02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0108] 本實(shí)施例制備的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/細(xì)胞株（CHO-PKAcat-EGFP/OPRK)，于2014 年3月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 9002,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所， 100101。
[0109] 與轉(zhuǎn)染前相比，建立獲得的細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定。
[0110] 本實(shí)施例制備的細(xì)胞系可作為篩選阿片受體激動(dòng)劑或者評(píng)價(jià)化合物或組合物對(duì) 阿片受體激動(dòng)活性及細(xì)胞毒性的細(xì)胞模型。
[0111] 下面的實(shí)施例中，如果沒(méi)有特別說(shuō)明，使用的細(xì)胞/細(xì)胞株為本實(shí)施例構(gòu)建的細(xì) 胞/細(xì)胞株。
[0112] 實(shí)施例2 :中國(guó)合鼠卵巢細(xì)朐（CHO-PKAcat-EGFP/OPRK)的鑒定
[0113] 利用激動(dòng)劑U50488處理實(shí)施例1制備的細(xì)胞株，激活0PRK，與forskolin共同作 用誘導(dǎo)PKAcat-EGFP發(fā)生重分布現(xiàn)象。所建立的細(xì)胞株中的人κ阿片受體與其特異性配 體U50488結(jié)合后受體活化，對(duì)AC的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響了cAMP的濃度，與forskolin 共同作用后發(fā)生PKAcat-EGFP重分布。
[0115] 為了定量檢測(cè)U50488誘導(dǎo)PKAcat-EGFP的重分布程度，本實(shí)施例采用In CellAnalyzer1000 或InCellAnalyzer2000 獲取PKAcat-EGFP的重分布的細(xì)胞圖 像，用多革G點(diǎn)分析模塊（MultiTargetAnalysis)分析得到的細(xì)胞圖像，以顆粒形成指 數(shù)表示PKAcat-EGFP的重分布程度。顆粒形成指數(shù)等于每孔（Intensity-Background Intensity)XTotalArea。具體步驟如下：
[0116] 1)將細(xì)胞接種于黑色透底的96孔培養(yǎng)板，37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時(shí)。
[0117] 2)用無(wú)血清的F12培養(yǎng)基（以下稱(chēng)細(xì)胞分析液）洗滌細(xì)胞1次，100μL/孔。此 后，加入100μL/孔的細(xì)胞分析液。
[0118] 3)加入含有U50488的細(xì)胞分析液，50μL/孔，使U50488的終濃度為100nmol/L， 于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
[0119] 4)加入含有forskolin的細(xì)胞分析液，50μL/孔，使forskolin的終濃度為 10μmol/L，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。
[0120] 5)用1XPBS溶液稀釋的12%甲醛溶液固定細(xì)胞，100μL/孔，室溫避光放置20分 鐘。
[0121] 6)棄液，加入含有hoechst33342的1XPBS溶液，100μL7孔，室溫避光放置30分 鐘。
[0122] 7)利用InCellAnalyzerlOOO獲取細(xì)胞圖像，用多革巴點(diǎn)分析模塊（MultiTarget Analysis)分析PKAcat-EGFP的重分布程度。
[0123]CH〇-PKAcat-EGFP和CH0-PKAcat-EGFP/0PRK兩種的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程完全一致，均 加入了forskolin。
[0124] 如果如圖1A和圖1B所示。
[0125] 由結(jié)果可見(jiàn)，在濃度為100nmol/L的U50488作用下，與沒(méi)有表達(dá)人0PRK的 CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞相比，表達(dá)人 0PRK的CHO-PKAcat-EGFP/OPRK細(xì)胞中的PKAcat-EGFP 發(fā)生了顯著的重分布（圖1，A-B)。
[0126] 另外，由于CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)人0PRK，因此不會(huì)對(duì)U50488有反應(yīng)，僅 對(duì)forskolin有反應(yīng)，AC被激活，最終表現(xiàn)為顆粒的減少。
[0127]實(shí)施例3 :U50488誘導(dǎo)PKAcat-EGFP重分布的半數(shù)有效濃度的測(cè)定
[0128]在[35S]GTPyS結(jié)合實(shí)驗(yàn)中U50488的EC5。= 3. lnM(Zhu J，Luo LY，Li JG. Activation of the cloned human kappa opioid receptor by agonists enhances [35S] GTPgammaS binding to membranes : determination of potencies and efficacies of ligands[J]· J Pharmacol Exp Ther，1997, 282(2) :676-84)。
[0129] 步驟如下：
[0130] 1)將實(shí)施例1制備的細(xì)胞制成1X105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于黑色透底96孔 培養(yǎng)板，100μL/孔。
[0131] 2)于37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0132] 3)用細(xì)胞分析液洗滌細(xì)胞1次，100μL/孔；棄液，再加入100μL/孔的細(xì)胞分析 液。
[0133]4)加入細(xì)胞分析液稀釋的U50488,使其終濃度分別為5. 1 X 1011、1. 5/101Q、 4. 6X10 10、1· 4X10 9、4· 1X10 9、1· 2X10 s、3. 7 X 10 8、1· 1X10 7、3· 3X10 7、1· 0X10 6mol/ L，37°C，5% C02,95%濕度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
[0134]5)加入含有forskolin的細(xì)胞分析液，使其終濃度為ΙΟμ mol/L，于37°C，5%C02， 95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。
[0135] 6)加入細(xì)胞固定液，100μL/孔，輕微振動(dòng)培養(yǎng)板混勻，室溫避光放置20分鐘。
[0136] 7)棄液，加入含有hoechst33342的1XPBS溶液，100μL7孔，室溫避光放置30分 鐘。
