6)S20.5,28.6,28.8,35.2,40.8,126.1,128.0,128.7,128.7,130.4， 142.4.150.0. 151.0.158.7.168.8ppm；MS(ESI,m/z):344(M-H)-；Anal. calcd for C17H19N3O5 :C,59.12;H,5.55;N,12.17;Found:C,59.33;H,5.54;N,12.15·
[0085] 實施例15.化合物3.6的合成
[0086] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.6，表征數(shù)據(jù)如下：IR(f ilm)vmax: 2918，2849， 1747，1696，1537，1436，1334，1268，1188，1096cm-1;咕 NMR(400MHz，DMS0-d6)Sl·24-1·39 (m,2H),1.52-1.62(m,4H),2.23(s,3H),2.57(t,J=7.6Hz,2H),3.25-3.29(m,2H),7.14-7.19(m,3H),7.24-7.28(m,2H),8.27(br,lH),9.10(t,J=5.6Hz,lH),12.17(s,lH)ppm； 13C 匪R(100MHz，DMS0-d6)S20.5,26.2,28.9,31.0,35.5,40.9,126.1,128.1,128.7,128.7, 130.4.142.6.150.0. 151.0.158.7，168.8ppm;MS(ESI，m/z):358(M-H)-;Anal.calcd for C18H21N3O5 :C，60.16;H，5.89;N，11.69;Found:C，60.34;H，5.90;N，11.67·
[0087] 實施例16.化合物3.9的合成
[0088] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.9，表征數(shù)據(jù)如下：IR(f ilm)vmax: 2917，2849， 1738,1692,1673,1578,1537,1335,1268,1204〇11_1；^ NMR(400MHz ,DMS〇-d6)54.49(d ,J = 5.6Hz,2H) ,7.27-7.37(m,5H),8.38(d,J = 7.6Hz,lH) ,9.64(br,lH) ,12.28(s,lH)ppm；13C NMR(100MHz,DMS0-d6)544.5,127.5,127.6,127.8,128.7,128.9,138.7,150.4ppm；MS(ESI, m/z): 262(M-H)- ；Anal. calcd for C12H10FN3O3: C, 54.75 ；H, 3.83 ；N, 15.96 ；Found: C, 54.58 ； H,3.83；N,15.98.
[0089] 實施例17.化合物3.10的合成
[0090] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.10，表征數(shù)據(jù)如下：11?(^111>^^ 3275， 2917，2849，1731，1579，1536，1463，1273，1099cm-1;咕 NMR(400MHz，DMS0-d6)S2·84(t，J = 7·2Ηζ，2Η) ,3.50-3.54(m，2H) ,7.20-7.26(m，3H) ,7.31(t，J = 7.2Hz，2H)，8.38(d，J = 7.2Hz,lH),9.19(br,lH),12.26(s,lH)ppm；13C NMR(100MHz,DMS〇-d6)535.2,42.5,122.9, 123.3.126.8.128.9.129.1.139.2.140.0. 142.3.149.9.150.6.157.2.157.5ppm；MS(ESI, m/z) :276(M-H)_；Anal.calcd for C13H12FN3O3:C,56.32；H,4.36；N, 15.16；Found:C,56.49； H, 4.36；N,15.18.
[0091] 實施例18.化合物3.11的合成
[0092] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.11，表征數(shù)據(jù)如下：11?(^111)~^ :3320， 3077,2917,2849,1736,1578,1537,1334,1265,1211011^11^^(40010^,0150-(16)31.84- I. 87(m，2H)，2.62(t，J=7.6Hz，2H)，3.29-3.32(m，2H)，7.18-7.40(m，5H)，8.36-8.50(m, 1H),9.17-9.29(m，lH)，12.30(s，lH)ppm; 13C 匪R(100MHz，DMS0-d6)S35.2,40.8，123.0, 123.5,126.2,128.7,128.9,139.9,142.2,142.4,149.9,150.6,157.3,157.5ppm;MS(ESI， m/z): 290(M-H) -;Anal · calcd for C14H14FN3O3: C，57 · 73;H，4 · 84;N，14 · 43;Found: C，57 · 96; H，4.84;N,14.42.
