人肺癌細(xì)胞（A549）爬片用PBS7.4洗3×5 min后，用0.5%~1%的Trition-100在37℃條件下淹沒20 min；

4）用PBS7.4洗3×5 min，加入山羊血清，37℃封閉1h后；

5）加入NIR-Ag₂Se-GAPDH近紅外納米熒光探針，室溫孵育2~3 h；

6）PBST洗3×5 min后，DAPI染核，室溫20 min；

7）PBST洗3×10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液，封片；

8）在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像（圖3）。

其中PBST：PBS7.4磷酸緩沖溶液中加入0.02%~0.05%Tween-20。

實(shí)施例5 癌胚抗原（CEA）蛋白芯片

蛋白質(zhì)芯片制備方法：

1）用不銹無菌裁紙刀裁取所需大小及所需孔徑的多孔纖維素膜，如2平方厘米的0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜；

2）用微量噴印設(shè)備將捕獲CEA抗體以微陣列形式噴印到NC膜上，每孔0.5 μL；

3）用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS緩沖液，封閉40~60 min；

4）37℃干燥2 h后即為制備好的蛋白質(zhì)芯片。

腫瘤標(biāo)記物檢測：

取樣本孵育，PBS洗滌后，加NIR-Ag₂S-CEA近紅外納米熒光探針，檢測出現(xiàn)橙紅色熒光斑點(diǎn)為含有相應(yīng)的CEA抗原（圖4）。

實(shí)施例6 甲胎蛋白（AFP）蛋白芯片

蛋白質(zhì)芯片制備方法：

1）用不銹無菌裁紙刀裁取所需大小及所需孔徑的多孔纖維素膜，如2平方厘米的0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜；

2）用微量噴印設(shè)備將捕獲AFP抗體以微陣列形式噴印到NC膜上，每孔0.5 μL；

3）用含有1%的牛血清白蛋白的0.01M PBS緩沖液，封閉40~60 min；

4）37℃干燥2h后即為制備好的蛋白質(zhì)芯片。

腫瘤標(biāo)記物檢測：

取樣本孵育，PBS洗滌后，加NIR-Ag₂Se-AFP近紅外納米熒光探針，檢測出現(xiàn)紅色熒光斑點(diǎn)為含有相應(yīng)的AFP抗原（圖4）。