[0137] 8)利用InCellAnalyzer2000獲取細(xì)胞圖像，用多靶點(diǎn)分析模塊分析 PKAcat-EGFP的重分布程度。
[0138] 結(jié)果如圖2A- 2K所示。
[0139] 如圖2A- 2J所示，當(dāng)U50488的濃度為lnmol/L時(shí)，PKAcat-EGFP融合蛋白開(kāi)始 發(fā)生重分布現(xiàn)象。當(dāng)U50488的濃度為500nmol/L時(shí)，PKAcat-EGFP融合蛋白重分布程度 達(dá)到最大。通過(guò)GraphPadPrism5 軟件Nonlinearregression(curvefit)擬合 "S" 型曲 線(xiàn)（圖2K)，得到U50488激活CHO-PKAcat-EGFP/OPRK細(xì)胞中的0PRK受體而誘導(dǎo)融合蛋白 PKAcat-EGFP發(fā)生重分布的半數(shù)有效濃度（EC5。），其值為3. 563±0. 902nmol/L。
[0140]實(shí)施例4 :U50488對(duì)CH0細(xì)朐毒件的測(cè)定
[0141] 步驟如下：
[0142] 1)將細(xì)胞接種于黑色透底的96孔培養(yǎng)板，37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時(shí)。
[0143] 2)用無(wú)血清的F12培養(yǎng)基（以下稱(chēng)細(xì)胞分析液）洗滌細(xì)胞1次，100μL/孔。此 后，加入100μL/孔的細(xì)胞分析液。
[0144] 3)加入含有U50488的細(xì)胞分析液，50μL/孔，使U50488的終濃度為100nmol/L， 于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
[0145] 4)給藥結(jié)束前0. 5小時(shí)加入含有h〇eChst33342的細(xì)胞分析液，50μL/孔，使終濃 度為100nm〇l/L，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
[0146] 5)用1XPBS溶液稀釋的12%甲醛溶液固定細(xì)胞，100μL/孔，室溫避光放置20分 鐘。
[0147] 6)棄液，加入 1XPBS溶液，200μ!7 孔。
[0148] 7)利用InCellAnalyzerlOOO獲取細(xì)胞圖像，用多革巴點(diǎn)分析模塊（MultiTarget Analysis)分析U504884對(duì)CH0細(xì)胞毒性作用。
[0149] 在濃度為100nmol/L的U50488作用下，U50488對(duì)CH0細(xì)胞無(wú)毒性作用（圖3)。
[0150] 實(shí)施例5 :CH0-PKAcat-EGFP/0PRK細(xì)朐樽型可靠件評(píng)價(jià)
[0151] 本實(shí)施例采用Z'因子來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)施例1新建細(xì)胞模型的可靠性。Z'因子作為評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)體系可靠性的重要參數(shù)，在評(píng)價(jià)高通量篩選、高內(nèi)涵分析實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性 中得到廣泛應(yīng)用。Z'因子的計(jì)算公式如下：
[0153]其中，〇 為標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation); μ為平均值（meansignal) ;C+為陽(yáng)性 對(duì)照（pisitivecontrol) ;C_ 為陰性對(duì)照（negativecontrol)。
[0154]Z'因子的值在0~1之間。當(dāng)Z'因子的值為0時(shí)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)體系不成立。當(dāng) 0.5>Z'>0時(shí)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定性差，不可靠。當(dāng)1>Z' >0.5,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定性好，可 靠性很好。若Z'因子的值為1，這是陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)差為0,表示一種理想的 實(shí)驗(yàn)體系（Ji_HuZhang，ThomasD.Y.ChungandKevinR.Oldenburg.ASimpleStatistical ParameterforUseinEvaluationandValidationofHighThroughputScreening Assays[J] ·JBiomolScreen. 1999. 4 :67) 〇
[0155] 評(píng)價(jià)本發(fā)明所建立實(shí)驗(yàn)體系可靠性的步驟如下：
[0156] 1)將細(xì)胞制成1X105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于黑色透底96孔培養(yǎng)板，100μL/ 孔，于37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0157] 2)用細(xì)胞分析液洗滌細(xì)胞1次，100μL/孔；棄液，再加入100μL/孔的細(xì)胞分析 液。
[0158] 3)加入細(xì)胞分析液稀釋的U50488,使其終濃度為100nm〇l/L，設(shè)加入不含U50488 的細(xì)胞分析液為對(duì)照，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。
[0159] 4)加入含有forskolin的細(xì)胞分析液，50μL/孔，使forskolin的終濃度為 10μmol/L，于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。
[0160] 5)加入細(xì)胞固定液，100μL/孔，輕微振動(dòng)培養(yǎng)板混勻，室溫避光放置20分鐘。
[0161] 6)棄液，加入含有hoechst33342的1XPBS溶液，100μL7孔，室溫避光放置30分 鐘。
[0162] 7)利用InCellAnalyzer2000獲取細(xì)胞圖像，用多靶點(diǎn)分析模塊分析 PKAcat-EGFP的重分布程度，計(jì)算Z'因子的值。
[0163] 本發(fā)明所建立的篩選體系，用lOOnmol/L的U50488作用時(shí)，Z'值平均為0. 596(圖 4)。
[0164] 結(jié)果表明，本發(fā)明的細(xì)胞作為篩選阿片受體激動(dòng)劑或者評(píng)價(jià)化合物或組合物對(duì)阿 片受體的激動(dòng)活性的細(xì)胞模型是非常可靠的，很可行的。
[0165]實(shí)施例6 :U50488處理細(xì)朐的時(shí)間對(duì)PKAcat-EGFP重分布的影響
[0166] 步驟如下：
[0167] 1)將實(shí)施例1制備的細(xì)胞制成IX105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于黑色透底的96 孔培養(yǎng)板，100μL/孔，于37°C，5%C02,95%濕度培養(yǎng)箱中