[0093] 實施例19.化合物3.12的合成
[0094] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.12，表征數(shù)據(jù)如下：11?(^111>^^ 3297， 3082，2917，2849，1745，1694，1537，1336，1267，1200，1096cm- 1;咕 NMR(400MHz，DMS0-d6)S 1·53-1.60(m，4H)，2.59(t，J=7.6Hz，2H)，3.30-3.31(m，2H)，7.17-7.21(m，3H)，7.27(t，J = 6·8Ηζ，2Η)，8.37((1, J = 7.6Hz，lH)，9· 12(br，lH)，12.26(s，lH)ppm; 13C 匪R(100MHz， DMS0-d6)528.8,35.2,40.8,123.1,123.5,126.2,128.7,128.7,139.9,142.2,142.4, 149 · 9，150 · 6，157 · 3，157 · 6ppm;MS(ESI，m/z): 304(M-H)-;Anal · calcd for C15H16FN3O3: C， 59.01;H，5.28;N，13.76;Found:C，59.19;H，5.29;N，13.74.
[0095] 實施例20.化合物3.13的合成
[0096] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.13，表征數(shù)據(jù)如下：11?(^111)~^ :3300， 3083,2817,2849,2808,1724,1688,1536,1439,1337,1273,1097011^11^^(40010^,0150-d6)5l.28-1.35(m,2H),1.51-1.63(m,4H),2.57(t,J=8.0Hz,2H),3.24-3.29(m,2H),7.14-7.19(m,3H) ,7.24-7.28(m,2H) ,8.37(d ,J = 7.6Hz , 1H), 9.11 (t ,J = 5.6Hz , 1H), 12.25(s, lH)ppm;13C 匪R(100MHz，DMS0-d6)S26.3,28.9,31.0,35.5,40.9,123.1,123.5,126.1， 128.7,128.7,139.9,142.6,149.9,150.6,157.3,157.6ppm;MS(ESI，m/z):318(M-H)- ; Anal.calcd for Ci6Hi8FN3〇3：C,60.18；H,5.68；N,13.16；Found:C,60.18；H,5.68；N,13.16.
[0097] 實施例21.化合物3.14的合成
[0098] 如實施例1所述方法，制備得化合物3.14，表征數(shù)據(jù)如下：IR(f i lm) vmax: 2917， 2849，1745，1690，1578，1537，1389，1278，1028cm-1;咕 NMR(400MHz，DMS0-d6)Sl·30-1·36 (m,4H),1.47-1.60(m,4H),2.56(t,J=8.0Hz,2H),3.24-3.28(m,2H),7.14-7.19(m,3H), 7.24-7.28(m,2H),8.37(d,J = 7.6Hz,lH),9.12(t,J = 5.6Hz,lH),12.26(s,lH)ppm；13C NMR (100MHz,DMS0-d6)526.5,28.7,29.1,31.3,35.5,40.9,123.1,123.6,126.0,128.7,128.7, 139.9,142.2,142.7,149.9,150.7,157.3,157.6ppm ;MS(ESI，m/z):332(M-H)-;Anal.calcd for Ci7H2〇FN3〇3:C，61.25;H，6.05;N，12.61;Found:C，61.03;H，6.04;N，12.63·
