本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一類可修飾的近紅外二區(qū)熒光探針及其制備方法和在生物醫(yī)學(xué)熒光成像領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥(又稱惡性腫瘤)嚴(yán)重威脅著人類健康。由于醫(yī)療技術(shù)水平的限制，目前缺乏對晚期癌癥的有效治療手段，所以癌癥的早期診斷對患者來說尤為重要，若能盡早發(fā)現(xiàn)并及時采取治療，可以顯著提高癌癥患者的存活率。非侵入式的活體動物熒光成像技術(shù)等分子影像技術(shù)的出現(xiàn)為癌癥的早期診斷開拓了新的發(fā)展道路。

另外，最初的腫瘤轉(zhuǎn)移一般發(fā)生在前哨淋巴結(jié)。前哨淋巴結(jié)是直接接受來自腫瘤的原發(fā)病灶淋巴流的淋巴結(jié)。在早期腫瘤切除手術(shù)中，前哨淋巴結(jié)導(dǎo)航手術(shù)正被廣泛采用，所謂前哨淋巴結(jié)導(dǎo)航手術(shù)是使用熒光成像探針鑒定前哨淋巴結(jié)，隨后通過手術(shù)切除，并通過體外輔助檢查確定癌癥是否轉(zhuǎn)移。使用該方法，能夠及時阻斷癌癥轉(zhuǎn)移或者通過切除的淋巴結(jié)精確診斷癌癥是否轉(zhuǎn)移，進(jìn)而確定是否需要進(jìn)行手術(shù)后抗腫瘤放化療，盡最大可能減少患者的負(fù)擔(dān)。

生物組織在<700nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的自身熒光且有嚴(yán)重的光吸收，會嚴(yán)重干擾熒光成像效果。在近紅外區(qū)(700～1600nm)生物組織光吸收或自身熒光強(qiáng)度都很小，近紅外熒光成像技術(shù)受到越來越多的關(guān)注。近紅外熒光分為近紅外一區(qū)(700～1000nm)和近紅外二區(qū)(1000～1600nm)。由于近紅外二區(qū)(1000～1600nm)熒光對生物組織穿透能力比近紅外一區(qū)更強(qiáng)，且成像信噪比和分辨率都更高(pnas,2011,108,8943-8948)，近紅外二區(qū)熒光成像更有希望在未來的活體成像、腫瘤早期診斷和手術(shù)導(dǎo)航等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用。

迄今為止，近紅外二區(qū)熒光成像材料主要為生物相容性差，毒性大或生物體難以吸收、代謝、排泄的成像試劑，主要包括單層碳納米管(nat.photonics.,2014,8,723-730；angew.chem.int.ed.,2015,54,14758-14762)、高分子聚合物(nat.commun.,2014,5,4206)、量子點(diǎn)(acs.nano.,2012,6,3695-3702；angew.chem.int.ed.,2012,51,9818-9821；biomaterials.,2015,53,265-273)、稀土納米微粒(nat.commun.,2013,4,2199；j.mater.chem.b.,2016,4,87-95)等。目前只有少數(shù)可被生物體通過腎臟排泄的小分子近紅外二區(qū)熒光成像試劑(nat.mater.,2016,15,235-242；chem.sci.,2016,7,6203-6207)被報道。

為了獲得具有優(yōu)異成藥性的近紅外二區(qū)熒光成像探針，非常需要發(fā)展具有高靈敏度、高生物相容性、高發(fā)光亮度、光穩(wěn)定性好、無毒且更易于排泄的小分子近紅外二區(qū)熒光成像試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一類可修飾的、光穩(wěn)定性高的、生物相容性好的近紅外二區(qū)熒光有機(jī)小分子探針。具體來講，本發(fā)明涉及一類可以用于癌癥診斷、體內(nèi)血管和淋巴結(jié)成像的探針材料，并成功地將材料應(yīng)用于導(dǎo)航外科手術(shù)及術(shù)后評價。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一類可修飾的近紅外二區(qū)熒光化合物，含有苯并噻二唑和芴環(huán)，具有通式(1)所述的結(jié)構(gòu)：

其中：

r為：或h，n＝0～18，m＝0～20，m,n為整數(shù)；

r1，r2獨(dú)立地為：nh2，no2，oh，或h，但r1、r2不同時為h，n＝0～18，n為整數(shù)；

r3、r4、r5、r6獨(dú)立地為：或n＝0～18，m＝1～200，m、n為整數(shù)；x＝f、cl、br、i或n3。

所述的具有通式(1)所示的結(jié)構(gòu)的熒光化合物，其熒光發(fā)射波長為900～1600nm。

一種制備通式(1)所述的熒光探針的方法，反應(yīng)路線如下：

反應(yīng)條件為：

(1)取化合物2、化合物3和碳酸鉀加入反應(yīng)容器中，在氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下加入四氫呋喃-水，其中，四氫呋喃和水的體積比為8～2:1，向反應(yīng)液中通入氬氣或氮?dú)馀懦w系內(nèi)氧氣，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物，氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下在70℃～80℃回流反應(yīng)10～20小時，反應(yīng)結(jié)束后純化得中間體4。

(2)取化合物4、化合物5和碳酸鉀加入反應(yīng)容器中，在氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下加入四氫呋喃-水，其中，四氫呋喃和水的體積比為8～2:1，向反應(yīng)液中通入氬氣或氮?dú)馀懦w系內(nèi)氧氣，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物，氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下在70℃～80℃回流反應(yīng)10～20小時，反應(yīng)結(jié)束后純化得中間體6。

(3)取化合物6、鋅粉和氯化銨加入反應(yīng)容器中，在氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下加入二氯甲烷-甲醇-水混合溶劑，甲醇的含水量為80～95wt％，二氯甲烷和甲醇-水的體積比為0.5～2:1，反應(yīng)液在5℃～35℃反應(yīng)3～6小時。反應(yīng)結(jié)束后過濾、干燥、除去溶劑得中間體。在氮?dú)饣驓鍤獗Ｗo(hù)下將中間體加入無水吡啶中，加入n-亞磺酰苯胺和三甲基氯硅烷，反應(yīng)混合液在70℃～90℃加熱反應(yīng)15～24小時，反應(yīng)結(jié)束后提純得化合物1。

步驟(1)和步驟(2)所述的化合物2、化合物3、[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物和碳酸鉀的摩爾比為1:1:0.05～0.1:1～2.5，以及化合物4、化合物5、[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物和碳酸鉀的摩爾比為1:1:0.05～0.1:1～2.5。

步驟(3)所述的化合物6、鋅粉和氯化銨的摩爾比為1:30～120:10～36，所述的中間體6、n-亞磺酰苯胺和三甲基氯硅烷的摩爾比為1:4～36:4～70。

本發(fā)明式(1)化合物可以用作生物體內(nèi)成像的近紅外二區(qū)熒光成像探針，特別是應(yīng)用于癌癥診斷中，還可使用在通式(1)所示的化合物可修飾位點(diǎn)修飾上聚乙二醇、多肽、蛋白、核酸適配體、葉酸等的衍生物。此處，癌癥主要指腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、胃癌、食道癌、宮頸癌和卵巢癌。

本發(fā)明式(1)化合物或式(1)所示的化合物可修飾位點(diǎn)修飾上聚乙二醇、多肽、蛋白、核酸適配體、葉酸等的衍生物可以用于制作全身血管成像和前哨淋巴結(jié)手術(shù)導(dǎo)航切除術(shù)中的納米粒。將聚乙二醇修飾磷脂溶于水中，在超聲下形成空腔球形粒子，滴加式(1)化合物或前述式(1)化合物衍生物的四氫呋喃溶液，超聲下使之進(jìn)入空腔中，氮吹除去四氫呋喃形成穩(wěn)定的納米粒。優(yōu)選納米粒的粒徑為30～300nm，較優(yōu)選為50～150nm。