[0099] 實施例22.內(nèi)源性大麻素水解酶高表達細胞株的建立
[0100] 構建攜帶完整NAAA或者FAAH基因的質(zhì)粒（pCDNA3 . 1 )，該質(zhì)粒帶有 Cytomegalovirus(CMV)啟動因子和Neomycin篩選基因，使用脂介質(zhì)轉(zhuǎn)入pCDNA3 · 1至HEK-293細胞內(nèi)，使用G418篩選和Western-blot檢測方法獲得穩(wěn)定且高表達NAAA或者FAAH的細 胞株。培養(yǎng)并收集HEK-293重組細胞，利用超聲破碎法和反復凍融法提取NAAA或者FAAH蛋 白，BCA法測定蛋白濃度后分裝凍存于-80°C冰箱待用。
[0101 ]實施例23.化合物的體外NAAA抑制活性測定方法
[0102] 將純化的NAAA蛋白（30mg，50mL)與濃度梯度的待篩選化合物（InM-lOmM溶解于 DMS0中，加入2mL)于37°C共同作用10分鐘后加入底物PEA(終濃度25mM，150mL)再反應30分 鐘。加入200mL含有l(wèi)nmol十七烷酸的甲醇液終止反應。保存于-20°C待HPLC-MS檢測。實驗過 程中同時設立DMS0陰性對照組和ARN077陽性對照組。附表1-附表4為部分化合物NAAA抑制 活性的半數(shù)抑制量
[0103] 實施例24.化合物的體外FAAH抑制活性測定方法
[0104] 將純化的FAAH蛋白（30mg，50mL)與濃度梯度的待篩選化合物（InM-lOmM溶解于 DMS0中，加入2mL)于37°C共同作用10分鐘后加入底物AEA(終濃度25mM，150mL)再反應30分 鐘。加入200mL含有l(wèi)nmol十七烷酸的甲醇液終止反應。保存于-20°C待HPLC-MS檢測。實驗過 程中同時設立DMS0陰性對照組和ARN077陽性對照組。附表1-附表4為部分化合物FAAH抑制 活性的半數(shù)抑制量。
[0105] 實施例25.酶抑制活性測定中的HPLC-MS方法
[0106] 以HPLC/MS作為分析儀器對PEA或AEA水平進行檢測，使用Z0RBAX Eclipse XDB-C18柱(4 · 6x 50mm，1 · 8mm，安捷倫，美國）進行分析。用95 %流動相A和5 %流動相B以0 · 6mL/ min流速洗脫(流動相A為色譜甲醇，流動相B為水，都含有0.25%醋酸和5mM醋酸銨），質(zhì)子源 為ESI-，17:0脂肪酸作為內(nèi)標(m/z = 269)定量，測定化合物對NAAA或FAAH抑制的半數(shù)抑制 濃度IC50。
[0107] 實施例26.細胞內(nèi)內(nèi)源性大麻素含量的HPLC-MS測定方法
[0108] 細胞收集后加入內(nèi)標用超聲破碎，測定細胞蛋白含量，再用氯仿萃取純化后，PEA 用LC/MS/MS分析，使用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 X 150mm，5mm，安捷倫，美國）。流動 相A為甲醇，流動相B為水(從85 %流動相A到100 %流動相A梯度洗脫5分鐘，維持100 %流動 相A洗脫10分鐘），流速為lmL/min。離子源為APCI+，結(jié)果用細胞內(nèi)PEA或AEA的含量平衡到蛋 白濃度。
[0109] 實施例27.LPS誘導的Raw264.7細胞炎癥模型評價化合物抗炎活性
[0110] LPS(500ng/mL)處理Raw264.7巨噬細胞2小時，誘發(fā)細胞炎癥反應后，使用上述待 評價化合物以上述實驗獲得的有效濃度處理細胞2、4、6、8小時后，測定NAAA、FAAH活性及細 胞內(nèi)PEA、AEA水平。以DMS0為陰性對照，ARN077為陽性對照。
[0111] 如圖1所示，實驗結(jié)果表明，化合物2.6和2.11都可以有效的抑制炎癥因子iNOS和 IL-6的mRNA表達。
[0112] 實施例28.動物實驗的中組織及血液收集
[0113]分別搜集小鼠腹腔注射受試化合物（l-3mg/kg)或溶劑10min、30min、