本發(fā)明所得的如通式(1)所述的化合物或其衍生物為具有可修飾基團(tuán)的全新化合物，其熒光發(fā)射波長位于近紅外二區(qū)，無毒，生物相容性好，易被生物體吸收和代謝。經(jīng)不同后修飾或包載后，可用于腫瘤等不同疾病的檢測以及血管和淋巴結(jié)成像。

本發(fā)明的近紅外二區(qū)熒光成像探針，由市售的化合物2、3和5經(jīng)兩步偶聯(lián)反應(yīng)生成主體分子結(jié)構(gòu)，在鋅粉和氯化銨作用下還原硝基成氨基，隨后在n-亞磺酰苯胺和三甲基氯硅烷共同作用下關(guān)環(huán)生成第二個苯并噻二唑環(huán)得終產(chǎn)物。從實(shí)施例中可知該方案合成路線簡單，反應(yīng)效率高，收率高，具有較高的工業(yè)應(yīng)用前景。

本發(fā)明的創(chuàng)造性在于在苯并噻二唑母核上引入了芴環(huán)，可增加熒光材料的量子產(chǎn)率。芴環(huán)上引入可修飾基團(tuán)，增加的可修飾位點(diǎn)可用于連接不同的生物活性官能團(tuán)，進(jìn)而增加熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域以及改善其水溶性和生物相容性。在生物醫(yī)學(xué)成像實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該熒光探針成像效果非常好，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為近紅外二區(qū)熒光成像探針1a的合成路線。

圖2為近紅外二區(qū)熒光成像探針1a吸收和熒光發(fā)射光譜圖。

圖3為化合物1a-peg1000修飾物的合成方案。

圖4為尾靜脈注射化合物1a-peg1000修飾物在進(jìn)入右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)近紅外二區(qū)檢測圖。

圖5為化合物1a-rgd修飾物的合成路線。

圖6上側(cè)為尾靜脈注射化合物1a-rgd修飾物在進(jìn)入右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)近紅外二區(qū)成像效果，下側(cè)為尾靜脈注射化合物1a-rgd修飾物和rgd的混合液在右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)近紅外二區(qū)成像效果，圖右側(cè)中間位置為亮度標(biāo)尺。

圖7為化合物1a納米粒的粒徑分布。

圖8為尾靜脈注射化合物1a納米粒進(jìn)入右前肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)近紅外二區(qū)腫瘤局部血管和小鼠全身血管成像效果。

圖9為通過小鼠前足注射化合物1a納米粒的正常小鼠前哨淋巴結(jié)成像以及化合物1a納米粒導(dǎo)航外科手術(shù)過程及手術(shù)前后評價的圖像，其中，時間順序依次為i、ii、iii、iv、v、vi。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，實(shí)施例里涉及的化合物1a,2a,3a,4a,5a等的具體結(jié)構(gòu)見附圖中的反應(yīng)式。

實(shí)施例1：化合物4a的制備

取化合物2a(5.48g，10mmol)、化合物3a(4.81g，10mmol)和碳酸鉀(3.45g，25mmol)加入500ml圓底燒瓶中，在氬氣保護(hù)下加入四氫呋喃-水(v/v，5:1)300ml，向反應(yīng)液中通入氬氣鼓泡5min排除體系內(nèi)氧氣，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物(0.9g，1mmol)，氬氣保護(hù)下在75℃油浴中加熱回流反應(yīng)14小時。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，旋蒸除去四氫呋喃，殘?jiān)鼜?fù)溶在200ml二氯甲烷中，水(50ml×3)洗三次，飽和食鹽水(50ml×3)洗三次。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥3小時，過濾，濾液旋干得7.4g化合物4a。收率：90％。

化合物4a結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)如下：

hrms(esi)calcdfor:c33h21brn5o10s3⁺([m+h]⁺):821.9634,found:821.9627.

實(shí)施例2：化合物5a的制備

取化合物4a(7.4g，9mmol)、化合物3a(4.329g，9mmol)和碳酸鉀(3.105g，22.5mmol)加入500ml圓底燒瓶中，在氬氣保護(hù)下加入四氫呋喃-水(v/v，5:1)270ml，向反應(yīng)液中通入氬氣鼓泡5min排除體系內(nèi)氧氣，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物(0.81g，0.9mmol)，氬氣保護(hù)下在75℃油浴中加熱回流反應(yīng)20小時。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，旋蒸除去四氫呋喃，殘?jiān)鼜?fù)溶在150ml二氯甲烷中，水(30ml×3)洗三次，飽和食鹽水(30ml×3)洗三次。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥3小時，過濾，濾液旋干得9.08g化合物5a。收率：92％。

化合物5a結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(dd,j＝8.4,1.7hz,2h),8.31(s,2h),7.92(t,j＝7.5hz,4h),7.83(d,j＝8.3hz,2h),7.76(s,2h),7.60(dd,j＝9.9,3.9hz,4h),2.65–2.54(m,8h),1.63(dd,j＝13.8,7.3hz,8h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ174.3,153.6,152.0,151.7,151.0,149.2,148.3,143.1,141.0,136.2,133.8,131.2,128.2,126.6,125.9,123.9,122.5,122.2,122.1,120.2,56.1,36.07,30.7.

hrms(esi)calcdfor:c52h37n6o16s3⁺([m+h]⁺):1097.1428,found:1097.1433.

實(shí)施例3：化合物1a的制備

取化合物5a(9.08g，8.28mmol)、鋅粉(64.915g，993.6mmol)和氯化銨(15.947g，298.08mmol)加入1000ml圓底燒瓶中，在氬氣保護(hù)下加入二氯甲烷300ml和甲醇-水(v/v，9:1)300ml混合溶劑，反應(yīng)液在25℃機(jī)械攪拌反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后硅藻土過濾除去不溶固體、加300ml二氯甲烷洗，收集濾液用水(100ml×3)洗三次，飽和碳酸氫鈉溶液(100ml×3)洗三次，飽和食鹽水(100ml×3)洗三次，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥3小時、過濾，除去溶劑得中間體。在250ml圓底燒瓶中氬氣保護(hù)下將中間體加入到160ml無水吡啶中，加入n-亞磺酰苯胺(9.09g，66.24mmol)和三甲基氯硅烷(7.13g，66.24mmol)，反應(yīng)混合液在80℃油浴中加熱反應(yīng)20小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入100ml冰水中，二氯甲烷(100ml×3)萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相用水(50ml×3)洗三次，飽和食鹽水(60ml×3)洗三次，無水硫酸鎂干燥。過濾除去硫酸鎂，濾液減壓濃縮，固體殘?jiān)^硅膠柱提純得7.23g化合物1a。兩步收率87％。

化合物1a結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.95(d,j＝2.5hz,2h),7.74(s,2h),7.68(s,2h),7.56(s,2h),7.50(d,j＝8.0hz,4h),6.69(d,j＝7.7hz,4h),2.58–2.45(m,4h),2.45–2.35(m,4h),1.69(dd,j＝10.1,5.3hz,8h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ175.3,152.7,151.6,151.2,149.2,148.4,143.6,138.7,135.6133.4,133.4,127.2,125.5,122.8,121.4,120.7,116.4,111.1,55.1,36.5,30.8.

hrms(esi)calcdfor:c52h41n6o8s4⁺([m+h]⁺):1005.1869,found:1005.1865.

實(shí)施例4：化合物1a-peg1000修飾物的制備及其腫瘤成像效果

取化合物1a(2mg，0.002mmol)、甲氧基聚乙二醇氨基(32mg，0.032mmol，m.w.～1000)加入5ml圓底燒瓶中，在氬氣保護(hù)下加入無水dmf1ml，攪拌使溶解，隨后加入hbtu(15mg，0.04mmol)和dipea(20μl)，反應(yīng)液在25℃攪拌反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后加乙醚沉淀，收集固體，固體復(fù)溶于去離子水中，通過半制備型高效液相色譜純化，凍干得產(chǎn)品?；衔?a-peg1000修飾物的結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)如下：maldi-tof-msexpectedm.w.～4930,measuredm.w.～4921。

通過尾靜脈注射含化合物1a-peg1000修飾物100μg的pbs溶液200μl進(jìn)入右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)，近紅外二區(qū)相機(jī)拍攝小鼠全身成像圖，參見圖4，腫瘤部位能夠和其他組織明顯區(qū)別，且成像時間快，10min左右腫瘤部位對探針有極高的攝取。本發(fā)明所述材料在快速診斷腫瘤方面具有較好的應(yīng)用前景。

實(shí)施例5：化合物1a-rgd修飾物的制備及其腫瘤成像效果

取化合物1a(4mg，0.004mmol)、c(rgdfk)(2.4mg，0.004mmol，m.w.～1000)加入5ml圓底燒瓶中，在氬氣保護(hù)下加入無水dmf1ml，攪拌使溶解，隨后加入hbtu(3mg，0.08mmol)和dipea(10μl)，反應(yīng)液在25℃攪拌反應(yīng)24小時。c(rgdfk)是一種多肽，英文名字cyclo(arg-gly-asp-d-phe-lys)，hbtu是苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽。反應(yīng)結(jié)束后加乙醚沉淀，收集固體，固體復(fù)溶于去離子水-乙腈(v/v，7:3)中，通過半制備型高效液相色譜純化，凍干得產(chǎn)品。化合物1a-rgd修飾物的結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)如下：maldi-tof-mscalcdfor:c72h79n15o14s4:1589.4814,found:1589.6691。

通過尾靜脈注射含化合物1a-rgd修飾物150μg的pbs溶液200μl進(jìn)入右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)，近紅外二區(qū)相機(jī)拍攝小鼠全身成像圖，參見圖6，腫瘤部位能夠和其他組織明顯區(qū)別。為探究上述制備的化合物1a-rgd修飾物對腫瘤的主動靶向性，于另一只右后肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠尾靜脈注射阻斷試劑c(rgdfk)500μg的pbs溶液200μl，半小時后于尾靜脈注射含化合物1a-rgd修飾物150μg的pbs溶液200μl，近紅外二區(qū)相機(jī)拍攝小鼠全身成像圖，參見圖6，腫瘤部位沒有熒光信號，阻斷成功，化合物1a-rgd修飾物對腫瘤的主動靶向性極好。本發(fā)明所述材料在特異性診斷腫瘤方面具有較好的應(yīng)用前景。

實(shí)施例6：化合物1a納米粒的制備及其血管和淋巴結(jié)成像效果

取化合物1a溶于四氫呋喃中制成濃度為0.1mg/ml的儲備液(a液)，取dspe-mpeg(5kda)溶于去離子水中制成濃度為1mg/ml的儲備液(b液)。dspe-mpeg是聚乙二醇修飾磷脂。在超聲下將a液緩慢滴入b液中，a液和b液按體積比1:9混合?；旌暇鶆蚝笤谑覝財嚢?小時，使之形成納米粒。氮吹除去四氫呋喃，離心濃縮得化合物1a納米粒。通過dls表征納米粒粒徑，大約為30～300nm，主要集中在50～150nm，參見圖7。

通過尾靜脈注射如上所述制作的含有熒光色素的納米粒150μl進(jìn)入右前肢接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)，近紅外二區(qū)相機(jī)拍攝小鼠腫瘤部位和全身血管成像圖，參見圖8，腫瘤局部血管和小鼠全身血管清晰可見。本發(fā)明所述材料在新生腫瘤和血管疾病診斷方面具有較好的應(yīng)用前景。

通過小鼠前足注射如上所述制作的含有熒光色素的納米粒100μl進(jìn)入正常小鼠體內(nèi)，近紅外二區(qū)相機(jī)拍攝前哨淋巴結(jié)成像圖以及通過近紅外熒光導(dǎo)航外科手術(shù)系統(tǒng)，切除小鼠前哨淋巴，具有非常好的識別效果，參見圖9。本發(fā)明所述材料可輔助外科手術(shù)，提高外科手術(shù)準(zhǔn)確度。